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原位杂交 DIG

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原位核酸分子杂交技术

原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization

of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。

原位核酸分子杂交技术的发展 第一节

原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其 BuongiornoNardelli卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。Orth(1970)3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂 交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA 性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等特点，因此研究用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交，引起了许多学者的重视和探索。Bauman(1981)等首先应用荧光素标

4，二Shroyer(1982)报道用2记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂交

信号。Brigat(1983)首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA，通过生物素DNA在细胞中的定位，生物 素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。Boeringer

Mannhem Biochemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场，和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶显色系统)，有较好的反差背景，更有利于与免疫组织化学相结合，同时可以检测基因表达。核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸

性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核甘酸探针等。DNA探针还有单链DNA(Single stranded,ssDNA)和双链DNA(Double stranded,dsDNA)之分。所以原位

RNA,RNARNA和寡核苷酸探针与DNAcDNA或RNA等杂交方式。杂交可分为DNADNA，原位杂交技术在生命科学的研究中可视为一顶革命性的技术。它使我们的研究从器官、组织

和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展.

第二节

原位杂交技术的基本方法包括：①杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何

增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；②杂交；③杂交后处理；④显示(visualization

)

(一)

的水平；RNA或DNA最大限度地保存细胞内的原位杂交固定的目的是为了保持细胞形态结构，

使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA更易被酶降解，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA

1生广泛的交叉连接，不会影响探针穿透

2Bouin′s

3mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1~2 h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4

44%多聚甲醛约10 min，空气干 燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃切片可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材时多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交联的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低mRNA的含量。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获满意效果。各种固定剂均有各自的优缺点，如沉淀性(Precipitating)固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin′s液、Carnoy′s液等能为增加核

酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存RNA，而且对组织结构有损伤。

戊二醛较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交联，从而大大地

(二)

1

玻片包括盖片和载玻片应用热肥皂水刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24 h，清

水洗净烘干，95%酒精中浸泡24 h后蒸馏水冲洗、烘干、烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA

要应用粘附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致

赖氨酸液具

有较好的粘附效果，但价格昂贵。一种新的粘附剂APES粘附效果好，价格较多聚赖氨酸便宜，

2

增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂(detergent)或称清洗剂Triton X100、酒精或某些消化酶如蛋白酶K，胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。这种广泛的去蛋白作用无凝可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间K(Proteinase K)的消化作用的浓度及孵育时间视组织种类、应用 01 mol/L Tris/50 1μg/ml(于mmol/L 固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用蛋白酶K

EDTA,pH8.0缓冲液中)，37℃孵育15~20 min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。甘氨 01 mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的酸是蛋白酶K的抑制剂，常用 0用1 N HCl报道应用胃蛋白酶(Pepsin)20~100 μg/ml(Burns消化作用，等(1987)配)37℃、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。为保持组织结构，通常用4%多聚

3

背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后(Posthybridization)的酶处理和杂交后的洗涤

(t

和三乙醇胺(acetic anhydride)均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐．

riethanolamine)

预杂交(Prehybridizaiton)是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于

前者不含探针和硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非

在杂交后洗涤中采用低浓度的RNA酶溶液(20 μg/ml)洗涤一次，以减低残留的内源性的RNA

4RNA

由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个

杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温(240

℃)烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必需在150

(Hybridsation) )杂交(三杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片

，加盖片防止孵育过程中杂交液的蒸发。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。硅

化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻

片自身有一定重量能使有限的杂交液均匀覆盖。可将复有硅化盖

玻片进行杂交的载玻片放在盛有少量5×SSC或2×SSC(standard saline citrate,SSC)溶液

(Post hybridisation treatment)杂交后处理 (四)杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。特别因为大多数的原位杂交实验

是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段粘附在组织切片上，从而增强了背景染色

。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获

得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去

。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是漂洗的过程中

，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了

(Visualization) 五)显示(显示又可称为检测系统(Detection system)。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射

自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。

细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计

(computerassisted image analysis)检测银粒的数量和分布 算机辅助的图象分析检测仪的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或图象分析仪对不同类型数量的核酸显色强度进行检测。但做半定量测定必须注意严

格控制实验的同一条件，切片的厚度和核酸的保存量如取材至固定的间隔时间等。如为放射

(六)

对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试

1cDNA或cRNA探针进行预杂交(吸收试验)

2异性(载体)序列和不相关探针杂交(置换试验)

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原位杂交-DIG.

原位杂交-DIG.

原位核酸分子杂交技术

原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并

带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形

成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术

为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水

平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学

中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,

基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输

(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。

临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性

疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探

针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位

杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。第一节原位核酸分子杂交技术的发展

原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其

卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，BuongiornoNardelli

和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。

Orth(1970)3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂

原位杂交

原位杂交

小鼠胚胎切片原位杂交

（一）主要试剂及配制方法：

a) 原位杂交用10×PBS储存液（0.5 L体积配方）：向1L烧杯中依次加入29.22 g

NaCl ，13.86 g Na2HPO4·12H2O 和1.763 g NaH2PO4·2H2O，然后加入400mL ddH2O充分搅拌溶解，用固体NaOH将pH调节至7.4，然后加入ddH2O定容至0.5 L，最后各组分终浓度为NaCl=1.3mol/L，Na2HPO4=70mmol/L，NaH2PO4=30mmol/L，高压灭菌后室温保存备用；

b) 1×PBS工作液：将10×PBS储存液用灭菌水稀释10倍即可；

c) 10×甘氨酸溶液：称取甘氨酸10g溶于ddH2O或DEPC水中，最后补足ddH2O定容至1000ml，高压灭菌备用。该液为储备液，-20℃储存。使用时用PBS将10×甘氨酸储备液稀释为工作液（1.0mg/mL)；

d) 5M NaCl：在800ml水中溶解292.2g NaCl，加水定容至1L，高压灭菌后室温保存备用；

e) 1M Tris-HCl ( pH7.5 ，pH9.5)：在800ml水中溶解121.91g Tris碱,加入浓HCl调节pH值至所需值（应使溶液冷至室温后方可最后调定pH值），然后加水定容至1L，最后高压灭菌，室温保存备用；

f) 1M MgCl2 ：在800ml水中溶解203.4g MgCl2·6H2O，用水定容至1L，高压灭菌，室温保存备用；

g) 20%（W/V)SDS：20 g SDS溶解于80 mL ddH2O中，加热到68 C溶解，加热的同时用玻璃棒搅拌助溶，用浓盐酸调节pH值到7.2，加水至100 mL，高温高压灭菌，室温保存备用；

h) 3%过氧化氢溶液：用于组织脱除血色，也可起到一定RNase抑制剂效果，使用时将H2O2原液（30%）用ddH2O稀释10倍即可使用；

i) 2 μg/mL Proteinase K/PBS：使用时配制，将Proteinase K (20mg/mL，-20 C冷冻保存）用PBS稀释10000倍使用；

EBER原位杂交过程

EBER原位杂交过程

预先准备的试剂

胃酶浓缩液：将胃酶中加入4毫升的蒸馏水或去离子水，充分溶解后可根据使用量分装，冻存（-20℃）。

胃酶稀释液：石蜡切片：将试剂瓶中的1N HCl用蒸馏水或去离子水10倍稀释，即成0.1N HCl溶液

PBS配制：将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水，彻底溶解后加入Tween 20 5滴，混匀后使用。

DAB工作液配制：在1毫升5A中加入50微升的5B，临用前配制，未用完的液体应弃去。也可按照上述比例，根据实际需要量配制。

胃酶消化工作液的配制

每1cm2的切片按照300-400微升准备胃酶消化工作液，必须现用现配，未用完的胃酶工作液应弃去。

石蜡切片：将上述已分装好的胃酶浓缩液用已稀释至0.1N的HCl溶液100倍稀释，例如可将15微升的分装胃酶浓缩液加入到1.5ml的0.1N HCl溶液中，混匀后备用。

所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行，避免试剂蒸发。一旦杂交程序开始，玻片不能干燥。

样品的收集和预处理

石蜡切片：

常规福尔马林缓冲液固定，时间不宜超过12小时。石蜡包埋的温度不宜超过65℃。4-6微米的石蜡切片，56-60℃烤片2-16小时。处理好的切片可以立即使用，也可放置于室温条件下保存（至少可保存3个月以上）。在做原位杂交之前，切片需经新鲜二甲苯脱蜡（10分钟×2）。脱蜡后的切片在新鲜100%乙醇中放置5分钟后，经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。

酶处理（避免RNA酶污染，带手套操作）

将切片放置于37℃中，每张切片加入300-400微升新鲜配制的胃酶工作液孵育。石蜡切片孵育30分钟。弃去胃酶工作液后，逐级酒精脱水（70%、95%和100%），每个梯度放置1分钟。空气干燥后杂交。

杂交程序（避免RNA酶污染，带手套操作）

杂交：

混匀探针溶液，在每张切片上加10-20微升适量的探针（试剂3），加盖盖玻片（注意防止气泡！）。湿盒中37℃孵育2小时，杂交过夜效果更好。

原位杂交 2

原位杂交 2

原位杂交实验流程

1. 60℃烤片15min。

2. 石蜡切片用二甲苯脱蜡 (二甲苯各10min/次，2次) 。

3. 梯度酒精水化（100%以乙醇，90%乙醇，75%乙醇，50%乙醇，各10min）。

4. 蒸馏水（高压）洗3min/次，2次。

5. 加1滴或50ul 左旋咪唑室温孵育30min。

6. 用高压水洗3min/次，3次。

7. 加1滴或50ul 1x蛋白酶K，37℃孵育20min。

8. 0.05MPBS洗3min/次，3次。

9. 蒸馏水洗一次3min。

10. 预杂交：每张玻片上滴加预杂交液于标本上，42℃孵育2-4h，甩去多于液体。

11. 探针杂交工作液的配制：储存液为1ug/ul的地高辛探针用DEPC水稀释（视情况而定）在94℃下变性5min,取出立即冰浴5~10min。再按探针/杂交液比例为1/9混合为工作液。

12. 每张玻片上滴加1滴或50ul探针杂交工作液，42℃杂交过夜。

13. 37℃水温SSC液体下洗脱：

2xSSC 洗5min 2次

0.5xSSC 洗15min 2次

0.2xSSC 洗15min 2次

14. 0.05MPBS洗3min/次，3次。

15. 滴加1滴或50ul 1x封闭蛋白液37℃孵育30min，甩去多余液体不洗。

16. 滴加1滴或50ul 兔抗地高辛（1：100稀释）37℃孵育1h。

17. 0.05MPBS洗3min/次，3次。

18. 滴加1滴或50ul AP-羊抗兔lgG(1:100稀释)37℃孵育1h。

19. 0.05MPBS洗3min/次，3次。

20. NBT/BCIP显色，随时镜检终止反应。

21. 必要时核固红复染充分水洗。

22. 梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

主要器材：

显微镜：麦克奥迪 BA400

摄像装置：麦克奥迪 Moticcam 2306