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植物原位杂交

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植物原位杂交

植物RNA 原位杂交⽅法

⼀、制⽚1. 材料的固定和包埋

固定液：FAA: 10%甲醛，5%冰醋酸，50%⼄醇（均为RNase-free, DEPC ⽔配制）Day 1:

取植物材料，茎尖或花原基（如花原基，不要剥除最外层苞⽚），⽴即放⼊FAA，抽真

空15min，缓慢放⽓，换⼀次固定液，4℃过夜。Day 2:

脱⽔：50%⼄醇30min

50%⼄醇60min

60%⼄醇60min

70%⼄醇60min 组织块可在70%⼄醇中4℃保存达⼏个⽉

Day 3:

85%⼄醇60min

95%⼄醇60min

100%⼄醇30min

100%⼄醇30min

100%⼄醇60min

25%⼆甲苯+75%⼄醇60min 以下有⼆甲苯，在通风橱中操作

50%⼆甲苯+50%⼄醇60min

75%⼆甲苯+25%⼄醇60min

100%⼆甲苯60min

100%⼆甲苯60min

100%⼆甲苯60min 组织透明，也可两次100%⼆甲苯，第⼆次⾄组织透明为⽌

50%⼆甲苯+50%⽯蜡58℃过夜

Day 4:

换两次100%⽯蜡（58℃），倾倒时避免产⽣起泡Day 5:

换两次100%⽯蜡（58℃），倾倒时避免产⽣起泡Day 6:

换两次100%⽯蜡（58℃），倾倒时避免产⽣起泡

⽤⼲净较硬的纸（如打印纸）折好纸盒，薄的可双层折。

包埋。2. 杂交探针的制备

1）将要转录的DNA(通常50-300bp，⽆polyA 尾)克隆在PGEM T-easy vector 上，摇菌，提质粒，送样测序，确定⽬的⽚段的连⼊⽅向（以T7 或者SP6 引物测序出的连⼊⽅向，即是⽤T7 或是SP6 转录酶转录出的sense 探针的⽅向。例如，某⽚段T7引物的测序结果是反向连⼊，则⽤T7 转录出的探针是antisense,才是正确探针）2）⽤T7，SP6 引物从质粒上将⽬的⽚段扩增出来（⼤体积扩增，通常200-400ul）。若产物

⼲净则可直接回收，不⼲净切胶回收。回收⽤RNase-free 的管⼦，NFW ⽔溶解（30-40ul, 浓度>200ng/ul）3）⽤回收产物转录

T7:

DNA 300-500ng

10×T7 buffer 1ul

10×labeling mix 1ul

Inhibitor 0.5ul37℃1hr

T7 polymerase 1ul

DTT 1ul

NFW 补⾜10ul

SP6:

DNA 300-500ng

10×SP6 buffer 1ul

10×labeling mix 1ul

Inhibitor 0.5ul40℃1hr

Sp6 polymerase 1ul

1%BSA 1ul

NFW 补⾜10ul

DNase 消化:

转录产物10ul10×buffer 6ul37℃15min DNase I 3ul

NFW 补⾜60ul

沉淀：

消化产物60ul4M LiCl 7.5ul

0.2M EDTA(可灭活酶活) 7.5ul

100%⼄醇225ul

/总体积300ul -80℃过夜

4℃，12000rpm, 20min 去上清

75%⼄醇洗，4℃，7500rpm 5min

同上，再洗⼀次冰上开盖，晾⼲30ul NFW 溶解，沉淀前、后分别取1-2ul 电泳

4）探针定量

1 将合成的探针和对照各取1ul 点到Nylon membrane 上

2 UV-cross linker(2400)

3 将膜放到2ml 冻存管中

4 2ml Washing buffer 2min

5 2ml Blocking solution 30min

6 2ml Antibody solution 30min

7 2ml Washing buffer 15min

8 2ml Washing buffer 15min

9 2ml Detection buffer 2-5min

10 2ml Detection buffer+20ulNBT/BCIP（2:1）锡箔纸包裹冻存管，5min 看⼀次探针定量所需试剂：

3. 切⽚

将已⽤⽯蜡包埋好的植物材料修成梯形，切成8um 厚的蜡带材料（尽量少带⽯蜡，

但不能过少，因为材料周围的⽯蜡太少，则容易切断，不易形成蜡条，⽽且梯形要规整，否则蜡带会绕圈，不⽅便展⽚）。按顺序摆放，正⾯朝上。

在解剖镜下⽤暗视野观察蜡带，以决定取舍。

在聚赖氨酸化的载玻⽚（Fisher）上⾯铺满DEPC ⽔，然后挑选合适的蜡带⼩⼼地

放在⽔⾯上（可在⼀张⽚上摆上从⼤到⼩不同时期）（注意正反⾯）,蜡带完全展开后（42℃烫板上数分钟⾄⼏⼗分钟不等，注意观察以免展过，以组织不开裂为度），⽤⼀张镜头纸轻轻压在蜡带上，然后⽤吸⽔纸（枪头）吸掉载玻⽚上多余的⽔，使材料与

载玻⽚之间⽆⽔存在，置于42℃烫板上烘烤⼲燥36-48hr 后备⽤，制好的⽚⼦最好在⼀星期内进⾏杂交）

⼆、⽚⼦预处理1. Deparaffine and rehydration

100% xylene ⼆甲苯20min——100% xylene 20min——75% xylene+25% ethanol 2min ——25% xylene+75% ethanol——100% ethanol——95% ethanol——80% ethanol——60%

ethanol——30% ethanol——DEPC H2O( each step 2 min after the 1st and 2nd steps)

2. 0.25M HCl 20min (862ul HCl→40ml H2O)

3. DEPC-H2O 5min

4. 2×SSC 20min

5. DEPC-H2O 5min

6. Proteinase K: Proteinase K buffer (37℃pre-warmed,40ml) + Proteinase K (8ul,

20mg/ml) 37℃,30min

K buffer: 32ml DEPC-H2O + 4ml 1M Tris-HCl pH7.5 + 4ml 0.5M EDTA pH7.5

7. RT, 1×PBS, 2min

8. RT, 0.2% glycine in 1×PBS, 2min (0.08g glycine 现称in 40ml 1×PBS)

9. RT, 1×PBS, 2×2min

10. RT, 4% formaldehyde, 10min( (4.3ml 甲醛溶液（浓度37%-40%）+35.7ml 1×PBS)

11. RT, 1×PBS, 2×5min

12. To reduce background: (现⽤现加）

0.1M triethanolamine pH8.0(三⼄醇胺,不调pH)with 0.5% acetic anhydride（⼄酸

酐）,with constant stirring.Add 536ul triethanolamine +160ul HCl pH8.0(不调pH),and 200ul acetic anhydide

in 40ml PBS and immediately add slides. Incubate at RT for 5min.

13. RT, 1×PBS, 2×5min

三、杂交1.杂交体系

每张⽚⼦⼤约⽤100-150ul 杂交液，杂交液由A 和B 组成，⽐例为150ul 杂交液由115.8ul 杂交液A 加34.2ul 杂交液B 组成

杂交液A 15.44ml: 10ml 去离⼦甲酰胺2ml 50% dextran sulfate (1g 溶于2ml formamide)

2ml 10×blocking solution

1.2ml 5M NaCl

0.2ml 1M Tris-HCl pH7.5

0.04ml 0.5M EDTA pH7.5

杂交液B 34.2ul: 2.2ul tRNA32ul probe+DEPC-H2O

杂交液B 80℃5min 变性后⽴即放置冰上5min2.杂交

⽤parafilm 膜或者盖玻⽚轻轻覆盖预处理后的⽚⼦，42℃（42℃-50℃）在湿室中杂交

过夜（湿室中垫有⽤0.3M NaCl-2×SSC-50%甲酰胺饱和的吸⽔纸，放在⼀个⼤平⽫中，每⽫需要50ml)

四、冲洗1. 准备冲洗缓冲液2×SSC，50%甲酰胺（国产），准备2 次⽤量

20×SSC 50ml 5ml 4ml 8ml

甲酰胺（国产）250ml 25ml 20ml 40mlDEPC-H2O 200ml 20ml 16ml 32ml

总体积500ml(⼤）50ml（⼩）40ml 80ml20×SSC (pH7.0) 1L: NaCl 173.5g

Na3citrate 柠檬酸钠88.2g

2. 染缸中加⼊冲洗缓冲液，放⼊载玻⽚，50℃⽔浴中温育30min（此时盖玻⽚会落下）

3. 在冲洗过程中准备NTE 溶液，准备5 次⽤量。

5×NTE (pH7.5) 1L: NaCl 146.1g

Tris 6.05g

EDTA 1.86g

5 次

6 次

5×NTE 500ml 60ml

DEPC-H2O 2000ml 240ml

总体积2500ml(⼤）300ml(⼩染缸）4. ⽤NTE 溶液，在37℃⽔浴中冲洗两次，每次5min

5. 准备RNA 酶A 溶液（20ug/ml),将载玻⽚放⼊溶液中37℃⽔浴温育30min

RNA 酶A 储备液10mg/ml 1ml 0.1ml

NTE 溶液500ml(⼤染缸）50ml(⼩染缸）

注：（1）RNA 酶A 溶液应提前放⼊37℃⽔浴中预热5min(2) 加⼊RNA 酶以后各步使⽤蒸馏⽔即可

（3）加⼊RNA 酶A 之前和之后使⽤的玻璃缸⼀定要分开放置，切勿混⽤！

（4）加⼊RNA 酶A 之前使⽤的玻璃缸，每次⽤完后冲洗⼲净，加⼊部分100%⼄醇

溶液，下次使⽤在通风橱中吹⼲即可。6. 准备溶液：

1）1×SSC：

20×SSC 25ml 2.5ml 2ml

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植物(拟南芥水稻)原位杂交详细protocol试验方法

植物(拟南芥水稻)原位杂交详细protocol试验方法

1 植物材料的固定、包埋和制片

一、 植物材料的固定和包埋

在此过程应注意避免Rnase的污染。所使用的熔蜡管（管盖不能耐受180℃烘，只需高压湿热灭菌即可）、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。所用蒸馏水无需用DEPC处理。所固定的材料越小越好，尽可能切除多余的材料。材料取下后应立即固定。取材后若不能立即固定，则应置于冰上运输。配试剂前请计算一下所需用量，用多少配多少，节约试剂。

第一天

一、配制甲醛溶液（以300 ml量为例）

1、 先打开一个60℃左右的水浴锅。

2、 在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。

3、 用量筒配300 ml PBS缓冲液（30 ml 10×PBS+270 ml水），另加1粒NaOH，盖好锡箔纸后，轻轻摇动，稍微溶化后置于水浴锅中溶解。

4、 完全溶解后，取出，加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀（包埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛）。

5、 置于冰上或4℃冰箱降至室温，然后用硫酸调pH 至7.0。

6、 把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中，（一般用10 ml的小瓶）。

7、 分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。

二、固定材料

1、 取植物新鲜材料，去除不需要的部分至适当大小。注意：所固定的材料越小越好，尽可能去除无用多余的部分。

2、 把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。注意每瓶中的切块数：太多固定不好；太少则浪费固定液（固定液:材料≥20:1）。

3、 材料放入固定液后，应通过抽真空（1至数分钟，视具体情况而定：尽可能短时间，以材料沉入固定液中为准），帮助固定液进入组织中，以达到迅速固定植物材料的目的。抽气减压时，尽量不要使液体过分沸腾。抽真空时，材料一般在固定液中浮起；抽完真空的材料应该沉入固定液中，有时可能要反复多次抽真空，直至材料沉没在固定液中。一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见，如果此情况发生，建议抽真空达10分钟后，继续做步骤4。

原位杂交

原位杂交

小鼠胚胎切片原位杂交

（一）主要试剂及配制方法：

a) 原位杂交用10×PBS储存液（0.5 L体积配方）：向1L烧杯中依次加入29.22 g

NaCl ，13.86 g Na2HPO4·12H2O 和1.763 g NaH2PO4·2H2O，然后加入400mL ddH2O充分搅拌溶解，用固体NaOH将pH调节至7.4，然后加入ddH2O定容至0.5 L，最后各组分终浓度为NaCl=1.3mol/L，Na2HPO4=70mmol/L，NaH2PO4=30mmol/L，高压灭菌后室温保存备用；

b) 1×PBS工作液：将10×PBS储存液用灭菌水稀释10倍即可；

c) 10×甘氨酸溶液：称取甘氨酸10g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。使用时用PBS将10×甘氨酸储备液稀释为工作液（1.0mg/mL)；

d) 5M NaCl：在800ml水中溶解292.2g NaCl，加水定容至1L，高压灭菌后室温保存备用；

e) 1M Tris-HCl ( pH7.5 ，pH9.5)：在800ml水中溶解121.91g Tris碱,加入浓HCl调节pH值至所需值（应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值），然后加水定容至1L，最后高压灭菌，室温保存备用；

f) 1M MgCl2 ：在800ml水中溶解203.4g MgCl2·6H2O，用水定容至1L，高压灭菌，室温保存备用；

g) 20%（W/V)SDS：20 g SDS溶解于80 mL ddH2O中，加热到68 C溶解，加热的同时用玻璃棒搅拌助溶，用浓盐酸调节pH值到7.2，加水至100 mL，高温高压灭菌，室温保存备用；

h) 3%过氧化氢溶液：用于组织脱除血色，也可起到一定RNase抑制剂效果，使用时将H2O2原液（30%）用ddH2O稀释10倍即可使用；

i) 2 μg/mL Proteinase K/PBS：使用时配制，将Proteinase K (20mg/mL，-20 C冷冻保存）用PBS稀释10000倍使用；

EBER原位杂交过程

EBER原位杂交过程

预先准备的试剂

胃酶浓缩液：将胃酶中加入4毫升的蒸馏水或去离子水，充分溶解后可根据使用量分装，冻存（-20℃）。

胃酶稀释液：石蜡切片：将试剂瓶中的1N HCl用蒸馏水或去离子水10倍稀释，即成0.1N HCl溶液

PBS配制：将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水，彻底溶解后加入Tween 20 5滴，混匀后使用。

DAB工作液配制：在1毫升5A中加入50微升的5B，临用前配制，未用完的液体应弃去。也可按照上述比例，根据实际需要量配制。

胃酶消化工作液的配制

每1cm2的切片按照300-400微升准备胃酶消化工作液，必须现用现配，未用完的胃酶工作液应弃去。

石蜡切片：将上述已分装好的胃酶浓缩液用已稀释至0.1N的HCl溶液100倍稀释，例如可将15微升的分装胃酶浓缩液加入到1.5ml的0.1N HCl溶液中，混匀后备用。

所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行，避免试剂蒸发。一旦杂交程序开始，玻片不能干燥。

样品的收集和预处理

石蜡切片：

常规福尔马林缓冲液固定，时间不宜超过12小时。石蜡包埋的温度不宜超过65℃。4-6微米的石蜡切片，56-60℃烤片2-16小时。处理好的切片可以立即使用，也可放置于室温条件下保存（至少可保存3个月以上）。在做原位杂交之前，切片需经新鲜二甲苯脱蜡（10分钟×2）。脱蜡后的切片在新鲜100%乙醇中放置5分钟后，经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。

酶处理（避免RNA酶污染，带手套操作）

将切片放置于37℃中，每张切片加入300-400微升新鲜配制的胃酶工作液孵育。石蜡切片孵育30分钟。弃去胃酶工作液后，逐级酒精脱水（70%、95%和100%），每个梯度放置1分钟。空气干燥后杂交。

杂交程序（避免RNA酶污染，带手套操作）

杂交：

混匀探针溶液，在每张切片上加10-20微升适量的探针（试剂3），加盖盖玻片（注意防止气泡！）。湿盒中37℃孵育2小时，杂交过夜效果更好。

植物组织原位杂交FISH固定-包埋-切片

植物组织原位杂交FISH固定-包埋-切片

为保证材料中RNA的完整性，必须尽量避免RNase污染，因此，应选用DEPC水或RNase-free水配制的试剂及RNase-free耗材。

1、 取样：将装有2/3体积卡诺固定液（乙醇：冰醋酸=3:1）的小瓶置于冰上，选取所需组织材料，离体后立即将组织快速浸入含有固定液的小瓶中固定；必须保证材料没有气泡。换新鲜固定液，4℃放置 5 个小时后，将材料置于 70%乙醇中，4℃保存。

2、 载玻片处理：

A. 将载玻片用洗涤剂清洗后清水冲净；

B. 室温下将上步清洗干净的载玻片放于 1mol/L 盐酸中浸泡 30min；

C. 用蒸馏水清洗载玻片；

D. 室温下将上步清洗干净的载玻片放于 100%乙醇中浸泡 1h；

E. 取出后室温晾干；

F. 0.01%多聚赖氨酸涂抹玻片正面（带磨砂一面）后晾干备用。

3、 清洗：倒掉固定液，用 DEPC 水配制的 0.1 mol/L，pH7.0 的 PBS（磷酸缓冲液）清洗样品三次，每次 15 min。

4、 脱水：提前准备 DEPC 水，无水乙醇，DEPC 处理的 1 ml 枪头（烘干），镊子和新的小瓶（RNase free），冰浴；用 DEPC 水配制的浓度梯度乙醇进行脱水，依次经过：30%、50%、70%、85%、95%、100%、100%，每次脱水 2 小时。

5、 二甲苯透明：提前准备用 DEPC 处理的 1ml 枪头，镊子（RNase free），冰浴，二甲苯，烘箱；将脱水材料依次经过：3/4 酒精+1/4 二甲苯、1/2 酒精+1/2 二甲苯、1/4 酒精+3/4

二甲苯、纯二甲苯、纯二甲苯，每个梯度 2 小时。

6、 浸蜡：将石蜡（约 56-58 ℃，硬度适中）熔化，在 60 ℃烘箱中按以下梯度进行浸蜡：3/4 二甲苯+1/4 熔蜡、1/2 二甲苯+1/2 熔蜡、1/4 二甲苯+3/4 熔蜡、换纯蜡、换纯蜡、换纯蜡，渗蜡每梯度 4 小时，使二甲苯充分蒸发。