EGFP在肿瘤细胞中的表达分析彭超222008371042030西南大学生命科学学院，重庆 400715摘要：肿瘤基因靶向治疗已经成为目前肿瘤治疗研究最活跃的领域之一，其目的是在不损伤正常细胞的前提下，进行选择性杀伤或抑制肿瘤细胞。
目前已有大量靶分子被分离和鉴定，如端粒酶、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶等，其中端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤最广谱的分子标记，在绝大多数恶性肿瘤中被激活，而在正常体细胞中一般为阴性表达。
近年来研究人员利用人端粒酶逆转录酶（human telomerase reversetranscriptase，hTERT）基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中高效表达的特点，构建用hTERT 启动子调控其它抗肿瘤基因的表达载体，靶向破坏肿瘤细胞已取得了较大进展。
由于慢病毒载体具有可感染细胞并整合DNA序列的、可转移较大的基因片段等优点。
本研究通过构建由hTERT 基因启动子介导绿色荧光蛋白基因表达的慢病毒载体, 并转染肿瘤细胞, 检测该启动子在端粒酶阳性的肿瘤细胞中eGFP 的表达情况。
关键词：eGFP hTERT 肿瘤TOPO克隆脂质体介导法第一部分文献综述靶向诱导肿瘤细胞凋亡近年来研究发现，肿瘤的形成与凋亡功能的失调密切相关，提出肿瘤的发生可能是肿瘤细胞异常增殖和其凋亡调控功能受到抑制共同作用的结果。
一些研究人员利用hTERT 启动子的肿瘤特异性，在其下游连接凋亡相关的抑癌基因或细胞因子，导入端粒酶阳性的肿瘤细胞，从而靶向诱导肿瘤细胞发生凋亡，已取得良好效果[7]。
Caspases 是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，在细胞的凋亡过程中发挥重要作用，其中Caspase-3是细胞凋亡的执行者。
Yang 等[8]利用构建的hTERT/re-Caspase-3系统，同时转染端粒酶阳性的鼻咽癌细胞CNE1、结肠癌细胞HRT-18、胃癌细胞MGC 和端粒酶阴性的正常上皮细胞Hacat，孵育48h 后，荧光显微镜下观察，肿瘤细胞呈典型的核固缩、核碎裂、核溶解的凋亡形态；流式细胞仪分析显示，三种端粒酶阳性的肿瘤细胞（CNE1、HRT-18和MGC）凋亡率为15%~20%，而端粒酶阴性的Hacat仅为1.5%~3.5%；动物试验将hTERT/re-Caspase-3直接注射在裸鼠肿瘤内，以不含Caspase-3的hTERT/SEAP 为对照，连续7d 后观察发现，hTERT/re-Caspase-3能显著抑制裸鼠肿瘤的生长，证实了hTERT/re-Caspase-3的体内外靶向抗肿瘤作用。
Jacob 等[9]构建的hTERT 基因启动子驱动的促凋亡基因TRAIL的表达载体，也同样证实了其可靶向性诱导端粒酶阳性的胰腺癌和结肠癌细胞发生凋亡。
靶向介导自杀基因抑瘤作用自杀基因又称前药敏感基因，将自杀基因导入肿瘤细胞，可将无毒性药物前体在肿瘤细胞内代谢为毒性产物，进而杀伤肿瘤细胞。
常见的自杀基因包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)基因、细胞色素P450 基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因、大肠杆菌硝基还原酶(NTR)基因等，其中TK 和CD 研究最多。
体内外实验证实[10]，利用肿瘤特异性hTERT 启动子介导自杀基因转染肿瘤细胞，不仅能靶向杀死被转染的肿瘤细胞，还可通过旁观者效应杀死周围未被转染的肿瘤细胞，以及远处扩散转移的肿瘤细胞也有凋亡现象。
TK 可将无毒性的前体药物更昔洛韦（ganciclovir，GCV）磷酸化为三磷酸更昔洛韦（GCV-TP），抑制细胞DNA 聚合酶，从而阻断核酸代谢途径，导致细胞死亡。
Tang 等[11] 构建hTERT 启动子调控HSV-TK基因的表达质粒(pGL3-hTp-tk)，以pGL3-sv40-tk为对照，同时转染端粒酶阳性的肺癌细胞A549 和端粒酶阴性的正常成纤维细胞MRC-5，发现用GCV 处理后，pGL3-sv40-tk同时抑制A549 细胞和MRC-5细胞的生长，而pGL3-hTp-tk仅对A549 细胞有抑制作用，对MRC-5 细胞无影响。
NTR 可将CB1954———单功能烷基化合物转化为剧烈的双功能烷基化合物，进而引起DNA 交联。
Bilsland 等[12]构建hTERT 启动子调控NTR 基因的载体，转染宫颈癌、卵巢癌等七种肿瘤细胞和四种正常细胞，Westernblot 分析其仅在肿瘤细胞中表达，且使肿瘤细胞对CB1954 的敏感性增加18 倍，而正常细胞却不受影响。
近年双自杀基因联合治疗逐渐成为研究热点，Kong 等[13]构建hTERT 启动子调控下的双自杀基因（CD-TK融合基因）表达载体，以hTERT-TK作对照，转染卵巢癌细胞3AO、正常卵巢上皮细胞和人胚肺成纤维细胞，结果显示与单纯hTERT-TK/GCV 系统相比，联合CD-TK/5-FC+GCV 双自杀基因系统对端粒酶阳性的3AO 细胞的杀伤作用显著增强，而对端粒酶阴性的正常卵巢上皮细胞和人胚肺成纤维细胞则无杀伤作用。
动物实验也证实了CD-TK融合基因明显的肿瘤抑制作用。
端粒酶和hTERT 启动子端粒是真核生物线性染色体末端的特殊结构，由TTAGGG 重复DNA 序列和端粒结合蛋白构成。
端粒酶是位于细胞核内依赖于RNA 的逆转录DNA聚合酶, 主要功能是合成重复核苷酸序列并将其添加至染色体末端以维持端粒长度，使细胞无限增殖，细胞因此获得永生化，而永生化是细胞癌变的实质。
维持端粒酶活性的必需集团有两个：一是组成性表达的人端粒酶RNA 组分（human telomerase RNA，hTR），二是人端粒酶逆转录酶（human telomerase reversetranscriptase，hTERT）。
hTR 基因在所有细胞均有表达，而hTERT 基因仅在大多数肿瘤和永生化细胞系中高表达，在成熟分化的正常体细胞中其表达处于关闭状态，因此端粒酶基因特异地转录并表达于多数肿瘤细胞中，而在正常组织细胞中检测不到端粒酶的活性形式。
hTERT 作为端粒酶活性的主要调控亚单位,它的表达与端粒酶活性呈正相关。
hTERT 基因被克隆出后,日益引起学者重视,已证实hTERT 与肿瘤的关系最为密切，其在转录水平调控端粒酶的激活与表达，是决定端粒酶活性的重要因子[4]，而hTERT 高表达的直接原因是由于其启动子在肿瘤细胞内完全开启，因此hTERT 启动子是肿瘤特异性启动子，是控制肿瘤细胞恶性程度的开关。
它的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显高于阴性细胞，研究表明利用端粒酶hTERT 启动子靶向基因治疗可选择性地杀死端粒酶阳性的肿瘤细胞，而对端粒酶阴性的正常细胞则无影响。
目前国内外学者已经普遍认为，hTERT 启动子是一新型的、具有肿瘤选择性的启动子，是理想的肿瘤基因治疗的靶点。
端粒酶与肿瘤诊断自从1994年, Kim开始应用一种基于PCR的灵敏的端粒酶检测方法TRAP来探测人体组织中的端粒酶活性后[ 8 ] , Shay等[ 9 ]总结了各种恶性肿瘤组织、癌旁组织、癌前组织及良性肿瘤组织中的端粒酶活性,发现90%的恶性肿瘤组织的端粒酶活性呈阳性,而癌旁组织的阳性率只有6% ,良性肿瘤和癌前组织的阳性率为14% ,在正常组织中,除少数种类外,其阳性率均为0,可见端粒酶活性是恶性肿瘤的一种标志,其作为肿瘤标志广泛性和明确性要优于Ki267和M IB1。
因此,端粒酶检测,特别是精确定量将有助于肿瘤良恶性的判断。
实施定量PCR技术、细针抽吸等方法与传统的TRAP相结合检测端粒酶,其结果在灵敏度与特异度方面更加可靠,使得利用端粒酶对肿瘤进行诊断或分期的可行性提高。
然而,端粒酶作为肿瘤诊断的标志物也有一定的局限性。
由于人体的生殖细胞、再生细胞也有一定的端粒酶表达;约20%的肿瘤不表达端粒酶,正常鼻咽黏膜中端粒酶可呈阳性,故不宜用于鼻咽原位癌诊断[ 10 ] ;所以利用端粒酶作为肿瘤的诊断乃至治疗靶点还有待进一步商榷。
第二部分正文引言：为了构建由人端粒酶逆转录酶( hTERT) 基因启动子调控eGFP 报告基因的慢病毒载体, 观察eGFP 在肿瘤细胞中的表达情况。
我们将用TOPO克隆的方法将eGFP序列转到pLenti6/V5D-Top质粒上；再用hTERT 基因启动子取代慢病毒载体eGFP 上游的CMV 启动子; 将重组慢病毒质粒用脂质体介导法转入端粒酶阳性的人肿瘤细胞中进行功能鉴定。
使端粒酶阳性的癌细胞中可以观测到绿色荧光蛋白表达。
1 材料与方法：1.1 .1主要材料质粒：pEGFP-N1质粒、pLenti6/V5D-Top质粒细胞：E.coli DH5α菌株、Hela 细胞酶：BspD Ⅰ、Age Ⅰ、BamH Ⅰ内切酶、T4连接酶、Taq 酶其他：胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy ， Propyl]-n ， n ，n-Trimethylammonium Chloride （DOTMA ）和Dioleoyl photidye-thanolamine （DOPE ）、1.1.2技术路线1.2 方法1.2.1 E GFP 基因的扩增设计扩增EGFP 基因的引物,上游引物:5’ -CACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’下游引物:5’-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3’上游引物含有促进目的基因在真核细胞表达的Kozak 序列CACC, 下游引物设计与TOPO 克隆载体的V5标签融合, 能形成融合蛋白。
以pEGFP-N1质粒为模板扩增EGFP 基因, PCR 反应操作为:1）在50 ul 反应体系中分别加入：MiniQ H 2O 37.5ul10×PCR buffer 5ul25mM MgCl2 3ul10mM dNTP mix 1ul引物1(10μM) 1ul引物2(10μM) 1ulTaq(2 to 5 units/ul) 0.5ul基本表达EGFP 质粒更换启动子或其它调控元件条件性表达EGFP 质粒阳离子脂质体质粒DNA+脂质体复合物肿瘤细胞或细胞株转EGFP 基因细胞加入调控因子荧光显微镜观察EGFP 表达模板（DNA） 1ul终体积为 50 ul2）短暂离心混匀后，放入PCR仪中，反应程序如下：I）94℃ 5min（时间根据模板来确定）II）94℃ 45S62℃ 45S（退火温度和时间根据引物来确定）72℃ 1min（时间根据扩增片段长度来确定）30-35个循环（循环次数根据扩增目的来确定）III）72℃ 7-10minIV）4℃ 保存(一般不保存，保存对PCR仪损坏大) 反应完成后，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果。
