HIV_1特异性单抗2G12单价抗体的构建及活性分析_冯一帆

基金项目：国家 “十二五” 艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项 （２０１２ＺＸ１０００１００５） 作者简介：冯一帆，硕士研究生，主要从事 ＨＩＶ－１抗体相关研究 通 讯 作 者 ： 曾 毅 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｅｎｇｙｉｃｄｃ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ； 余 双 庆 ：Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｙｕｓｈｑｉｎｇ＠１６３．ｃｏｍ
１．３ 半 分 子 型 ＩｇＧ１ 重 链 恒 定 区 基 因 的 构 建 以 ｐＩｇＧ１－２Ｇ１２ 作 为 模 板， 去 除 绞 链 区 二 硫 键 和 ＣＨ２、ＣＨ３区的稳 定 非 共 价 键。 具 体 方 法 是 首 先 通 过 点 突 变 将 绞 链 区 的 Ｃ 替 换 为 Ｓ， 分 别 是 Ｃ１０９Ｓ、Ｃ１１１Ｓ；之后 对ＩｇＧ１ 重 链 的 ＣＨ３ 区 进 行 修 饰， 从 而 发 生 以 下 氨 基 酸 替 换： Ｒ２３８Ｑ、 Ｄ２３９Ｅ、Ｋ２９２Ｒ、Ｑ３０２Ｅ 和 Ｐ３２８Ｌ （以上突变位置 均指其在 ＣＨ 区 的 位 置）。 突 变 后 的 表 达 质 粒 命 名 为 ｐＩｇＧ１－ＨＭ。 １．４ 抗 体 表 达 与 纯 化 提 前 １ｄ 将 状 态 良 好 的 ２９３Ｔ 细 胞 接 种 于 Ｔ－１７５ 细 胞 培 养 瓶 中， 将 质 粒 ｐＩｇＧ１－２Ｇ１２ １４μｇ 与 ｐＩｇＧ１－ｔＨ １４μｇ 以 及 ｐＩｇＬ－ ２Ｇ１２ ２８μｇ共转染２９３Ｔ 细胞以表达 Ｎ 端截短型抗 体 ２Ｇ１２－ｔＨ； 用 ｐＩｇＧ１－ＨＭ ２８ μｇ 与 ｐＩｇＬ－２Ｇ１２ ２８μｇ共 转 染 ２９３Ｔ 细 胞 表 达 半 分 子 型 抗 体 ２Ｇ１２－ ＨＭ。转染 试 剂 为 Ｘ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ （购 自 瑞 士 Ｒｏｃｈｅ公司）， 具 体 操 作 参 照 试 剂 盒 说 明 书。 转 染 ４８ｈ后补液至１２０ｍｌ，继 续 培 养 ８ｄ。 收 集 细 胞 上 清，２ ５００ｒ／ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ， 用 ０．２２μｍ 滤 器 过 滤， 每 升 液 体 加 入 ２ ｍｌ １０％ ＮａＮ３， 加 １０ ｍｌ ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，４ ℃ 保 存 至 上 纯 化 柱。 纯 化 之 前 将 液 体 平 衡 至 室 温， 每 升 液 体 加 ２０ ｍｌ １ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ调节 ｐＨ 值至８．０。２Ｇ１２－ＨＭ 使用 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ （购自美国 Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ公司） 柱亲和 纯化即可获得。２Ｇ１２－ｔＨ 需 首 先 经 过 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ 亲 和纯化，然 后 再 经 过 ＡＫＴＡ 系 统 经 层 析 柱 纯 化， 使用２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ缓 冲 液，ｐＨ ８．５ＰＢＳ 洗 脱， 收集中间峰１ 材料 单 抗 ２Ｇ１２ 重 链 基 因 表 达 质 粒 ｐＩｇＧ１－ ２Ｇ１２ 和 轻 链 表 达 质 粒 ｐＩｇＬ－２Ｇ１２ 为 本 室 保 存。 羊 抗 ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单抗 Ｄ７３２４ 购自爱尔 兰 Ａａｌｔｏ Ｂｉｏ Ｒｅａｇｅｎｔ 公 司， ＨＩＶ－１ 抗 原 ｇｐ１２０ 和 ｇｐ１２０ 与 ＣＤ４－Ｄ１Ｄ２融合的单 链 融 合 蛋 白 ＦＬＳＣ［５］为 本 室 从 合成的相应表达载体转 染 ２９３Ｔ 细 胞 制 备 的 细 胞 上 清。所有 ＨＩＶ－１假病毒均由 ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ 提 供 包 装 质 粒， 本 室 通过转染２９３Ｔ 细 胞 获 得。 所 用 的 假 病 毒 ６５３５．３、 ＴＲＯ．１１、 ＡＣ１０．０．２９、 ｐＷＩＯ４１６０．３３、 ＳＣ４２２６６１．８、 ＳＦ１６２均为 ＨＩＶ－１型 Ｂ 亚型， 除 ＳＦ１６２ 外 Ｅｎｖ 基 因均克隆自 ＨＩＶ 携 带 者 血 样， 与 骨 架 基 因 共 转 染 获得［６－８］，ＳＦ１６２ Ｅｎｖ 基 因 克 隆 自 实 验 室 适 应 株， 与骨架基因共转染获得。 １．２ Ｎ 端 截 短 型 ＩｇＧ１ 重 链 基 因 的 构 建 ｐＩｇＧ１－ ２Ｇ１２是将２Ｇ１２ 抗 体 重 链 可 变 区 基 因 以 Ａｇｅ Ⅰ／ ＳａｌⅠ酶切 位 点 插 入 表 达 人 ＩｇＧ１ 重 链 恒 定 区 基 因 的 表 达 质 粒 ｐＩｇＧ１ （ＧｅｎＢａｎｋ 序 列 号： ＦＪ４７５０５５．１） 构建而 成。 以 ｐＩｇＧ１－２Ｇ１２作为模板， 对 ＣＨ１区和绞链区交界处序列进行点突变，引入酶 切位点 ＡｇｅⅠ，然后用 ＡｇｅⅠ对突变后的质粒进行单 酶切，回收大 片 段，使 用 Ｔ４ 连 接 酶 连 接，即 可 获 得表达 Ｎ 端截短型 重 链 恒 定 区 基 因 （含 有 铰 链 区、 ＣＨ２和 ＣＨ３区基因）的表达质粒ｐＩｇＧ１－ｔＨ。
１．北 京 工 业 大 学 生 命 科 学 与 生 物 工 程 学 院 ， 北 京 １０００２２； ２．中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室，北京 １０００５２
摘要：目的 构 建 单 价 抗 体 并 与ＩｇＧ 比 较 结 合 活 性 及 中 和 活 性 的 差 异 。 方 法 对ＩｇＧ１ 抗 体 重 链 恒 定 区 基 因进行改造，分别构建 Ｎ 端截短型的ＩｇＧ１重链恒定区基因ＩｇＧ１－ｔＨ 和去除绞链区 二 硫 键 及 ＣＨ２、ＣＨ３ 区 的稳定非共价键 的 ２Ｇ１２ 重 链 基 因 ２Ｇ１２－ＨＭ。 将 ＩｇＧ１－ｔＨ 与 ２Ｇ１２ 抗 体 重 链 和 轻 链 基 因 表 达 质 粒 共 转 染 ２９３Ｔ 细胞，表达含有完整 Ｆｃ的单价抗体；将２Ｇ１２－ＨＭ 和轻链基因表达质粒共转染２９３Ｔ 细胞， 表 达 半 分 子型的 单 价 抗 体。 通 过 非 还 原 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 对 表 达 抗 体 的 大 小 进 行 鉴 定 ， 并 用 ＥＬＩＳＡ 和 微 量 中 和 实 验 比 较 原型２Ｇ１２抗 体 和 单 价 抗 体 的 结 合 活 性 及 中 和 活 性 。 结 果 以 ＨＩＶ－１ 中 和 抗 体 ２Ｇ１２ 为 模 型 通 过 基 因 改 造 成功表达了两种单价抗体，一种为完整的重链、轻链以及 Ｎ 端 截 短 型 的 重 链 分 子 组 成 的 包 含 １ 个 Ｆａｂ和 １ 个 Ｆｃ的单价抗体２Ｇ１２－ｔＨ；另一种为１条重链和１条轻链组成的半分子型单价抗体２Ｇ１２－ＨＭ。两种抗体均可 与抗原有效结合，且与ＩｇＧ 分子相比差异无统计学意义。中和实验结果发现ＩｇＧ 抗体能中和的，病 毒 两 种 单 价抗体也均能中和。结论 成功构建了两种单价抗体，与ＩｇＧ 相比其结合活性和中和活性无明显变化。 关键词：人类免疫缺陷病毒；单价抗体；中和活性 中图分类号：Ｒ３７３．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：２０９５－０１３６ （２０１５）０３－０１７１－０５
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中 国 病 毒 病 杂 志 ２０１５ 年 ５ 月 第 ５ 卷 第 ３ 期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓ， Ｍａｙ ２０１５，Ｖｏｌ．５ Ｎｏ．３
由于人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 （ＨＩＶ） 高 度 的 变 异 性，用一种抗体作用病毒，病毒很容易发生逃逸， 从而达不 到 治 疗 效 果， 如 果 同 时 给 予 几 种 中 和 抗 体，有可 能 提 高 其 中 和 效 率 。 ［１］ 但 抗 体 分 子 量 较 大，几种抗体同时结合病毒颗粒表面时可能会由于 空间位阻的 作 用 而 影 响 其 中 和 活 性 。 ［２］ 文 献 报 道， 单价抗体能很好地保持抗体的抗原结合活性，但分 子量较小 。 ［３－４］ 将 多 种 单 价 抗 体 混 合 使 用， 有 可 能 达到既发挥多种抗体的中和活性，又能克服这些抗 体造成的空间位阻作用。文献报道的单价抗体，主 要有两种：一种为完整的重链、轻链以及 Ｎ 端截 短型的重链分子组成的 包 含 １ 个 Ｆａｂ 和 １ 个 Ｆｃ的 单 价 抗 体 ２Ｇ１２－ｔＨ［３］； 另 一 种 为 １ 条 重 链 和 １ 条 轻 链组 成 的 半 分 子 型 单 价 抗 体 （ＩｇＧ ｈａｌｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅ， ２Ｇ１２－ＨＭ）。本文以已知的 ＨＩＶ－１中和抗体２Ｇ１２为 模型，构建了以上两种不同的单价抗体，并对其结 合活性和中和活性进行了比较，希望能找到一种既 能很好保持抗体活性又易于制备的单价抗体构建方 案，为后续多种单价抗体的联合应用提供实验依据。
Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００２２，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒｓ：ＺＥＮＧ Ｙｉ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｅｎｇｙｉｃｄｃ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ；
ＹＵ Ｓｈｕａｎｇ－ｑｉｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｙｕｓｈｑｉｎｇ＠１６３．ｃｏｍ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｆｏｒｍ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｐａｒｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｆｏｒｍ ＨＩＶ－１ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ２Ｇ１２ｗｉｔｈ １ Ｆａｂ ａｎｄ １Ｆｃ （２Ｇ１２－ｔＨ），ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ＩｇＧ１ｈｉｎｇｅ，ＣＨ２ａｎｄ ＣＨ３ｄｏ－ ｍａｉｎ ｅｘｏｎｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ２Ｇ１２ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ．Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｈａｌｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｏｒｍ ２Ｇ１２ （２Ｇ１２－ＨＭ），ｔｈｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ａｔ ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｎｏｎ－ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄｓ ｉｎ ＣＨ２，ＣＨ３ｒｅｇｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｒｅｍｏｖｅｄ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｎ ２Ｇ１２ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｍｕｔａｔｅｄ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ．Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ２Ｇ１２－ｔＨ ａｎｄ ２Ｇ１２－ＨＭ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ＨＩＶ－１ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｒｅｎｔ ＩｇＧ ｂｙ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ｍｉｃｒｏ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｓｓａｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｗｏ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ２Ｇ１２ ａｎｔｉｂｏｄｙ，２Ｇ１２－ｔＨ ａｎｄ ２Ｇ１２－ＨＭ，ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ．Ｂｏｔｈ ２Ｇ１２－ｔＨ ａｎｄ ２Ｇ１２－ＨＭ ｅｆ－ ｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＨＩＶ－１Ｅｎｖ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｘ ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ ＨＩＶ－１ｓｕｂ－ ｔｙｐｅ Ｂ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ｆｏｒｍ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｈａｄ ｓｉｍｉｌａｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ＩｇＧ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｗｏ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎ－ ｏｖａｌｅｎｔ ｆｏｒｍ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ｐａｒｅｎｔ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ；Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ