摇瓶与发酵(发酵人论坛)
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实验四摇瓶发酵优化-正交实验1.基本培养基和发酵条件种子培养基(g/L):蛋白胨10,牛肉膏5,NaCl 5,pH 7.0。
培养温度30℃。
发酵培养基(g/L):NaNO3 2.5,K2HPO4 4,KH2PO4 4,MgSO4 0.2,CaCl2 0.1,KCl 1,NaCl 1(以上成份采用无机盐母液配制),酵母粉1,炸货油5%,pH6.5,分装入150mL或250mL三角瓶中,装液量为30mL或50mL。
接种量为5%,发酵温度30℃。
两种培养基均在121℃高压灭菌20 min。
2.参考因素和水平如下2.1碳源用量:炸货油用量设为1%、3%、5%2.2氮源用量:硝酸钠的用量设定为1.5g/L、2.5g/L和3.5g/L2.3磷源用量:①K2HPO4 2,KH2PO4 2② K2HPO4 4,KH2PO4 4③K2HPO4 6,KH2PO4 62.4镁盐用量:MgSO4用0.1g/L,0.2 g/L和0.3g/L2.5钾盐用量:KCl用1g/L,2 g/L和3g/L2.6盐度:NaCl用1g/L,5g/L,10g/L2.7酵母粉用量:1g/L,2 g/L,3g/L2.8发酵温度:25℃、30℃、35℃3.测定方法:排油圈法:发酵液12000rpm离心后取上清,稀释10倍备用。
90mm玻璃或塑料培养皿洗净,加入30mL 去离子水,滴加100uL柴油,开成稳定的油膜后,滴加2uL发酵液或其10倍稀释液,形成排油圈后,立即测定排油圈的大小。
表面张力法:稀释100倍后,测定表面张力。
只用表面张力法,排油圈法供学有余力同学操作。
4.实验日程实验前2天:组长整理出实验方案;尤其是优化的因素和选取的水平,各组相互沟通,不要重复。
未整理实验方案的观摩。
实验前1天:种子培养,150塑料摇瓶,每瓶20mL肉汤,接种,找好第二天要用的药品和摇瓶,检查母液是否可用,必要时重配。
实验当天:按预定方案配制培养基,母液轮流使用,其他组可以先添加碳源;灭菌;按3%的量接种。
发酵工艺优化发酵工艺优化从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处1、消毒方式不同,摇瓶是外流蒸汽静态加热(大部分是这样的),发酵罐是直接蒸汽动态加热,部分的是直接和蒸汽混合,会因此影响发酵培养基的质量,体积,PH,透光率等指标。
扩大时摇考虑2、接种方式不同,摇瓶是吸管加入,发酵罐是火焰直接接种(当然有其他的接种方式),要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。
3、空气的通气方式不同,摇瓶是表面直接接触。
发酵罐是和空气混合接触,考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。
4、蒸发量不同,摇瓶的蒸发量不好控制,湿度控制好的话,蒸发量会少。
发酵罐蒸发量大,但是可以通过补料解决的。
5、搅拌方式不同,摇瓶是摇转方式进行混合搅拌,对菌株的剪切力较小。
发酵罐是直接机械搅拌,注意剪切力的影响和无菌的影响。
6、PH的控制,摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH,发酵可以直接流加控制PH,比较方便。
7、温度控制,摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度,但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制,注意降温和加热的影响。
8、注意染菌的控制方法不一样,发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。
9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测,但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。
10、原材料不一样,发酵所用原材料比较廉价而且粗旷,工艺控制和摇瓶区别很大等等发酵工艺中补料的作用补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点:(1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变,造成菌丝大量生长等问题,改善发酵液流变等性质,使得发酵过程泡沫得以控制,节省消泡剂,并提高了装罐系数。
(2)可以控制细胞质量,以提高芽抱的比例,并使pH得以稳定。
(3)可以解除底物抑制,产物反馈抑制和分解阻遏。
(4)可以使“放料和补料”方法得以实施。
第一节:摇瓶与发酵之所以选择摇瓶作为第一节,主要原因是我对它有深厚的感情,本科时进行植物细胞培养时使用的是摇瓶,研究生课题设计多数时间也在使用摇瓶,进入企业种子培养,验证很多情况都是使用摇瓶。
虽然简单,但它的确是我们一个非常好用的工具,不仅研究过程要应用,生产过程也离不开,它的用途多种多样。
不仅用于种子制备,种子的测试,原料的测试,培养基的优化,发酵过程的优化,能够伴随整个发酵过程。
摇瓶虽然简单,但是要想得到有价值的结论,基本原则不能抛弃,细节也要掌握,毕竟细节决定成败。
首先我们讨论装量问题。
因为没有理论上的规定发酵时摇瓶的装量是多少,所以大家装得一定也不一样。
那么多少合适呢?我不知道有没有下限,但是肯定会有一个上限,总不能装满吧!因为装量越多,在一定转动的情况下,溶氧会越少,相对蒸发量就越低,出现异常的概率就会变大,而且单位发酵液分配的动力也可能会降低。
装量少也不行,因为放罐后要检测,体积总得要够各项检测用吧。
在这里我给一个提示:按照一般经验,发酵液和摇瓶的体积比例为10%-20%。
其实在这里强调了空气,其实也要考虑其他物质的混合,比如:摇床的作用也会使细胞分泌出来的成份快速在整个发酵液中混匀。
我们在摇瓶上进行研究的目的是为了未来能够在发酵罐上进行放大,那么摇瓶如何与发酵罐进行比较呢?现在比较流行计算流体力学,如果有人能够用计算流体力学模拟摇瓶和发酵罐空气,营养,动力等情况的分配,便可以优化摇瓶中培养基体积的多少,使摇瓶与发酵罐的参数更接近一些,为以后的放大提供更接近的数据。
提到装量,相信很多人做过试验进行过优化。
我自己也做过。
一开始没有仔细考虑,只是想优化一个最适的加量,能够使发酵单位最高。
开始的时候,由于没有考虑,挥发量的变化,所以最后得出装量越少发酵越好的结论。
显然与发酵罐是不相符合的,生产需要的是产量而不是发酵单位。
我们设计试验的目的不能够偏离实际。
做试验设计之前,我们一定要能够确定我们的试验目的是什么,我们需要的是一个稳定的菌种还是一个可能高产但是质量不稳定的菌种,我们是要筛选到发酵单位高还是产量高的工艺或培养基。
毕赤酵母的摇瓶发酵方法:一、摇瓶发酵方法:毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段,1、酵母菌株生长阶段;2、脂肪酶诱导表达阶段。
1、酵母生长阶段。
准备试剂:1000ml BMGY培养基,1000ml BMMY培养基,10X的甲醇,摇瓶1L(灭菌),温控摇床,50ml离心管(灭菌)。
紫外分光光度计,石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
(1)往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMGY培养基,然后加入约1ml 脂肪酶菌株(培养基:菌液=100:1),用透气膜封口(透气,但是细菌不能透过)。
置于温控摇床上,温度调至300C,转速为250-300rpm/min,使酵母生长,OD600=2.0-6.0,时间约为15-24小时。
(2)将发酵液转入50ml离心管,1500g-3000g离心5min。
去掉上清,用BMMY培养基将菌体浓度稀释至OD600=1.0,约有500ml左右。
将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中,每个摇瓶150ml 发酵液(绝不能超过200ml)。
(3)将摇瓶置于温控摇床上,温度调至300C,转速为250-300rpm/min,使酵母表达脂肪酶,每24小时加入一次5%的甲醇,使甲醇的终浓度为0.5%。
连续诱导表达48小时。
(4)将发酵液进行12000rpm/min离心5min,取上清(若上清仍混浊,可反复离心);进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMGY培养基的配制(1000ml):20g蛋白胨(peptone),10g酵母提取物(Yeast Extract),加水至700ml;1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml,10X 磷酸钾缓冲液(PH6.0)100ml,10X甘油 100ml。
将摇瓶成果转移到发酵罐的策略和实践
将摇瓶成果转移到发酵罐的策略和实践
科学研究表明,将摇瓶成果转移到发酵罐有助于达到更优质的发酵度。
因此,在将摇瓶成果转移到发酵罐时,应该把握好以下策略和实践,以确保收获更优质的发酵度。
首先,在将摇瓶成果转移到发酵罐之前,应该确保摇瓶中的成果已发酵出来,不能太多也不能太少,收获出来的摇瓶成果应该具有适度的发酵程度。
这一步是很重要的,是开始将摇瓶成果转移到发酵罐的前提,只有在摇瓶中的成果完全发酵出来,质量稳定才能放心的将摇瓶成果转移到发酵罐。
其次,将摇瓶成果转移到发酵罐时,应该注意选择适当的转移工具。
因为摇瓶成果和发酵罐的液体密度大小不同,因此应该选择有适度倾覆角的滴管将摇瓶中的成果转移到发酵罐中。
这样既可以有效避免成果沉淀,也可以避免由于转移过快而把致菌细菌带入发酵罐中。
此外,在将摇瓶成果转移到发酵罐时,还应该注意环境卫生和控制温度。
环境卫生对于液体发酵是至关重要的,转移摇瓶成果时一定要保持室内洁净,确保发酵不受到外界的干扰。
另外,温度的控制也很重要,将摇瓶成果转移到发酵罐的过程中,温度应当以常温为主,注意控制发酵过程中的温度变化。
以上就是本文针对将摇瓶成果转移到发酵罐的策略和实践的探讨,正确把握这些内容,不仅可以有效确保收获更优质的发酵度,还可以避免由于不当操作而带来的后果,确保摇瓶成果安全转移到发酵罐。
从摇瓶到发酵罐的发酵放大问题发酵发酵罐重复性标题:从摇瓶到发酵罐的发酵放大问题摘要:从摇瓶到发酵罐的发酵放大问题我在实验室50ml 250ml三角瓶做,37℃150rpm;放大到300L发酵罐,转速180rpm(不能调),风量要控制在多少合适啊?这个细菌是微好氧的。
有一次,溶氧都降到2%了,反而结果还比前几次好。
但是产物也只有摇瓶做的50%。
怎么优化啊?回复:溶氧控制在转速180rpm时,是比较扯淡的,因为转速不足以把微量空气氧打散到促进气液两相的传质程度!!(我在10L罐上……关键词:发酵发酵罐重复性回复:优化大罐需要考虑:罐压,接种量,pH范围,通气量范围,起使转速,温度,DO范围。
这些都是必须考虑的,你可以适当固定1到2个条件,看看生长怎么样。
穷孩子,发酵罐和摇瓶相差太大,因为整体的机制不甚相同,我觉得最大的区别在于1 摇瓶靠的是离心力,而发酵罐是真正的剪切,有些菌种在摇瓶中生长良好,但到发酵罐上由于剪切作用而无法结团,所以很多时候两者是不一样的。
2 溶氧问题:上面几位说得很全了,我就不多说了:P流加式的,你在摇瓶上无法实现持续流加吧,但是发酵罐是可以的。
测到(但是现在已经出现直接跟着检测系统的摇瓶系统),所以你无法维持一个恒定的pH。
发酵罐可以通过在线控制pH值恒定5 数据:你做发酵,最重要的是得到合适的配方与工艺吧,往往在发酵罐上可以比较全地反映出你的整个发酵状态,什么时间菌体疯狂生长,什么时间进入产素阶段,根据一些指标可以看得出来,所以摇瓶只是表层,发酵罐才是深层,总之吧,摇瓶肯定是基础,只有在摇瓶的基础上进行系统的发酵罐的研究才能真正适合生产。
再者,你就是由小罐到大罐的工艺操作还是不尽相同。
仅供参考,大家多交流!微生物发酵的放大实验,要注意反应罐的培养温度,培养基浓度,PH值,搅拌转速,还要不断的反应罐增加补料。
温度好控制pH上罐子是可以调节的,在摇床上你只能定时取样检测溶氧就差的很大了,摇床上基本就是缺氧的,上罐子因为有通气所以在一定条件下能确保溶氧,这样会导致用摇床摇菌的时间远远大于上罐子的时间,我现在做的菌,在摇床上基本是16小时左右吧,上罐子就6、7个小时不锈钢最怕氯离子了,特别是盐酸.酸的种类多了,看你需要补课的多,还是自己先学一阵子先吧.回复选择硫酸或磷酸即可不知楼主为何选盐酸:sweat:回复不锈钢最怕氯离子啦,尤其是盐酸,有些用自来水的厂子都要严格控制水中氯的含量!你们做多久啦?多大的罐子呀?发酵罐是压力容器,先停下来检修吧,不然出了事就是人命关天的大事:cat3:回复主要看HCl在发酵过程中起什么作用,是否可以替换。
发酵罐(5天)与摇瓶(5天、7天)发酵产物对比分析
以上二者均为摇瓶发酵7天产物。
结论:
1号、2号发酵罐,及对照组药瓶均发酵5天。
之前实验摇瓶发酵均发酵7天,本来计划上罐发酵也采用6或7天,但是在发酵至第五天时,罐内物质已变得非常稠,所以第五天下罐。
一、1号发酵罐代谢产物基本与2号罐产物类似,前者产物稍微多些。
可能原因,2号罐染少量杆菌,影响发酵结果。
二、此两号罐的代谢产物与摇瓶对照组(5天)相比有很大区别。
其中发酵罐进行发酵至第五天的时候,原本总体积为
4.375L的发酵液,剩余约为3L-3.2L。
水分蒸发较严重,可能通气量较大。
为了避免这次蒸发,计划下次采用发酵罐发酵的时候减少通气量,并在发酵液中加入少量水。
三、此两号罐(5天)的代谢产物与摇瓶对照组(5天)分别与摇瓶发酵(7天)代谢产物均有区别。
下次计划适当延长发酵时间至6天左右。
实验四红霉素的摇瓶发酵一、目的要求1. 掌握微生物发酵的基本流程和技术。
2. 掌握红霉素发酵过程。
3. 学习计算红霉素的浓度及分析影响发酵结果的因素。
二、基本原理1. 红霉素结构式:柠檬酸分子式:C37H67NO13,分子量:733.932. 红霉素为大环内酯类抗生素,抗菌谱与青霉素近似,对革兰阳性菌,如葡萄球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌、肺炎链球菌、粪链球菌、溶血性链球菌、梭状芽孢杆菌等有较强的抑制作用。
对革兰阴性菌,如淋球菌、螺旋杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌、军团菌、脑膜炎双球菌以及流感嗜血杆菌、拟杆菌、部分痢疾杆菌及大肠杆菌等也有一定的抑制作用。
作用机制主要是与核糖核蛋白体的50S亚单位相结合,抑制肽酰基转移酶,影响核糖核蛋白体的移位过程,妨碍肽链增长,抑制细菌蛋白质的合成,系抑菌剂。
红霉素的生物效价测定原理:红霉素的生物测定是用杯碟法,利用抗菌素在琼脂培养基内的扩散渗透作用,将已知效价的标准溶液与未知效价的样品溶液,在同样的条件下,在涂布有高度敏感型的试验菌株培养基上,进行对照培养。
培养一定时间后,在抗菌素到达的适应浓度范围内,产生透明圈,比较两者抑菌圈的大小,利用图表法对算出未知抗菌素的效价。
敏感菌:葡萄球菌等革兰氏阳性菌株。
三、实验材料1.菌种红霉素链霉菌,金黄色葡萄球菌2.实验器材1 mol/L NaOH;1 mol/L HCl50 mL无菌生理盐水、10mL 、5mL吸管、接种环;酒精灯,滤纸,漏斗,250 mL三角瓶,200ml量筒,广范pH试纸,玻璃棒,滴管,天平,分光光度计等。
3.种子培养基:可溶性淀粉3.5%,硫酸铵0.75%,氯化钠0.5%,磷酸氢二钾0.08%,蛋白胨0.5%,糊精2%,葡萄糖3%,酵母粉2%,碳酸钙0.8%,硫酸镁0.05%,pH 7.5;4. 发酵培养基:可溶性淀粉3%,硫酸铵0.5%,糊精1.5%,葡萄糖2%,玉米浆0.1%,碳酸钙0.9%,豆油0.3 ml/75ml,pH 7.5。