免疫组织化学技术标准化及常见问题的处理

免疫组化技术要点与常见问题在免疫组化过程中，为了更好的说明问题和查找原因，最好设置阳性对照片（已知的高表达相应抗原的组织）和阴性对照组织片（不加一抗但是加二抗系统/不加任何抗体两组），所有操作过程应完全一致。

染色弱或者没有染色（按照先后顺序，先排除一些简单的原因）:可能原因解决办法试剂使用顺序错误或者漏加试剂重复实验，保证每一步均正确二抗和一抗不匹配选择匹配的二抗底物和酶不匹配选用匹配的底物酶失活换用新的酶（将酶和底物混合，看是否显色？）组织中没有待测抗原表达或者表达水平低使用阳性对照片抗体浓度太低增加抗体浓度.最好使用不同浓度的抗体，决定最佳浓度抗体孵育时间不充分延长抗体孵育时间底物孵育不充分延长底物孵育时间抗体储存不当，导致失效将抗体分装，低温保存 (-20 to -70 C) ，避免反复冻溶。

稀释抗体在4保存1-2周，避免时间过长。

或者根据说明书进行恰当的保存一抗失效换用新的一抗二抗失效换用新的抗体（能否成功与其它一抗配合？）脱石腊不充分延长脱腊时间或者换用新的二甲苯组织固定不充分或者不当增加固定时间或者改用不同的固定方法组织固定过度减少固定时间。

若已固定过度，则需使用正确的或者推荐的抗原修复方法复染试剂与底物系统不匹配选择正确的复染试剂（不加复染剂，看是否有组织染色？）封片剂不正确选择正确的封片剂染色背景高:可能原因解决办法洗片不充分每步之间至少洗片3次组织含有内源性的酶，如HRP/AP 在加入一抗之前使用3％的H2O2甲醇封闭内源性HRP 活性，使用左旋咪唑(levamisole)溶液阻断内源性AP活性。

或者换用葡萄糖氧化酶系统组织含有内源性生物素（尤其是肾脏、肝和脾）在加入一抗之前，血清封闭之后使用avidin/biot in阻断试剂。

或者避免使用biotin-avidin系统或改用IF方法(直接将酶和底物加到组织片上，看是否显色？)一抗的非特异性结合或者抗体浓度过高增加一抗的稀释度二抗和组织非特异性结合使用与二抗来源相同的正常动物血清（一般是1 0％）封闭，必要时可以将血清浓度加大组织固定不充分，抗原扩散Increase duration of postfixation使用小鼠来源的二抗检测小鼠组织在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂干片染色过程中避免出现干片现象染色强度过大:可能原因解决办法一抗或者二抗浓度过高降低抗体浓度。

免疫组化常见问题的处理当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。

对照/标本无染色①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。

③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。

比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。

④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。

⑥检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。

⑦检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。

需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。

⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。

⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。

弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。

②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。

一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。

如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。

就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。

2、免疫组化最大的优势是定位和定性。

相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。

尤其对于有些因子的转位研究十分有用。

3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。

免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。

4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。

阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。

前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。

5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。

如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。

当然也不能做假阳性或假阴性结果。

6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。

我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。

失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。

免疫组化经验总结第⼀部分步骤及常见问题免疫组化技术流程及常见问题解析（修改版）说明：加粗的字体部分是我认为要注意的地⽅和提出的问题，⽽红⾊字体部分表⽰还不太确定的第⼀部分载玻⽚与盖玻⽚的处理：载玻⽚与盖玻⽚重铬酸钾浸泡1-2天，⽔清洗直到没有颜⾊为⽌，放⼊⽆⽔⼄醇中，⽤纱布擦⼲（如需开展原位杂交，还需将玻⽚240℃烤2h），载玻⽚涂上多聚赖氨酸，37度烘⼲，备⽤第⼆部分冰冻切⽚前期处理1冰冻切⽚组织处理。

肿瘤组织从体内取出后，迅速放于液氮中冰冻，然后放于－８０度保存，切⽚时先⽤OCT 固定（尽量减少⽓泡⽣成），-20度20-30分钟固定好后即可切⽚（最好时间长⼀点，时间太短容易使切⽚卷起，也使切⽚不均匀）。

2切⽚，切⽚时要慢，稳⼀点，切好后⽤涂有多聚赖氨酸的载玻⽚粘取切下的组织⽚，粘的时候有⼀个向内拉伸的动作，这样可以使组织⽚充分展开。

⽚⼦的厚度⼀般为10um,也有的要切30um（根据需求调整）。

切好的⽚⼦⽴即放⼊4﹪的新配的多聚甲醛中处理8-10分钟(或在丙酮中固定10S，具体⽤什么固定要看⼀抗的要求)3 PBS中洗⼀下（约2分钟）去掉残留的多聚甲醛。

（丙酮切⽚的话省去本步骤）（从冰箱中取出的⽚⼦最好在PBS中浸泡2分钟，再往下做。

如果打孔不充分，可以在PBS 中加⼊triton x-100洗三次。

再⽤PBS洗⼏次，除去triton x-100）4 ⽚⼦切好后可放于37度烘⼲，但是时间不要太长，2-3⼩时即可，或者室温风⼲，然后放于-20度或-80度冰箱可长期储存。

但是⽤丙酮或有机溶剂固定的⽚⼦上如果还有其他有机溶性的染料的话建议尽快做掉，因为有机溶剂在长期储存中（⼀个⽉）缓慢作⽤的话，也会使染料变得模糊。

第三部分加抗体5 10％正常⼭⽺⾎清（PBS稀释，可加少量的triton x-100打孔），封闭（依⼆抗的来源⽽定），室温孵育30分钟。

6倾去⾎清，擦⼲各组织之间的⽔滴，防⽌有⽔滴粘连。

滴加适当⽐例稀释的⼀抗1：100左右或⼀抗⼯作液，37℃孵育1~2⼩时或4℃过夜，4℃过夜后需在37℃或室温复温30分钟。

免疫组织化学技术常见问题分析及对策阳性对照标本和待测标本均无着色1. 可能原因分析1.1 抗体选择不当，不适合做IHC。

抗体保存不当，超过有效期或反复冻融导致抗体效价过低或失活。

1.2 抗体工作浓度过低，特别是一抗的浓度过低。

同时也有可能是抗体孵育时间过短、温度偏低。

1.3 二抗与一抗种属不匹配，如一抗为鼠源性抗体，二抗没有使用抗鼠的抗体。

1.4 贴片法IHC染色有可能是抗体流失导致切片干燥。

1.5 石蜡切片未进行抗原修复或酶消化等前处理时间过长破坏了待检测抗原决定簇。

1.6 缓冲液PH值不当或含有酶活性抑制剂，如叠氮钠是过氧化物酶活性抑制剂。

1.7 DAB显色时间过短；显色底物不应该含有叠氮钠；在DAB显色时，显色液应该新鲜配制。

1.8 复染、脱水和封片剂的选择与显色系统不匹配。

1.9 阳性对照标本选择不合适，该标本不含有待检测抗原或与所用一抗试剂不匹配。

2. 处理方法2.1 确认使用抗体的各类抗体试剂的正确保存方法，保证其效价。

如果确认抗体已经失效，及时更换。

2.2 检查二抗是否与一抗种属匹配。

2.3 适当提高抗体浓度，优化孵育条件。

保证抗体孵育箱温度为37℃，或增加孵育时间，如4℃孵育48小时。

2.4 标本孵育盒平稳放置，防止孵育液流失。

2.5 参考文献选择标本类型适合的蛋白酶消化方法和抗原修复处理方式与条件。

2.6 调节缓冲液至对应正常的PH值，保证不含酶活性抑制剂。

2.7 重新配制DAB显色液，并保证配制方法、浓度、正确、有效，适当延长显色时间。

2.8 选择正确的阳性对照切片。

阴性对照标本未着色，而阳性对照标本和待测标本呈弱阳性1. 可能原因1.1 标本固定方式不正确，如固定不及时、固定液量太少、固定液失效或组织处理方式不当。

1.2 抗体保存不当，超过有效期或反复冻融导致抗体效价过低或失活。

1.3 抗体浓度太低，特别是一抗的浓度过低，或者抗体孵育时间过短、温度偏低。

1.4 贴片法染色时标本上含有缓冲液，导致抗体浓度稀释。

免疫组化实验遇到的问题分析及改进方法1石蜡切片在染色过程中出现脱片现象1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

2边缘效应1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。

解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。

解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。

用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

3产生组织切片非特异性染色1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。

这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。

这是最重要的一条；2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5）DAB孵育时间过长或浓度过高；6）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；7）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

4免疫组化染色呈阴性结果1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。

有人做过实验，这是最佳的时间和次数。

若不行，还可高压修复；3）组织切片本身这种抗原含量低；4）血清封闭时间过长；5）DAB孵育时间过短；6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；7）开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

免疫组织化学技术常见问题分析及改进措施目的：分析免疫组织化学技术中常见问题，并提出相应改进措施。

方法：以2010年1月-2012年12月笔者所在科收治的80例患者病史资料为依据，根据切片方法不同分为A、B两组，比较两组切片质量及常见问题。

结果：本次研究的患者中A组有15例切片出现质量问题。

改进操作后的患者切片即B组均清晰地观察到阳性细胞。

结论：免疫组织化学技术环节多、问题多，应提出有针对性地改进措施，不断完善。

标签：免疫组织；化学技术；改进措施要进行免疫组织化学检测，必须首先有良好的免疫组化学切片。

这一制作过程相对复杂，有许多环节，故而容易出现问题，而每一个环节出错都将影响最终结果。

所以相关医务技术人员应具备扎实的技术功底，把好每一关，最终得出准确的检测结果。

笔者结合自身工作经验，对常见问题的改进做出分析，现报告如下。

1 资料与方法1.1 一般资料分析笔者所在科2010年1月-2012年12月对80例患者进行病理分析的诊断结果数据，患者中有15例需要鉴别低分化癌与肉瘤，20例需要鉴别转移癌的性质，13例需要分析肿瘤细胞来源以及其分化程度，10例要检测患者组织耐药基因，12例为检测肿瘤组织分化活性，10例是肿瘤患者治疗后的回访检测。

根据切片方法不同分为A、B两组。

经过对患者组织切片的临床观察，A组鉴别低分化癌与肉瘤的患者中有4例确诊为低分化癌，之后接受化疗，2例为肉瘤的患者则采取手术切除治疗；11例患者已经发生淋巴及血液转移；肿瘤细胞来源及分化程度分析的患者中有6例是由癌细胞转移发病，2例为原发癌，均为高分化癌；5例经过治疗后的患者MDR1耐药基因表达明显升高；检测肿瘤组织分化活性的6例患者中有4例为G1，分化活性较低，2例G2，即中分化；回访检测的患者中3例复发，2例目前无变异。

B组6例确诊为低分化癌，3例为肉瘤；9例患者已经发生淋巴及血液转移；3例是由癌细胞转移发病，2例为原发癌；5例治疗后的患者耐药基因表达升高；3例分化活性较低，3例中分化；回访检测中3例复发，2例无变异。

免疫组化常见问题及对策尊敬的各位代理，大家好！现在我就免疫组化常见问题及对策向大家做一简要介绍。

我公司所生产的抗体主要有两大用途，一个是免疫组化，另一个就是western blotting. 免疫组织化学是应用抗原和抗体结合的原理，检测细胞内多肽、蛋白质等大分子物质的分布。

这种方法的特异性强、敏感度高、发展迅速、应用广泛，成为生物学和医学众多学科的重要研究手段。

作为初次使用本公司的抗体从事免疫组化的客户可能遇到许多问题，大体归纳起来，主要有非特异性着色﹑着色部位不对﹑假阳性﹑无阳性﹑阳性弱五大类以及其他一些小问题。

现在就以上几点分别说明。

一、非特异性着色非特异性着色就是在理论着色区域外的着色，这种着色与背景是有区别性的。

造成非特异性着色的原因主要有：1)标本原因，肝肾内源性生物素含量高，与SABC结合导致非特异性着色，皮肤肺组织胶原含量高，由于胶原带负电荷，易吸附试剂导致非特异性着色。

2)切片干涸导致的边缘效应。

3)抗体浓度过高。

4)组织在处理中存在出血区域坏死区。

5)洗涤不充分。

6)显色剂氧化，显色时间长。

解决方法：1)一抗应做浓度梯度，选择阳性强背景好，信躁比高的浓度，做为抗体实验浓度，二抗浓度和时间一般不变。

2)稳定实验条件，严格按操作说明进行。

3)在实验中应保持切片始终处于水平状态避免抗体流失，从而使切片使切片干涸。

4)在实验中应将试剂覆盖面积大于切片面积5)洗涤要充分，在背景十分深时，可用37℃预温的PBS浸泡6)显色剂的配制要防止氧化，尤其是显色剂的配制是使用的容器，最好是灭菌过的。

显色时间应在显微镜下严格控制。

二、着色部位不对着色部位不对有三种情况。

情况一、本是胞浆抗原，但实验显示结果却在胞核有着色。

原因及解决办法：1)修复时间过长，修复条件十分严苛，这时应降低反应强度，减少修复时间。

2)组织在二甲苯中静置时间过长，这时应更换标本。

3)抗体中含有抗核蛋白抗体，这种情况已不多见。

4)标本原因，标本处理不慎会导致总在同一个地方出现着色。

免疫组化常见问题及其解决办法1、一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。

一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

（3）其实，我更赞同后一种说法，由于我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。

2、切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。

消失这种现象的缘由有：（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的缘由之一。

解决方法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己试验室的抱负工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简洁的按说明书进行染色。

（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决方法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，准时提示，避开因遗忘而造成时间延长。

现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要依据染色结果进行调整。

（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。

配制好的DAB不应存放时间太长，由于在没有酶的状况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种好像节省的方法是不行取的。

DAB的显色最好在显微镜下监控，达到抱负的染色程度时马上终止反应。

不过当染色片太多时或用染色机时，这样做好像不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避开显色时间过长。

（4）组织变干：修复液溢出后未准时补充液体、染色切片太多、动作太慢、遗忘滴液、滴液流失等都是造成组织变干的缘由。

解决的方法是操作要仔细认真，采纳DAKO笔或PAP Pen在组织四周画圈，可以有效的避开液体流失，也能提高操作速度。