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ε-聚赖氨酸产生菌的筛选、育种及发酵研究ε-聚赖氨酸（ε-poly-Lysine，ε-PL）是少数链霉菌将L-赖氨酸单体通过α-COOH与ε-NH<sub>2</sub>脱水缩合而成的一种氨基酸同聚物，聚合度为25-35。
由于其抑菌谱广、效价高、安全无毒，再配合其水溶性好、作用pH广、热稳定强等特点，ε-PL已被广泛用作食品防腐剂。
此外，ε-PL还被用于食疗剂、药物载体、基因芯片、电子材料等领域。
因此，其应用价值及市场前景是非常广阔的。
本论文首先从土壤中筛选获得了五种野生型的ε-PL产生菌；其次利用传统诱变方法及新兴的Genome Shuffling技术对这些野生菌株进行育种改造，以提升其ε-PL发酵水平；然后对获得的高产菌株进行了种间随机的原生质体融合，将其优良性状集中于同一个细胞内，进一步提升了ε-PL的产量；最后对种间融合获得的高产杂合子产ε-PL 进行了强化，包括Genome Shuffling、培养基优化及发酵工艺优化，最终使其ε-PL产量达到了国内领先水平。
具体研究内容如下：（1）从土壤中筛选放线菌时，为了有效抑制杂菌（细菌、霉菌）的生长，在分离培养基中添加了复合抑制剂：重铬酸钾30mg/L、青霉素2mg/L、氟哌酸3mg/L、制霉菌素80mg/L；对ε-PL 产生菌的筛选方法做了改进，利用“双层琼脂法”代替“直接添加美蓝”法，将“菌落生长”与“排斥美蓝显色”分成了两个阶段，能够有效避免美蓝对微生物的毒害，提高了筛选效率；利用该法从土壤中筛选获得了ε-PL产生菌42株，其中至少有白色链霉菌S. albulus、禾粟链霉菌S. graminearus、吸水链霉菌S. hygroscopicus、灰褐链霉菌S. griseofuscus、稠李链霉菌S. padanus等五种菌株，其中后四种菌株在ε-PL产生菌中未见报道。
（2）采用紫外线（UV）与亚硝基胍（NTG）对五种ε-PL产生菌进行诱变。
技术与方法ε2聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定3朱宏阳 徐 虹33 吴 群 陈玮玮(南京工业大学制药与生命科学学院 南京 210009)摘要:建立了一种灵敏的ε2P L产生菌高通量的筛选方法。
在分离培养基中加入150mg/LK2Cr2O7,以有利于放线菌的富集分离;并添加美蓝染料,利用产碱菌株碱性分泌物和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产碱菌株;利用D ragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应从产碱菌株中检出得到46株生物碱产生株;最后对产生物碱的菌株的发酵液进行ε2P L含量分析,确定4株ε2P L产生菌株。
对其中一株ε2P L高产菌P L623菌株进行形态、生理生化和16S r DNA分析,结果表明P L623为北里孢菌属(Kita2satospora)。
关键词:菌株筛选,鉴定,ε2聚赖氨酸,北里孢菌,16S r DNA中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:025322654(2005)0520127204Screen i ng and I den ti f i ca tion ofε2PL Produc i ng Stra i n3ZHU Hong2Yang XU Hong33 WU Qun CHEN W ei2W ei(College of L ife Science and Phar m aceutical Engineering,N anjing U niversity of Technology,N anjing210009)Abstract:A si m p le and sensitive method was devel oped t o screenε2P L p r oduced strains fr om s oils1150mg/LK2Cr2O7was added t o the s olid medium for actinomycetes enriching1A basic dye,methylene blue,incor poratedin the agar p late t o detect alkali p r oducers,because dye reacted with the secreted basic poly mers by electr ostaticinteracti on with the secreted basic pdy mers and f or med s pecial z oon1And then dragendorff regent was used t o de2tect alkal oid p r oducers1Fourε2P L p r oducerswere obtained by T LC analysis1Meanwhile,phyl ogenetic analysis ofP L623strain,including mor phol ogy,physi ol ogical and bi oche m ical characters and chemotaxomy were perfor medand phyl ogenetic tree was constructed based on the16S r DNA sequences1And the results indicated that P L623strain is a me mber of Kitasatospora1Key words:Screening,I dentificati on,ε2polylysine,Kitasatospora,16S r DNAε2聚赖氨酸(ε2poly2L2lysine,ε2P L)是由微生物合成的L2赖氨酸同聚物,由ε2氨基与α2羧基通过肽键连接而成,其聚合度一般为25～35[1,2]。
赖氨酸高产菌株的选育[摘要]：赖氨酸作为一种重要的饲料用氨基酸，需求量一直在不断增长。
传统的赖氨酸生产菌株都是多年来是经过多轮随机突变和筛选得到，而近年来随着基因重组技术的发展及对生物代谢过程的了解，人们已经能够通过基因重组技术，改变代谢途径，提高赖氨酸产量。
目前有不少成功将野生菌株改造为高产菌株的案例，他们都可以作为合理设计代谢途径并结合各种组学进行微生物代谢途径改造的基础。
本文主要描述通过代谢途径改造并结合高通量筛选技术，快速得到赖氨酸高产菌株的方法。
[关键词]：赖氨酸菌种选育基因改造高通量筛选中图分类号：x-1 文献标识码：x 文章编号：1009-914x （2012）12- 0052 -03l-赖氨酸作为人体和动物所必需的氨基酸之一，被广泛用于饲料、添加剂、食品强化剂和医药产品等方面。
随着l-赖氨酸的需求量急剧增加，l-赖氨酸的生产开发需要进一步的研究，而选育出优良菌种是其技术的关键。
在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖。
但发酵工业需要培养微生物使其积累大量赖氨酸。
所以要采取种种措施打破微生物的正常代谢，积累更多的赖氨酸。
菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。
一个合适的赖氨酸高产菌株应该具备以下几点：能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，生成的目的产物产量高、易于回收；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；培养条件易于控制；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；菌种不易变异退化；对放大设备的适应性强；菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素。
在菌种选育中，若采用传统的诱变育种或杂交育种[1，2]，微生物可遗传的特性发生变化称变异，是微生物产生变种的根源，也是育种的基础。
自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。
但自发突变的频率较低，往往不能符合工业生产的要求。
因此要利用诱变剂提高菌种的突变频率。
虽然人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，速度快，方法简便，但是由于基因突变为随机突变，必须与大规模的筛选工作相配合，因此会消耗大量的人力物力进行筛选；原生质体融合技术可以使一些未发现有转化、转导和结合等现象的原核生物之间，以及微生物不同种、属、科甚至更远缘的微生物细胞进行融合，得到新物种。
但是原生质体融合难度较大，并非每次都能够成功[3]。
目前菌种选择的总趋势是由自然选育向代谢控制育种，诱发基因突变向基因重组的定向育种转变。
基因工程育种包括所有的利用dna重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得某些优良性状或利用后者作为表达场所来生产目的产物。
由于大肠杆菌是单细胞，结构简单，生长速度快，培养简单，遗传背景清楚等优点，所以比较容易进行基因工程改造。
1、菌种改造由于细胞内的代谢不是一个孤立的过程，而是一个相互联系的网络，网络之间会相互制约，因此目前在对菌株进行基因改造时，往往不是仅仅对某个基因进行单独的改造，而是对目的产物形成过程中一系列相关基因进行改造。
如赖氨酸合成相关基因的过量表达、提高表达产物的活性、降低支路代谢基因拷贝数、降低基因表达产物的活性等等措施。
增加细胞膜的通透性、增强目的产物向胞外的运输、降低支路代谢的代谢流、弱化关键酶对终产物反馈抑制的敏感度等都有助于目的产物的积累。
因此为了提高赖氨酸产量，增加工程菌菌株的稳定性，一般要做到以下几点中的一点或几点。
1.1过量表达赖氨酸合成相关基因菌株细胞内过量表达赖氨酸合成相关酶基因，可以增加赖氨酸合成代谢流，直接增加赖氨酸的积累。
菌株过量表达的基因：dapa 基因（二氢吡啶二羧酸合酶基因）、dapb基因（二氢吡啶二羧酸还原酶基因）、dape基因（琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰化酶基因）、lysc基因（天冬氨酸激酶基因）、lyse基因（赖氨酸输送蛋白基因）、pyc基因（丙酮酸羧化酶基因）、gap基因（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因）基因中的一个或多个。
通过增加pyc基因和lyse基因的拷贝数和改变dapa基因的启动子来实现基因的超量表达[4-7]。
同时资料还显示：对于给定的pyc基因，dapa、dapb及lysc基因同时也过量表达对赖氨酸生产格外有利[4]。
1.2降低支路代谢流过量表达赖氨酸合成途径中的关键基因会增加赖氨酸的表达量。
同时资料还显示：降低支路代谢相关酶的表达量或活性或敲除支路代谢相关基因构建营养缺陷性同样会增加赖氨酸的表达量[7，8]。
降低糖异生代谢途径流量，利用一个弱的启动子或编码相应的具有低活性的酶的基因或等位基因来实现pck基因（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）、pgi基因（葡萄糖-6-磷酸异构酶）的弱化[7]。
降低由天冬氨酸半醛生成高丝氨酸的量，继而蛋氨酸、苏氨酸的合成量也会降低，生成的thr的量不足以与lys共同对天冬氨酸激酶（ak）起协同反馈抑制作用[8]（在分支代谢途径中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，若某一末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。
l-赖氨酸和l-苏氨酸对天冬氨酸激酶有协同反馈抑制作用）都有助于赖氨酸的积累。
1.3解除抑制作用lysc基因和dapa基因分别编码天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合酶，分别催化天冬氨酸转变为天冬氨酰磷酸、天冬氨酸半醛转变为二氢吡啶二羧酸。
在大肠杆菌中天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合酶都受到赖氨酸的反馈抑制作用，而在谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌中天冬氨酸激酶受到赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制，但二氢吡啶二羧酸合酶不受赖氨酸的反馈调节作用。
为了解除赖氨酸和/或苏氨酸对dapa基因和lysc基因的反馈抑制作用，在将dapa基因和lysc基因导入菌株之前，需要对基因序列进行定点突变，改变基因的编码序列，使其编码的蛋白性质改变，从而对赖氨酸的反馈抑制作用脱敏[6，9-11]。
在生产中得到证实并应用的突变体有很多如：棒状杆菌lysc基因编码反馈抗性形式的天冬氨酸激酶[10]，蛋白突变位点为a279t，a279v，s301f，t308i，s301y，g345d，r320g，t311i，s381f中的一个或多个。
大肠杆菌lysc基因ⅲ（天冬氨酸激酶基因ⅲ）对l-赖氨酸反馈抑制脱敏的突变体[6]，其突变位点：d323g，d323g/d408g，c34r/d323g，f325l，i318m， i318m/m349v，l345s，m347v，i352t，i352t/f369s，k164e，i417m/y419c。
来自大肠杆菌的dapa基因（二氢吡啶二羧酸合酶基因）突变体[6，11]，使二氢吡啶二羧酸合酶对l-赖氨酸的反馈抑制脱敏：v81a，y118h，v81a/y118h。
1.4改善细胞膜的通透性改善细胞膜的透过机能，如在细胞内过量表达lyse基因（赖氨酸输送蛋白基因）有助于微生物胞内合成的赖氨酸向胞外运输，降低胞内赖氨酸含量[6]，进一步减弱l-赖氨酸和l-苏氨酸对赖氨酸合成的协同反馈抑制作用，增加赖氨酸的产量，同时有利于产品的后续加工。
1.5整合基因通过附加型质粒扩增特定微生物中某些生物合成基因，其缺点为发酵期间所述质粒可能会丧失，同时需要添加外源的抗生素来维持选择压力。
若将赖氨酸合成相关基因整合到大肠杆菌基因组中，使大肠杆菌中除天然位点含有编码l-赖氨酸合成相关蛋白的基因至少一个拷贝外，还在其他任选位点含有整合进染色体的这种开放阅读框、基因或等位基因的第二个、第三个或第四个拷贝。
这样外源基因就不会在大肠杆菌的复制过程中丢失，同时也不需要添加外源的抗生素来维持选择压力[12]。
2、菌种筛选在上述的不管是对菌株进行基因工程的改造，还是通过紫外线、化学诱变剂进行诱变育种，还是对新菌株进行培养基优化都无法绕开大量繁琐的筛选工作，他们都需要进行大量的摇瓶实验。
但是摇瓶实验筛选工作量大，周期长和成本高，难以达到工业化生产的要求，因此应寻找一种能够开展多参数的、与发酵工艺过程相结合的高通量菌种筛选技术和方法。
目前高通量筛选能够实现多参数在线检测功能，可同时测量ph 值、do、pco2、od等重要参数；在一台微反应器上集成的微发酵罐数可达6、1224、4896个不等，能够实现高通量分析功能；同时整个筛选的体积小，其体积一般小于100 ml，有的甚至小至5 μl。
此外，还有造价低、减少昂贵原材料消耗、降低劳动强度等优势[13]。
目前高通量筛选技术依然在改进，同时也越来越多的应用于高产菌株的筛选过程中，多篇报道也验证了高通量筛选在高产菌株筛选中的可行性[14-17]，建立了各种高产菌株高通量筛选方法，取得了一定的成果，为高产菌株的筛选节省了大量的人力物力财力，一步一步向工业化生产的要求靠近。
3、结语虽然采用合适的筛选方法，诱变育种可以获得高产菌株，但是微生物的自发突变和诱发突变都是随机的，因此不能达到定向育种的目的。
随着现代生物技术尤其是的dna重组技术的发展，使人们能够在分子水平上，根据需要，用人工方法取得供体dna上的基因，在体外重组于载体dna上，再转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传性状，达到定向改良菌种的目的。
随着时间的推移，在对微生物进行基因改造时，越来越多的是从微生物的整体代谢来考虑，而不是仅仅去增强或减弱某一个基因，这主要是因为细胞的生化反应是一个网络整体，不是独立的，不应孤立地来考虑。
目前主要是利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰和改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，用以实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物。
目前日本味之素、德国德古萨等公司已经将分子育种运用到生产中，并表现出明显的优势。
定向的菌种改良结合高通量的菌种筛选方法，极大的改变了传统的菌种选育方式，节约了人力物力，缩短了筛选周期，使菌种选育变得更加高效便捷。
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