_聚谷氨酸高产菌株的选育及发酵条件优化

γ中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):62～65胡荣章1叶海峰1金丽1吴昌琳2吴自荣1*(1 华东师范大学生命科学学院上海2000622 华东师范大学物理系上海200062）摘要γ报道了以11株枯草芽孢杆菌菌株为培养菌株，用3种谷氨酸钠含量不同的培养基进行筛选获得1株γ初始pH、接种量、通气量等发酵条件的优化实验，结果表明最佳发酵条件为：250ml三角烧瓶装液40ml,接种体积分数5％，麦芽糖50g/L，酵母膏10g/L，谷氨酸钠30g/L， NaCl 10g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，初始pH6.0，发酵60h，此时γ达到30.26g/L，比国外报道的20g/L的产量有显著提高。

纯化后产物经红外光谱及核磁共振检测，鉴定为γ关键词聚谷氨酸芽孢杆菌筛选发酵条件优化收稿日期：20050628修回日期：20051008* 通讯作者，电子信箱：zrwu@γγpolyglutamic acid,γPGA）是由微生物合成的一种细胞外高分子量聚合物，由谷氨酸的α－氨基和γ缩合而成。

Shih等［1］首次发现炭疽芽孢杆菌的荚膜中含有γPGA，随后发现有些芽孢杆菌属细菌能够通过发酵培养积累γPGA。

γPGA分子链上具有较高活性的羧基（-COOH），可与一些药物结合生成较稳定的复合物，在体内可被溶酶体降解为内源性谷氨酸，并释放出药物，是一种理想的药物载体［2,3］。

此外，它还具有水溶性、可生物降解、可食用、吸水性强、对人体和环境无毒害作用等特性，因而被广泛应用于食品、化妆品、水处理、农业医药等方面［4］。

但由于微生物发酵产量低，生产成本过高，因此还没有实现大规模生产，故筛选高产菌种、降低生产成本是解决问题的关键。

本研究从筛选高产菌种、优化发酵条件、提高产量着手进行了初步探讨。

1材料和方法1.1材料1.1.1菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus. sp）共11株，由本实验室保存。

谷氨酸生产菌培养基条件的优化综述前言谷氨酸的发现为氨基酸的发展与应用奠定了基础。

以谷氨酸为基础生产的各种下游产品广泛的应用于食品、化工、医药等行业，其中味精是第一代食品调味品，其产量以及需求量正逐年递增。

由于微生物学及生物工程技术、基因工程技术的发展，使现如今谷氨酸发酵工业从粗放的、以传统经验为指导的生产正向着以了解发酵代谢机理为指导的新型工业生产发展，这为谷氨酸发酵工业带来了更大的发展空间。

谷氨酸生产工业与先进的生产技术相结合，对谷氨酸生产菌种的育种、代谢控制发酵和下游产品的开发具有一定的促进作用。

1.2 谷氨酸谷氨酸（Glutamic acid）作为一种酸性氨基酸，由里索逊于1856 年发现。

谷氨酸大量存在于谷类蛋白质及动物脑中，在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，并参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应，是构成蛋白质的20 种常见α-氨基酸之一，与我们的生活息息相关。

谷氨酸谷氨酸（Glutamic acid）作为一种酸性氨基酸，由里索逊于1856 年发现。

谷氨酸大量存在于谷类蛋白质及动物脑中，在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，并参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应，是构成蛋白质的20 种常见α-氨基酸之一，与我们的生活息息相关。

一、谷氨酸的应用1. 应用于食品行业谷氨酸是人类应用的第一个氨基酸，也是世界上应用广，产量及销量最大的一种氨基酸，主要用于食品行业中味精的生产。

L-谷氨酸是制造味精的前体，与适量碱反应可生成谷氨酸钠，即味精。

这是家喻户晓的一种风味增强剂，是重要的鲜味剂，不仅具有增强食品风味的功能，而且对动物性食品还具有保鲜作用，最重要的是这种风味添加剂食用安全，应用性较广。

在食品中浓度为0.2 % ~ 0.5 %，每人每天允许摄入量（ADl）为0 ~ 120 μg/ kg（以谷氨酸计）。

2. 应用于医药行业谷氨酸还可用于医药，虽然它并非人体必需氨基酸，但它可作为碳氮营养参与机体代谢，有较高的营养价值。

谷氨酸的先进生产工艺谷氨酸是一种重要的氨基酸，在食品添加剂、保健品、药物、化妆品等领域有广泛的应用。

目前，谷氨酸的生产工艺主要有微生物发酵法和化学合成法两种。

微生物发酵法是目前主要的生产方法，下面将重点介绍谷氨酸的先进生产工艺。

微生物发酵法是利用谷氨酸高效产生菌株通过生物代谢反应将低价的有机废弃物转化为谷氨酸。

谷氨酸的先进生产工艺主要包括菌株选育、发酵过程优化和分离纯化技术三个方面。

首先，菌株选育是谷氨酸生产工艺的核心环节。

目前，国内外研究人员已经从多种微生物中筛选出多种高效的谷氨酸产生菌株，如变异株、突变株等。

其中，变态球菌、拟杆菌、乳酸杆菌和乳酸菌是常用的谷氨酸产生菌株。

菌株选育的目标是寻找产量高、菌种稳定、代谢特性好的菌株，并通过遗传工程手段进一步提高菌株的产酸能力和抗性。

其次，发酵过程优化是提高谷氨酸生产效果的关键。

发酵过程优化主要包括培养基优化、发酵条件调控、发酵设备升级等方面。

培养基优化是通过调整培养基组成和添加合适的添加剂来提高菌种的生长速度和产酸能力，如碳源、氮源、有机酸、氨基酸等。

发酵条件调控包括发酵温度、pH值、氧气供给、搅拌速度等，通过合理调节这些因素可以提高菌种的生理代谢活性和谷氨酸的产量。

发酵设备升级是利用现代生物工程技术，开发新的发酵设备和设备控制系统，提高谷氨酸发酵的自动化水平和生产效能。

最后，分离纯化技术是谷氨酸生产工艺中不可或缺的环节。

分离纯化技术主要包括过滤、浓缩、离心、脱色、结晶等过程。

在分离纯化过程中，采用适当的工艺条件和操作方法，可以高效地提取和纯化谷氨酸。

目前，常用的分离纯化技术包括膜分离技术、离子交换及吸附技术、凝胶过滤技术等。

这些技术既可以提高产品的纯度，又可以降低生产成本，提高谷氨酸的生产效能。

综上所述，谷氨酸的先进生产工艺主要包括菌株选育、发酵过程优化和分离纯化技术三个方面。

通过优化这些环节，可以提高谷氨酸的生产效能和产品质量，推动谷氨酸产业的发展。

γ-聚谷氨酸产生菌的发酵培养基优化李文婧;赵祥颖;田延军;张家祥;韩延雷;刘建军【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2010(036)003【摘要】采用响应面试验对1株γ-聚谷氨酸产生菌的发酵培养基进行优化,得到的产γ-PGA发酵培养基组合为:NaCl 15g/L、豆粕53 g/L、柠檬酸钠16 g/L、谷氨酸钠40 g/L、NH_4Cl 4.6 g/L、K_2HPO_4 0.625 g/L、MgSO_4 1.25g/L、MnSO_4 0.35 g/L、CaCl_2 0.2 g/L,在此条件下,γ-PGA发酵产率为25.81 g/L,比优化前提高了约1.5倍.【总页数】5页(P108-111,116)【作者】李文婧;赵祥颖;田延军;张家祥;韩延雷;刘建军【作者单位】山东轻工业学院食品与生物工程学院,山东,济南,250353;山东省食品发酵工程重点实验室,山东,济南,250013;山东省食品发酵工程重点实验室,山东,济南,250013;山东省食品发酵工程重点实验室,山东,济南,250013;山东省食品发酵工程重点实验室,山东,济南,250013;山东轻工业学院食品与生物工程学院,山东,济南,250353;山东省食品发酵工程重点实验室,山东,济南,250013【正文语种】中文【相关文献】1.γ－聚谷氨酸产生菌发酵培养基的响应面法优化研究 [J], 张海群;张智维;刘婷2.利用响应面法优化γ-聚谷氨酸发酵培养基 [J], 于晓丹;马霞;王可;陈君娜3.解淀粉芽孢杆菌fmbj37产γ-聚谷氨酸发酵培养基的优化 [J], 盛洁; 孟凡强; 吕凤霞; 赵海珍; 张充; 陆兆新4.γ-聚谷氨酸生产菌株的鉴定及发酵培养基优化 [J], 张雷;张蕾;王玲莉;魏占波;李杰;周怡;丁芳;高纪超;石元亮5.暹罗芽孢杆菌LW-1产γ-聚谷氨酸发酵培养基的优化 [J], 蔡亚慧;王青;王文玉;皇高峰;张继冉;徐淑霞;张世敏;吴坤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

L-谷氨酰胺高产菌株选育及发酵过程优化的开题报告
一、选题背景
谷氨酰胺（L-Glutamine，L-Gln）是一种广泛应用于医药、保健品、食品和饲料等领域的重要氨基酸，在生物体内具有多种功能，如维持肠
道黏膜屏障、免疫调节、脑神经传递等。

由于其生理功能的多样性和重
要性，谷氨酰胺市场需求量逐年增加，成为一种具有广阔市场前景的生
物活性物质。

谷氨酰胺的生产主要依靠微生物发酵工艺，然而，传统发酵方法生
产谷氨酰胺效率较低，产量有限。

因此，选育高产菌株和优化发酵过程
是解决该问题的有效途径。

二、研究目的和内容
本研究旨在选育高产谷氨酰胺的菌株，并通过发酵过程的优化，提
高谷氨酰胺的生产效率。

具体内容包括：
1. 从具有谷氨酰胺生产潜力的微生物中筛选出高产谷氨酰胺的菌株，并进行鉴定和优化。

2. 采用响应面分析等方法优化谷氨酰胺发酵过程的参数，包括菌种
培养条件、发酵基质成分和发酵条件等。

3. 根据最佳发酵条件进行大规模发酵试验，考察谷氨酰胺的产量和
品质等指标，并与传统发酵工艺进行比较分析。

三、研究意义
本研究的成果可以为谷氨酰胺的生产提供新的思路和方法，解决传
统发酵工艺产量低、生产效率低等问题，提高谷氨酰胺的产量和质量，
为生物活性物质的生产和应用提供强有力的支持。

此外，研究过程中所涉及到的微生物分离、鉴定和优化方法，对于探索和利用其他有潜力的微生物，并提高其代谢产物的产量和质量也具有一定的参考意义。

第３６卷第１期２０２１年２月安㊀徽㊀工㊀程㊀大㊀学㊀学㊀报J o u r n a l o fA n h u i P o l y t e c h n i cU n i v e r s i t y V o l ．３６．N o ．１F e b ．,２０２１文章编号:１６７２Ｇ２４７７(２０２１)０１Ｇ０００１Ｇ０７收稿日期:２０２０Ｇ１１Ｇ２１㊀作者简介:刘丹丹(１９９７Ｇ),女,安徽亳州人,硕士研究生．通讯作者:聂光军(１９７６Ｇ),男,安徽含山人,教授,博士．A R T P 诱变选育γＧ聚谷氨酸高产菌株快速筛选方法的建立刘丹丹,臧毅鹏,王㊀利,王梦梦,岳文瑾,余晨锐,陈俊柳,聂光军∗(安徽工程大学生物与食品学院,安徽芜湖㊀２４１０００)摘要:γＧ聚谷氨酸是一种由微生物发酵产生的具有较强保健功能的生物高分子,在食品㊁医药㊁化妆品等行业具有广泛的应用.但因筛选方法效率低下,导致其菌株选育效率难以提高.研究筛选出一株高产γＧP G A (γＧ聚谷氨酸)菌株并对其进行形态㊁生化与分子鉴定发现,该菌株为纳豆枯草芽孢杆菌.根据菌株的产物特征,系统分析了酪蛋白板初筛㊁多孔板复筛和摇瓶复筛,结果发现三者筛选结果基本一致,且多孔板复筛与酪蛋白平板形成的纳豆菌的圈径比具有线性关联.在此基础上,应用A R T P 辐照纳豆菌群,并仅用酪蛋白平板法,快速筛选出一株γＧP G A 高产菌株,产量较出发菌株提升了２２％,且遗传稳定性良好,表明酪蛋白平板透明圈快筛方法有效,大幅压缩了筛选的时间,显著提升了菌株诱变选育的效率.关㊀键㊀词:γＧ聚谷氨酸;纳豆芽孢杆菌;菌株筛选;常压室温等离子体(A R T P )中图分类号:Q ８１５㊀㊀㊀㊀文献标识码:A γＧ聚谷氨酸(γＧP o l y g l u t a m i c a c i d ,γＧP G A )是一种由谷氨酸单体聚合而成的高分子多聚物[１],具有无毒和可降解性,被广泛应用于食品行业.如作为益生菌的低温保护剂,提高益生菌在生产过程中的存活率[２Ｇ４];在面粉加工过程中,γＧP G A 可以减缓淀粉老化,提高面制品的弹性和韧性[５]等.目前,γＧP G A 主要通过微生物发酵生产,但目前菌株生产效率满足不了市场对γＧP G A 的需求,导致γＧP G A 的价格居高不下.为提升菌株生产效率,各种诱变方法被使用,其中物理射线诱变相对于化学诱变具有简单㊁环境污染小等特点.常用的物理诱变主要通过紫外线㊁X 射线等射线辐照微生物,以改变D N A [６],但这些方法存在诱变效率低以及可控性差等问题[７].近几年兴起的常压室温等离子体(A t m o s p h e r i c a n dR o o m T e m pe r Ｇa t u r eP l a s m a ,A R T P )诱变技术因具有突变率高,对人体和环境无毒害,易操作等优点[８],常被用于微生物菌种诱变[９Ｇ１０].然而,基于A R T P 诱变选育γＧP G A 高产菌株的过程中,阻碍诱变选育效率的可能是其筛选方法的低效.面对大量诱变菌株,使用传统方法逐一测定每个菌株的产量则需要耗费过多的精力与时间[１１].γＧP G A 产生菌在生长过程中,由于各种蛋白酶的作用,往往在其周围的培养基上形成一个透明圈,透明圈的大小则反映了蛋白酶的活性[１２],而γＧP G A 在生产过程中又与蛋白酶存在着偶联关系[１３].为此,在筛选一株γＧP G A 高产菌株并在对其进行鉴定的基础上,分析酪蛋白平板初筛㊁多孔板复筛(２４孔板与４８孔板)和摇瓶复筛之间的关系,尝试建立透明圈与菌落面积的比例(圈径比)与γＧP G A 产量之间的关系,简化筛选流程,通过圈径比大小直观快速筛选γＧP G A 高产突变株,快速提升A R T P 诱变选育γＧP G A 高产菌的效率.１㊀材料与方法１．１㊀材料与试剂生产γＧP G A 的出发菌株(市售纳豆粉中筛选获得,命名为MA １);L Ｇ谷氨酸(国药化学试剂有限公司);γＧ聚谷氨酸(四川拙诚日化科技有限公司,纯度大于９５％);细菌基因组提取试剂盒㊁T a q 酶㊁引物和相关P C R 试剂(上海生工生物工程有限公司).１．２㊀菌株鉴定通过对菌株的形态学研究㊁菌落形态观察㊁菌株的生理生化实验３个方面对菌株进行鉴定.将MA １Copyright©博看网 . All Rights Reserved.接种到固体培养基(牛肉膏５g/L㊁胰蛋白胨５g/L㊁N a C l５g/L㊁琼脂１５g/L㊁p H７ ０),３７ħ培养２４h,观察菌落形态.将MA１接种到种子培养基(牛肉膏３g/L㊁葡萄糖５g/L㊁胰蛋白胨５g/L㊁N a C l５g/L㊁p H ７ ０),３７ħ培养２４h,革兰染色镜检观察菌株形态.将MA１接种到酪蛋白培养基(脱脂奶粉５０g/L㊁琼脂１５g/L㊁p H７ ０),３７ħ培养２４h,观察菌落形态.将MA１接种到液体发酵培养基(蔗糖２８ ８７g/L㊁胰蛋白胨１７ ５６g/L㊁LＧ谷氨酸１５ ２６g/L㊁p H７ ０),３７ħ培养２４h后,将发酵液滴入纤维蛋白平板(２％琼脂糖㊁２０I U凝血酶溶液㊁０ ３m g纤维,总体积为１０m L)中,观察发酵液的纤维降解能力.基于S D SＧ碱裂解法原理[１４],应用细菌基因组提取试剂盒提取MA１基因组,应用引物(２７F/１４９２R)扩增１６S r D N A,并对其进行测序(合肥通用生物),测序结果通过b l a s t比对,应用M E G A７ ０制作进化树,从分子水平鉴定MA１.应用引物N KＧF(G G G G T A C C G T A T G A A A A T A G TＧT A T T T C G A G T C T C T A C G)和N KＧR(A A C T G C A G T C C G G T G C T T G T G A A G A T T T C)P C R扩增a p r N (纳豆激酶编码基因),并测序比对,鉴定MA１与纳豆菌(B a c i l l u sS u b t i l i sN a t t o)的关系.１．３㊀菌株筛选方法的研究(１)初筛方法:选用混浊㊁易被菌种分解利用的酪蛋白平板接种MA１,每４h测量菌体直径及水解圈直径,计算圈径比(水解圈与菌体直径之比),分析圈径比与MA１的γＧP G A产量之间的变化关系.(２)复筛方法:分别采用２４孔板㊁４８孔板接种对数期的种子液,孔板接种量和装液量比例同１００m L 摇瓶发酵(７ ５％接种量/３０m L发酵培养基),３７ħ㊁２００r p m发酵培养,每４h取样检测γＧP G A产量,以研究孔板体积对γＧP G A产量的影响,确定多孔板类型.在此基础上,进一步应用２４孔板发酵(３７ħ㊁２００r p m),每４h取样检测γＧP G A产量,考察其与相同条件下摇瓶发酵之间的相关性,确定最佳复筛方法.１．４㊀A R T P诱变选育(１)诱变菌悬液的制备:种子液３７ħ㊁２００r p m培养至对数期,取l m L菌液４５００r p m离心去上清液,加入等量生理盐水重悬菌体,O D６００在０ ８~１ ０之间待用.(２)生长及发酵曲线的测定:将对数期的种子液以７ ５％的接种量接入装液量为３０m L的发酵培养基中(１００m L锥形瓶),３７ħ㊁２００r p m震荡培养,每４h取样测菌浓和γＧP G A产量.(３)A R T P诱变:将８个装有９９０μL生理盐水的E P管依次置于A R T P诱变仪(无锡源清天木生物科技公司)相应凹槽的底部,紫外灭菌２０m i n,将８个铺满１０μL菌液的A R T P载片依次置于A R T P诱变仪相应凹槽中,诱变时间依次为０s㊁１５s㊁３０s㊁４５s㊁６０s㊁９０s㊁１２０s和１６０s(诱变条件:９９ ９９％的高纯氦气,电源功率１２０W㊁气体流量１０S L M㊁照射距离２mm㊁温度＜３０ħ).诱变结束后,震荡洗脱E P管２m i n,使载片上的菌体完全混于生理盐水中,再将E P管置于４ħ冰箱中,保存２h,避免自省对突变损伤进行修复.最后将诱变液稀释一定倍数(原液菌浓度约为１ ０８ˑ１０８c f u/m L),取１００μL分别涂布于固体培养基和酪蛋白平板,每组３个平行,３７ħ培养,记录固体培养基平板上的菌落数量,根据下式计算致死率,并绘制致死率曲线.测量酪蛋白板上的圈径,并计算圈径比.致死率＝N－MNˑ１００％,式中,N为诱变固体平板上的菌落数;M为诱变处理后平板上的菌落数.(４)遗传稳定性研究:将筛选的突变株传代培养５次,检测γＧP G A的产量以考察其遗传稳定性.１．５㊀γＧP G A产量测定参照Z e n g[１５]等报道的方法.１００００r p m离心发酵液１０m i n,取上清液;加入４倍体积冰乙醇,置于４ħ冰箱中过夜,１００００r p m离心１０m i n取沉淀;将沉淀５５ħ下烘干至恒重,加入与发酵液等体积的蒸馏水复溶;溶解完全后,１００００r p m离心１０m i n去除不溶物,将上清适当稀释后测定O D２１６(T UＧ１８１０P C紫外可见光分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司),根据γＧP G A标准曲线计算γＧP G A产量.２㊀结果与分析２．１㊀菌株的鉴定对菌株MA１进行形态学鉴定如图１所示.图１a显示菌株MA１是一种类圆形,边缘呈锯齿状,表面 ２ 安㊀徽㊀工㊀程㊀大㊀学㊀学㊀报第３６卷Copyright©博看网 . All Rights Reserved.褶皱不透明,在菌体中央有粘液并且可产孢子的菌种;对菌株MA １的菌落形态进行革兰氏染色显微观察.图１b 为杆状紫色,证明菌株MA １为革兰氏阳性细菌;对菌株MA １进行生理生化实验的鉴定.图１c 显示在酪蛋白板上出现水解圈,说明该菌株含有蛋白酶,对酪蛋白有降解能力.图１d 显示在纤维蛋白平板上有明显的水解圈形成,说明该菌株产生了纤溶蛋白酶可降解纤维蛋白原以及纤维蛋白.观察结果与枯草芽孢杆菌１６８(模式菌)生理生化特性基本相同[１６],因而,初步推断菌株MA １属于可生产蛋白酶的芽孢杆菌.图１㊀菌株鉴定对菌株MA １进行分子生物学鉴定如图２所示.由图２可见,在约１５００b p 处有一条明显的条带,与预期１６S r D N A 的大小相符.经测序后得到菌株MA １的１６Sr D N A 序列,通过与G e n B a n k 已报道的序列比对,利用MA G E７ ０软件绘制菌株MA １系统发育树(见图３),菌株MA １与枯草芽孢杆菌(B a c i l l u s s u b t i l i s )的同源性高达９９％,由此确定菌株MA １为枯草芽孢杆菌.进一步P C R 扩增该菌株的a pr N 基因,图２b 显示该扩增片段与已报道a p r N 基因序列(１４７３b p )基本一致.测序结果显示,所得N K 基因与N a k a m u r a 报道的a p r N 基因序列(G I :２６２７５６)相同[１７].因为a p r N 基因序列具有高度的特异性,主要产生菌为纳豆枯草芽孢杆菌(B a c i l l u sS u b t i l i sN a t t o ,简称纳豆菌)[１８].因此,可以确定菌株MA １属于纳豆菌.图２㊀MA １１６S r D N A 和a pr N 基因P C R 产物电泳图谱 ３ 第１期刘丹丹,等:A R T P 诱变选育γＧ聚谷氨酸高产菌株快速筛选方法的建立Copyright©博看网 . All Rights Reserved.４ 安㊀徽㊀工㊀程㊀大㊀学㊀学㊀报第３６卷图３㊀菌株MA１１６S r D N A的系统发育树２．２㊀筛选方法确定对数生长期的纳豆菌代谢旺盛,菌体比生长速率最大,细胞的数量呈指数上升,且抗不利环境的能力最强.因此,微生物发酵和诱变选择对数生长期的菌株.发酵液与种子液中的培养基成分㊁接种量及菌龄都不相同,菌株在发酵液中的生长曲线就会受到一定的影响.通过测定菌体生长与γＧP G A产量,可以更直接地观察两者间的关系,对菌株筛选与分析发酵液中γＧP G A生产过程有重要的意义.种子液菌株MA１的生长及发酵曲线如图４所示.由图４可知,菌株前４h增殖缓慢,处于延滞期;４~１２h菌体急剧增殖,比生长速率最大,处于对数期;１４~３６h菌体数量处于动态平衡,此时为稳定期;３６h后菌体数量开始下降,进入衰亡期.为了满足足够的接种量㊁旺盛的菌种生长活力及实验的统一性,后期诱变和发酵选择１０~１２h的菌种液.相对于菌体生长,γＧP G A生产进程明显滞后.细胞生长处于延滞期时无γＧP G A产生,细胞对数期γＧP G A产量增加缓慢,稳定期γＧP G A生产明显加速.说明γＧP G A生产与菌体增殖存在一定关联,这种次级代谢产物与初级产物联系更为紧密.之前的研究结果显示,随菌体的生长纳豆激酶的含量增加,菌体细胞处于对数期,纳豆激酶含量达到最大,菌体生长进程与纳豆激酶等蛋白酶的生产偶联[１３],γＧP G A生产由蛋白酶水解底物产生的代谢物质,由此推断γＧP G A生产与蛋白酶的生产也可能存在一定关联.孔板对菌株γＧP G A产量的影响㊁２４孔板与摇瓶发酵的相关性以及摇瓶发酵γＧP G A产量与菌株酪蛋白平板上的菌圏比之间的变化趋势如图５所示.由图５a显示,２４和４８孔板中γＧP G A产量变化趋势基本相同.其中,２４孔板中的γＧP G A产量明显较高,这是由于纳豆菌是好氧菌,４８孔板内菌液的表面接触氧气较２４孔板小,从而影响菌株生长代谢过程中的溶氧量,因此,２４孔板更有利于菌株MA１的生长代谢[１９],相对于孔板溶氧,摇瓶溶氧效果更好.由图５b显示,２４孔板和同期摇瓶的γＧP G A产量相近(R２＝０ ９７８８),说明２４孔板具有较好的溶氧量[２０],满足γＧP G A生产对溶氧的需求.因此,为提升诱变复筛效率,可用２４孔板培养替代摇瓶培养.图４㊀种子液菌株MA１的生长及发酵曲线Copyright©博看网 . All Rights Reserved.面对诱变出现的大量菌株,使用快速有效的筛选方法是提高诱变选育效率的关键[２１].纳豆菌发酵过程中会产生蛋白酶,在其水解酪蛋白后会在菌落周围形成一个酪蛋白水解圈,水解圈与菌落大小的比值可以间接表示蛋白酶活力的大小,这一方法被广泛用于产酶菌种的初筛[２２Ｇ２３].为了验证前文关于蛋白酶与γＧP G A 生长之间存在关联的推断,菌液涂布于酪蛋白平板后,观察圈径比与γＧP G A 产量之间的变化关系,由图５c 显示,圈径比随着菌体的生长在１６~２４h 迅速增加,与酪蛋白的生长高度偶联,因为次级代谢产物的生产一般滞后于初级代谢产物,因此γＧP G A 生产曲线相对于酪蛋白生产同步后移,且生长趋势基本相同,间接证明了菌株MA １蛋白酶的生产与γＧP G A 产量可能存在关联.图５㊀孔板对菌株γＧP G A 产量的影响、２４孔板与摇瓶发酵的相关性以及摇瓶发酵γＧP G A 产量与菌株酪蛋白平板上的菌圏比之间的变化趋势２．３㊀A R T P 诱变选育致死率是获得优良突变株的关键参数.A R T P 辐照MA １的致死曲线如图６a 所示.由图６a 可知,诱变致死率随诱变时间的增加在不断升高,诱变时间为９０s 时,致死率达到８８ １６％.诱变３００s 时,致死率为１００％.由于突变具有随机性,正负突变与诱变时间无明确的规律可循,但因为诱变时间越长,会使D N A 链和氢键断裂的程度㊁胸腺嘧啶二聚体形成的程度及宿主修复后造成的差错程度加大,从而造成菌株损伤加重[２４],与出发菌株相比变化更大.因此,为提高突变株筛选效率,诱变时间选为２７０s.经过５轮诱变(出发菌株为实验室前期筛选菌株MA １),在２３株菌株中筛选获得８株相对高产的突变株(见图６b ).其中,３株为正突变株,m ３的γＧP G A 产量最高,达到９ ２２g /L ,较出发菌株提高了２２ ０３％.诱变菌的产量提高率相较于张浩[２５]诱变菌产量提高的４２ １１％偏低,但其出发菌株的γＧP G A 产量仅为本实验出发菌株产量的十分之一.对突变株m ３进行连续５次发酵后,其产量在９ ２g /L 左右(见图６c ),说明突变体遗传稳定性较好[２６].分析２３株突变体的圈径比与其γＧP G A 产量之间的关系,如图６d 所示,样本量为２４个(包括出发菌株),圈径比和γＧP G A 产量之间R ２值为０ ６４.一般而言,当样本量超过９个,R ２值达到０ ７,或当样本量超过２５个,R ２值达到０ ４,都可认为两变量间存在相关性[２７].据此,我们认为菌株圈径比和γＧP G A 产量存在相关性,为基于酪蛋白透明圈筛选γＧP G A 高产菌株提供了依据.３㊀结论研究在筛选到一株高产γＧP G A 纳豆菌的基础上,系统分析酪蛋白板初筛㊁多孔板复筛和摇瓶复筛,发 ５ 第１期刘丹丹,等:A R T P 诱变选育γＧ聚谷氨酸高产菌株快速筛选方法的建立Copyright©博看网 . All Rights Reserved.６ 安㊀徽㊀工㊀程㊀大㊀学㊀学㊀报第３６卷图６㊀A R T P辐照MA１的致死曲线㊁诱变菌株的γＧP G A产量㊁突变菌株的遗传稳定性以及菌株γＧP G A 产量与其在酪蛋白平板上的圈径比之间的关系现多孔板复筛与摇瓶复筛结果一致.其中,多孔板复筛与酪蛋白平板形成的纳豆菌的圈径比具有线性关联,这为直接应用酪蛋白平板初筛代替原用的平板初筛加多孔板复筛提供了依据.基于酪蛋白平板的透明圈快筛方法,从A R T P辐照的菌群中筛选出一株γＧP G A高产株,产量较出发菌株提升了２２％,且遗传稳定性良好,表明酪蛋白平板的透明圈快筛方法有效,这大幅压缩了筛选的时间,显著提升了菌株诱变选育的效率.参考文献:[１]㊀F O P P E R MA N NＧS A N I O,A S T E I N BÜC H E L．O c c u r r e n c e,f u n c t i o n sa n db i o s y n t h e s i so f p o l y a m i d e s i n m i c r o o r g a nＧi s m s a n db i o t e c h n o l o g i c a l p r o d u c t i o n[J]．N a t u r w i s s e n s c h a f t e n,２００２,８９(１):１１Ｇ２２．[２]㊀M M I T S U I K I,A M I Z U N O,H T A N I MO T O,e ta l．R e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h ea n t i f r e e z ea c t i v i t i e sa n dt h ec h e m i c a l s t r u c t u r e s o f o l i g oＧa n d p o l y(g l u t a m i c a c i d)s[J]．J．a g r i c．f o o dC h e m．,１９９８,４６(３):８９１Ｇ８９５．[３]㊀CJ I A,W HU A N G,XT A N G,e t a l．A n t i f r e e z e a c t i v i t y o fγＧP o l yg l u t a m i c a c i da n d i t s i m p a c t o n f r e e z i n g r e s i s t a n c eo f y e a s t a n d f r o z e n s w e e t d o u g h[J]．C e r e a l c h e m i s t r y,２０１６,９３(３):３０６Ｇ３１３．[４]㊀K Y O K O I G AWA,M S A T O,KS O D A．S i m p l e i m p r o v e m e n t i n f r e e z eＧt o l e r a n c e o f b a k e r s＇y e a s tw i t h p o l yＧg a mm aＧg l uＧt a m a t e[J]．J o u r n a l o f b i o e n c e&b i o e n g i n e e r i n g,２００６,１０２(３):２１５Ｇ２１９．[５]㊀赵凯亚,姬晓月,沈亚鹏,等．聚谷氨酸对油条特性与品质的影响[J]．河南工业大学学报,２０１７,３８(４):７９Ｇ８４．[６]㊀徐欢欢,张红兵,李会宣,等．常压室温等离子体技术在微生物诱变中的应用进展[J]．生物技术进展,２０２０,１０(４):３５８Ｇ３６２．[７]㊀张雪,张晓菲,王立言,等．常压室温等离子体生物诱变育种及其应用研究进展[J]．化工学报,２０１４,６５(７):２６７６Ｇ２６８４．[８]㊀RSZ O U,SL I,LLZ HA N G,e t a l．M u t a g e n e s i so f r h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e su s i n g a t m o s p h e r i c a n dr o o mt e m p e r a t u r e p l a s m a t r e a t m e n t f o r e f f i c i e n t p r o d u c t i o no f c o e n z y m e q１０[J]．J o u r n a l o f b i o e n c e&b i o e n g i n e e r i n g,２０１９,１２７(６):６９８Ｇ７０２．[９]㊀杨佩斯,李祝,唐婧红．常压室温等离子体诱变选育高产微生物絮凝剂黑曲霉菌株[J]．中国酿造,２０２０,３９(１):６１Ｇ６５．[１０]殷娜,严小玉,马珊．常压室温等离子体诱变选育高产酸植物乳杆菌[J]．中国酿造,２０２０,３９(１):７７Ｇ８１．[１１]方佳丽,牛安娜,常尊学,等．腈水解酶高通量筛选方法的研究进展[J]．沈阳药科大学学报,２０２０,３７(８):７４２Ｇ７４９．[１２]陈玲,涂国全．透明圈法筛选柚苷酶高产菌株[J]．江西科学,２００７(１):２７Ｇ２９．[１３]G N I E,ZZ HU,FL I U,e t a l．C oＧp r o d u c t i o no f n a t t o k i n a s e a n d p o l y(γＧg l u t a m i c a c i d)u n d e r s o l i dＧs t a t e f e r m e n t a t i o nuＧCopyright©博看网 . All Rights Reserved.s i n g s o y b e a na n d r i c eh u s k [J ]．B r a z i l i a na r c h i v e s o f b i o l o g y a n d t e c h n o l o g y ,２０１５,５８:７１８Ｇ７２４．[１４]庞建,刘占英,郝敏．革兰氏阳性细菌基因组D N A 提取方法的比较及优化[J ]．微生物学通报,２０１５,４２(１２):２４８２Ｇ２４８６．[１５]W Z E N G ,G GC H E N ,Y KZ HA N G ,e t a l ．S t u d i e so n t h eU Vs p e c t r u mo f p o l y (γＧg l u t a m i ca c i d )b a s e do nd e v e l o pＧm e n t o f a s i m p l e q u a n t i t a t i v em e t h o d [J ]．I n t ．J ．B i o l ．M a c r o m o l ．,２０１２,５１(１):８３Ｇ９０．[１６]葛芸,汤斌,李松．纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶发酵工艺控制及纤溶酶分析[J ]．食品与发酵工业,２０１９,４５(１６):１７６Ｇ１８０,１８６．[１７]T N A K AMU R A ,Y Y AMA G A T A ,EI C H I S H I MA．N u c l e o t i d e s e q u e n c eo f t h e s u b t i l i s i nN A T g e n e ,a pr n ,o fb a c i l l u s s u b t i l i s (n a t t o )[J ]．B i o s c i b i o t e c h n o l b i o c h e m ,２０１４,５６(１１):１８６９Ｇ１８７１．[１８]T W K U ,R L T S A I ,T M P A N．As i m p l ea n dc o s t Ｇs a v i n g a p p r o a c ht oo p t i m i z e t h e p r o d u c t i o no f s u b t i l i s i nN A Tb ys u b m e r g e d c u l t i v a t i o no f b a c i l l u s s u b t i l i sn a t t o [J ]．J o u r n a l o f a g r i c u l t u r a l a n d f o o d c h e m i s t r y ,２００９,５７(１):２９２Ｇ２９６．[１９]N K O N G K L OM ,ZPS H I ,Y C H I S T I ,e t a l ．E n h a n c e d p r o d u c t i o no f p o l y Ｇg a mm a Ｇg l u t a m i c a c i db y ba c i l l u s l i c h e n i f o r Ｇm i s t i s t r １０１０w i t he n v i r o n m e n t a l c o n t r o l s [J ]．A p p l i e db i oc h e m i s t r y a n db i o t e c h n o l o g y ,２０１７,１８２(３):９９０Ｇ９９９．[２０]芦慧,赵淑娥,张云伟．２４孔板发酵法测定地表水和废水中粪大肠菌群的研究[J ]．环境科学与管理,２０１４,３９(５):１２２Ｇ１２４．[２１]贾啸静,马静,胡紫薇,等．原生质体诱变及高通量筛选选育链霉素高产菌株[J ]．中国抗生素杂志,２０２０(９):８７８Ｇ８８２．[２２]BK A V I T HA ,V T HA N K AMA N I ．I s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f an o v e l p r o t e a s e e n z ym e f r o m b a c i l l u s c e r e u s [J ]．R e s e a r c h j o u r n a l o f b i o t e c h n o l o g y ,２０１０,５(４):３９Ｇ４５．[２３]李善仁,蔡海松,林新坚．豆粕发酵制备大豆肽菌株的筛选[J ]．微生物学杂志,２００９,２９(１):８６Ｇ８９．[２４]高春芳,姜红,武国梁．紫外照射对血液中D N A 的影响研究[J ]．微量元素与健康研究,２０１７,３４(１):５７Ｇ５８,６１．[２５]张浩,杜万根,舒旭晨．解淀粉芽孢杆菌P I １４２产γγ聚谷氨酸发酵条件优化[J ]．淮南师范学院学报,２０１８,２０(２):１４２Ｇ１４８．[２６]陈婷婷．产L Ｇ异亮氨酸突变株的生化特性鉴定及发酵条件研究[D ]．福州:福建师范大学,２０１６．[２７]彭娟．六西格玛管理[M ]．北京:中国计量出版社,２００８．C o n s t r u c t i o no f aM e t h o d f o rR a p i dS c r e e n i n g o f γＧP o l y g l u t a m i cA c i d Ｇp r o d u c i n g St r a i n sB a s e d o nA R T P L I U D a n d a n ,Z A N G Y i p e n g ,WA N GL i ,WA N G M e n g m e n g ,Y U E W e n j i n ,Y U C h e n r u i ,C H E NJ u n l i u ,N I EG u a n g ju n ∗(S c h o o l o fB i o l o g i c a l a n dF o o dE n g i n e e r i n g ,A n h u i P o l y t e c h n i cU n i v e r s i t y ,W u h u２４１０００,C h i n a )A b s t r a c t :γＧp o l y g l u t a m i ca c i d (γＧP G A )i sab i o p o l y m e r p r o d u c e db y m i c r o b i a l f e r m e n t a t i o n ,w h i c hi s w i d e l y u s e d i n f o o d i n d u s t r y d u e t o i t s s t r o n g h e a l t h c a r e f u n c t i o n ．H o w e v e r ,i t i s d i f f i c u l t t o s c r e e no u t a d e s i r e dm u t a n t f o r e f f i c i e n t p r o d u c t i o no f γＧP G Ad u e t o l o we f f i c i e n c y o f s c r e e n i n g m e t h o d s ．I n t h i s p a Ｇp e r ,a s t r a i nw i t hh i g h y i e l do f γＧP G A w a s s c r e e n e do u t a n d i d e n t i f i e db y m o r p h o l o g y ,b i o c h e m i s t r y an d m o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o n s ．T h er e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h es t r a i n i sB a c i l l u ss u b t i l i sn a t t o ．A c c o r d i n g t ot h e p r o d u c t c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s t r a i n ,c a s e i n p l a t e p r i m a r y s c r e e n i n g ,p o r o u s p l a t e r e Ｇs c r e e n i n g a n ds h a k e f l a s k r e Ｇs c r e e n i n g w e r e c a r r i e do u t r e s p e c t i v e l y ．I tw a s f o u n d t h a t t h e s c r e e n i n g r e s u l t sw e r e c o n s i s t e n t ,a n d t h e r ew a s a l i n e a r c o r r e l a t i o nb e t w e e n t h e c i r c l e Ｇd i a m e t e r r a t i oo f c a s e i n p l a t e i n p r i m a r y s c r e e n i n g a n dγＧP G A y i e l d o f p o r o u s p l a t e r e Ｇs c r e e n i n g ．B a s e d o n t h i s ,A R T Pw a s u s e d t o i r r a d i a t eB a c i l l u s s u b t i l i s n a t t o ,a n dc a s e i n p l a t em e t h o dw a so n l y u s e dt o q u i c k l y s c r e e nas t r a i nw i t hh i g h y i e l do fγＧP G A ,t h e y i e l dw a s ２２％h i g h e r t h a nt h a to f t h eo r i g i n a l s t r a i n ,a n dt h e i n h e r e n t y i e l dw a ss t a b l e ,i n d i c a t i n g t h e t r a n s p a r e n t c i r c l e f a s t s c r e e n i n g m e t h o d o f c a s e i n p l a t ew a s e f f e c t i v e ,g r e a t l y r e d u c e d t h e s c r e e n i n gt i m e ,a n d s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d t h e e f f i c i e n c y i n t h em u t a g e n e s i s o fm i c r o b i a l s t r a i n ．K e y wo r d s :γＧp o l y g l u t a m i c a c i d (γＧP G A );b a c i l l u s s u b t i l i sn a t t o ;s t r a i ns c r e e n i n g ;a t m o s p h e r i c a n d r o o m t e m p e r a t u r e p l a s m a (A R T P )７ 第１期刘丹丹,等:A R T P 诱变选育γＧ聚谷氨酸高产菌株快速筛选方法的建立Copyright©博看网 . All Rights Reserved.。