第三章微生物的分类及其分类方法
本章的核心内容是微生物的分类单元、微生物的命名法则；目前国内外最权威的原核微生物分类系统；用于分离菌株分类鉴定的方法和技术；微生物菌种的保藏。
微生物的分类单元有界、门、纲、目、科、属、种；微生物的命名依林奈氏双名法法则进行；《伯杰氏细菌学鉴定手册》，《伯杰氏系统细菌学手册》是当今进行细菌鉴定的最权威的手册；微生物分离菌株的分类鉴定有经典分类鉴定法、数值分类鉴定法、化学分类鉴定法、遗传学分类鉴定法， DNA中GC mol%分析、DNA-DNA杂交、DNA-rRNA杂交、16Sr RNA(16S rDNA)寡核苷酸的序列分析，微生物系统发育地位分析等不同层次的技术方法。微生物菌种的保藏对于研究和发酵生产都具有不可忽视的意义。保藏方法可依不同条件选择不同方法。
第一节微生物的分类单元和命名
分类是人类认识微生物，进而利用和改造微生物的一种手段，微生物工作者只有在掌握了分类学知识的基础上，才能对纷繁的微生物类群有一清晰的轮廊，了解其亲缘关系与演化关系，为人类开发利用微生物资源提供依据。
微生物分类学 (microbial taxonomy) 是一门按微生物的亲缘关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群 (taxon) 的科学，它的具体任务有三，即分类(classification) 、命名 (nomenclature) 和鉴定 (identification) 。分类指的是根据相似性或亲缘关系，将一个有机体放在一个单元中。命名是按照国际命名法规给有机体一个科学名称。鉴定则是确定一个新的分离物是否归属于已经命名的分类单元的过程。因此，概括来说，微生物分类学是对各个微生物进行鉴定，按分类学准则排列成分类系统，并对已确定的分类单元进行科学命名的科学。
一、微生物的分类单元
微生物的主要分类单位，依次为界 (kingdom) 、门（ phylum 或 division ）、纲(class) 、目 (order) 、科 (fami1y) 、属 (genus) 、种 (species) 。其中种是最基本的分类单位。具有完全或极多相同特点的有机体构成同种。性质相似、相互有关的各种组成属。相近似的届合并为科。近似的科合并为目。近似的目归纳为纲。综合各纲成为门。由此构成一个完整的分类系统。以下以柠檬浮霉状菌为例加以说明。
另外，每个分类单位都有亚级，即在两个主要分类单位之间，可添加“亚门”、“亚纲”、“亚目、”“亚科”等次要分类单位。在种以下还可以分为亚种、变种、型、菌株等。
属是科与种之间的分类单元，通常包含具有某些共同特征和关系密切的种。 Goodfellow 和 O'Donnell(1993) 提出 DNA 的 G+C mol% 差异≤ 10 ％ ~12 ％及 16S rDNA 的序列同源性≥ 95 ％的种可归为同一属。
种 (species) 关于微生物“种”的概念，各个分类学家的看法不一，例如伯杰氏(Bergey) 给种的定义是：“凡是与典型培养菌密切相同的其他培养菌统一起来，区分成为细菌的一个种。”因此，它是以某个“标准菌株”为代表的十分类似的菌株的总体。种是以群体形式存在的。种有着不同的定义，在微生物学中较常见有生物学种（ biological species ，BS ），进化种 (evolutionary species ， ES) 和系统发育种（ phylogenetic species ，PS ）等不同的物种概念。
1986 年斯坦尔 (Stanier) 给种下了定义：“一个种是由一群具有高度表型相似性的个体组成，并与其他具有相似特征的类群存在明显的差异。”但这个定义仍无量化标准。 1987 年，国际细菌分类委员会颁布， DNA 同源性≥ 70 ％，而且其⊿T m ≤ 5 ℃的菌群为一个种，并且其表型特征应与这个定义相一致。 1994 年 Embley 和 Stackebrandt 认为当 16S rDNA 的序列同源性≥ 97 ％时可认为是一个种。
亚种 (subspecies)在种内，有些菌株如果在遗传特性上关系密切，而且在表型上存在较小的某些差异，一个种可分为两个或两个以上小的分类单位，称为亚种。它们是细菌分类中具有正式分类地位的最低等级。根据⊿ T m 值在 DNA 杂交中的频率分布，有些证据表明，亚种的概念在系统发育上是有效的，而且能与亚种以下的变种概念相区别。后者仅是依据所选择的“实用”属性而决定，并不被 DNA 组成所证明。
亚种以下的分类等级通常表示能用某些特殊的特征加以区别的菌株类群。例如，在细菌分类中，以生物变型 (biovar) 表示特殊的生化或生理特征，血清变型 (serovar 结构的不同，致病变型 (pathovar) 表示某些寄主的专一致病性，噬菌变型 (phagovar) 表示对噬菌体的特异性反应，形态变型 (morphovar) 表示特殊的形态特征。
菌株或品系 (strain) 这是微生物学中常碰到的一个名词，它主要是指同种微生物不同来源的纯培养物。从自然界分离纯化所得到的纯培养的后代，经过鉴定属于某个种，但由于来自不同的地区、土壤和其他生活环境，它们总会出现一些细微的差异。这些单个分离物的纯培养的后代称为菌株。菌株常以数目、字母、人名或地名表示。那些得到分离纯化而未经鉴定的纯培养的后代则称为分离物。
微生物学中还常常用到“群”这个词，这只是为了科研或鉴定工作方便，首先按其形态或结合少量的生理生化、生态学特征，将近似的种和介于种间的菌株归纳为若干个类群。如为了筛选抗生素工作的方便，中国科学院微生物研究所根据形态和培养特征，把放线菌中的链霉菌属归纳为 12 个类群。
微生物分类各级单元所用的后缀如表 3-1 。
表 3－ 1 微生物分类各级单元拉丁学名后缀
二、微生物的命名
微生物的命名和其他生物一样，都按国际命名法命名，即采用林奈氏 (Linnaeus) 所创立的“双名法”。每一种微生物的学名都依属与种而命名，由两个拉丁字或希腊字或者拉丁化了的其他文字组成。属名在前，规定用拉丁字名词表示，字首字母要大写，由微生物的构造、形状，或由著名的科学家名字而来，用以描述微生物的主要特征。种名在后，用拉丁字形容词表示，字首字母小写，为微生物的色素、形状、来源、病名或著名的科学家姓名等，用以描述微生物的次要特征。此外，由于自然界的生物种类太多了，大家都在命名，为了更明确，避免误解，故在正式的拉丁名称后面附着命名者的姓。例如。金黄色葡萄球菌的学名为：
Staphylococcus aureus Rosenbach 1884
属名：葡萄球菌种名：金黄色命名人的姓命名年份
又如：Peptostreptococcus foetidus （ Veillon ） Smith
属名：消化链球菌种名：恶臭原命名者改名者
恶臭消化链球菌是由 Veillon 首先发现和定名的，后 Smith 重新定为现名。由此可以看出，种名后括弧内的姓，是表示这个种首先由 Veillon 定的名，在括弧后再附加改定此菌学名人的姓。如果发表新种，则在学名之后加 n ． sp( 即 novo species 的缩写，意为新种 ) 。有时只泛指某一属的微生物，而不是指定某一个具体的种，或没有种名，只有属名时，
可在属名后加 sp. 或 spp.(species 的缩写， sp. 表示单数， spp. 表示复数 ) ，如
Micrococcus sp. ，表示微球菌属的一个种，Micrococcus spp. 表示微球菌属的一些种。
变种的学名，是在种名后加变种名称，并在变种名称之前加 var 如枯草芽孢杆菌黑色变种应写成Bacillus subtilis var. niger 。属以上的名称必须是阴性复数形容词，与prokaryotae 相一致。
三、微生物系统发育分析
由于现代分子生物学技术的迅速发展，正在形成一套与传统的分类鉴定方法完全不同的
分类鉴定技术与方法，从基因水平上分析各微生物种之间的亲缘关系，即系统发育地位。众
所周知，原核生物细胞中的 16S rDNA 和真核生物细胞中的 18S rDNA 的碱基序列都是十分
保守的，不受微生物所处环境条件的变化、营养物质的丰缺的影响而有所变化，都可以看作
为生物进化的时间标尺，记录着生物进化的真实痕迹。因此，分析原核生物细胞中的 16S rDNA 和真核生物细胞中的 18S rDNA 的碱基序列，比较所分析的微生物与其他微生物种之间 16S rDNA 和 18S rDNA 序列的同源性，可以真实地揭示它们亲缘关系的距离和系统发育地位。在现实研究中，除了选择 16S rDNA 和 18S rDNA 作序列分析进行系统发育比较外，还可利用
间隔序列 (ITS) 、某些发育较为古老而序列又较稳定的特异性酶的基因作序列分析，进行系统发育分析。如在环境微生物研究中，对于谷胱甘肽转移酶（ GST ）的基因序列分析所获得的系统发育鉴定结果与用其他方法所获得的结果具有十分吻合的一致性。随着研究技术和理
论的日趋成熟，现在有人提出了分子系统学 (molecular systematics) 这一理论概念。
系统学（ systematics ）是研究生物多样性及其分类和演化关系的科学。分子系统学是检测、描述并揭示生物在分子水平上的多样性及其演化规律的科学。研究内容包括了群体遗
传结构、分类学、系统发育和分子进化等领域。群体遗传结构 (population genetic structure) 是指一个种内总的遗传变异程度及其在群体间的分布模式，是一个种最基础的遗传信息。分
类学 (taxonomy) 是研究物种的界定和序级确定。系统发育关系 (phylogenetic relationship) 和分子进化 (molecular evolution) 是两个密切相关的过程。在利用现代分子生物学技术在分子和基因水平上获得大量的分类单元尤其是种的遗传信息后，来推断和重
建微生物类群的演化历史和演化关系，即建立系统发育树，如第一章中图 1-1 表示细菌、古菌和真核生物的无根系统发育树。根据分离菌株的 16S rDNA 或 18S rDNA 序列与相关微生
物种之间的同源性，将分离获得的菌株放置于系统发育树的确当分支位置，以显示其在系统
发育中的地位和与其他种间
的亲缘关系。原核微生物中的
细菌和古菌的系统发育树分
别如图3-1 和3-2 所示。
图 3-1 细菌域的系统发育树
（引自 Madigan et al.,
Brock Biology of
Microorganisms, Tenth
edition, 2003 ）
图 3-2 古菌域的系统发育树
第二节原核微生物分类系统
一、原核微生物伯杰氏分类系统
细菌、放线菌等原核微生物的分类系统很多，目前较有代表性和最有影响的分类系统是美国的《伯杰氏细菌学鉴定手册》 (Bergey , s Manual of Determinative Bacteriology ，以下简称“手册” ) 。“手册”自 1923 年第一版以采，相继于 1925 ， 1930 ， 1934 ，1939 ， 1948 和 1957 年出版了第二版至第七版，几乎每一版均吸取了许多分类学家的经验，其内容经过不断地扩充和修改。“手册”第七版包括从纲到种、亚种的全面分类大纲和相应的检索表以及各分类单位的描述，将细菌列于植物界原生植物门的第二纲——裂殖菌纲。“手册”第七版的分类方法基本上处于经典分类法阶段，即以形态特征为主结合生理生化特性为分类依据。第八版 (1974 年 ) 没有从纲到种的分类系统，而着重于属、种的描述和比较，它也没有分类大纲，而是根据形态、营养型等分成 19 个部分，把细菌、放线菌、粘细菌、螺旋体、枝原体和立克次氏体等 2 000 多种微生物归于原核生物界细菌门。手册第八版的分类方法也有了改进，除采用经典分类法外，还增加了细胞化学、遗传学和分子生物学等方面的新鉴定方法，对某些属、种应用了数值分类法。
1994 年，《伯杰氏细菌学鉴定手册》第九版出版。该手册根据表型特征把细菌分为四个类别， 35 群。“手册''第九版与过去的版本相比较，具有以下特点：①该书的目的只是为了鉴别那些已被描述和培养的细菌，并不把系统分类和鉴定信息结合起来；②其内容的编排严格按照表型特征，所选择的排列是实用的，为了有利于细菌的鉴定，并不试图提供一个自然分类系统；③手册抽取了《伯杰氏系统细菌学手册》四卷的表型信息，并包括了尽可能多的新的分类单元，其有效发表的截止日期是 1991 年 1 月。
表3-2 细菌的高级分类单位
在 1984 ～ 1989 年间，“手册”的出版者出版了《伯杰氏系统细菌学手册》 (Bergey , s Manual of Systematic Bacteriology ，简称“系统分类学手册” )。该手册与《伯杰氏细菌学鉴定手册》有很大不同，首先是在各级分类单元中广泛采用细胞化学分析、数值分类方法和核酸技术，尤其是 16S rRNA 寡核苷酸序列分析技术，以阐明细菌的亲缘关系，并对第八版手册的分类作了必要的调整。例如，“系统细菌学手册”根据细胞化学、比较细胞学和 16S rRNA 寡核苷酸序列分析的研究结果，将原核生物界分为四个门。由于这个手册的内容包括了较多的细菌系统分类资料，定名《伯杰氏系统细菌学手册》，反映了细菌分类从人为的分类体系向自然的分类体系所发生的变化。为使发表的材料及时反映新进展，并考虑使用者的方便，该手册分四卷出版。第一卷 (1984 年 ) 内容为一般、医学或工业的革兰氏阴性细菌。第二卷 (1986 年 ) 为放线菌以外的革兰氏阳性细菌。第三卷 (1989 年 ) 为古细菌和其他的革兰氏阴性细菌。第四卷 (1989 年 ) 为放线菌。 2000 年， Bergey , s Manual of Systematic Bacteriology 第二版编辑完成并分成 5 卷陆续出版。在此第二版中，细菌域分为 16 门， 26 组， 27 纲， 62 目， 163 科， 814 属，收集了 4 727 个种。古菌域分为 2 门， 5 组， 8 纲， 11 目， 17 科， 63 属，收集了 208 个种。供收集进原核微生物 4 935 个种。
二、关于变形细菌 ( Proteobacteria ) 纲
运用 DNA/RNA 杂交、 16S rRNA 编目法和 16S rRNA 序列分析方法对革兰氏阴性细菌系统发育研究的结果相当一致。在研究过程中，发现“紫细菌和相关细菌”，尽管在表型和基因型方面很不一样即相当异源，但在系统发育树状图谱上具有连续现象，相互之间的进化关系很为密切。 1988 年， Stackebrandt 等将这类革兰氏阴性细菌命名为“变形细菌”（Proteobacteria ），其下又分为 a- 亚纲、 b- 亚纲， g- 亚纲、 d- 亚纲和 e - 亚纲，见图 3-3 。 a- 亚纲包括一大群形态、生理和营养类型（光能自养型、化能无机营养型和化
能有机营养型）等表型特征十分不同的细菌，如土壤杆菌（ Agrobacterium ）、根瘤菌
( Rhizobium ) 、红假单胞菌 ( Rhodopseudomonas ) 、发酵单胞菌 ( Zymomonas ) 、副球菌等 ( Paracoccus ) 、立克次氏体（ Rickettsia ）等。 b- 亚纲由 Woese 于 1984 年提出，包括的菌群有色杆菌属 ( Chromobacterium ) ，水螺菌属 ( Aquaspirillum ) ，紫色杆菌 ( Janthinobacterium ) ，德克斯氏菌 ( Derxia ) ，丛毛单胞菌 ( Comamonas ) ，嗜木杆菌（ Xylophilus ）等。 g- 亚纲由 Weose1985 年提出，包括了肠杆菌科
(Enterobacteriaceae) ，气单胞菌科 (Aeromonadaceae) ，弧菌科 (Vibrionaceae) ，巴斯德菌科 (Pasteurellaceae) ，假单胞菌 ( Pseudomonas ) ，海洋螺菌 ( Oceanospirillum ) ，黄单胞菌 ( Xanthomonas ) ，溶杆菌 ( Lysobacter ) 等。 d- 亚纲由分解代谢的硫酸盐还原细菌、元素硫还原细菌，蛭弧菌 ( Bdellovibrio ) 和黏细菌目 (Myxococcales) 的 6
个代表。 e - 亚纲仅有弯曲杆菌 ( Campylobacter ) 和螺杆菌 ( Heliobacter )2 属。
又称阿德逊氏分类法 () 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为 50 ～ 60 个，多者可达 100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵 ( 图3-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱 (dendrogram)( 图3-6) ，再结合主观上的判断 ( 如划分类似程度大于 85 ％者为同种，大于 65 ％者为同属等 ) ，排列出—个个分类群。
图 3-5 显示 6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图
生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链 DNA 的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为 100% 。如果两条单链 DNA 的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于 100% 。由此；杂合率越高，表示两个 DNA 之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的 DNA 杂合率可高达 100 ％，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的 DNA 杂合率较低，约有 70 ％。 G+Cmol ％的测定和 DNA 杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。
3 、 DNA — rRNA 杂交
目前研究 RNA 碱基序列的方法有两种。一是 DNA 与 rRNA 杂交，二是 16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。 DNA 与 rRNA 杂交的基本原理、实验方法同 DNA 杂交一样，不同的是①是DNA 杂交中同位素标记的部分是 DNA ，而 DNA 与 rRNA 杂交中同位素标记的部分是 rRNA 。
② DNA 杂交结果用同源性百分数表示，而 DNA 与 rRNA 杂交结果用 Tm(e) 和 RNA 结合数表示。 Tm(e) 值是 DNA 与 rRNA 杂交物解链一半时所需要的温度。 RNA 结合数是 100 m gDNA 所结合的 rRNA 的 m g 数。根据这个参数可以作出 RNA 相似性图。在 rRNA 相似性图上，关系较近的菌就集中到一起。关系较远的菌在图上占据不同的位置。用 rRNA 同性试验和 16SrRNA 寡核苷酸编目的相似性比较 rRNA 顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单
元的较一致的系统发育概念，并导致了古细菌的建立。
4 、 16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析
首先， 16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中。 rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三， 16S rRNA 的相对分子量大小适中，约 1 540 个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。
分离菌株 16S rRNA 基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞 , 加入100μL 无菌重蒸 H 2 O 中 , 旋涡混匀后 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 离心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用于 PCR 扩增。分离菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序列测定的一般步骤为： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ；5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3' 。扩增反应体积 50 m L ，反应条件为 95 ℃预变性 5min ，94 ℃变性 1min ， 55 ℃退火 1min ， 72 ℃延伸 2min ，共进行 29 个循环， PCR 反应在 PTC-200 型热循环仪上进行。取 5 m L 反应液在 10g L -1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 PCR 产物测序可由专门技术公司完成。
测序得到分离菌株 16S rDNA 部分序列，此序列一般以 *.f.seq 形式保存，可以用写字板或 Editsequence 软件打开，将所得序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据进行比对分析 ( https://www.doczj.com/doc/eb12784906.html,/blast ) ，具体步骤如下：点击网站中Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] 选项，将测序所得序列粘贴
在“ search ”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即
“ blast ”，然后点击“ format ”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断 16S rDNA 鉴定结果。
遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用 DNAStar 软件包中的 MegAlign 程序计算样本间的遗传距离。由 GenBank 中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入Clustalx1.8 程序进行 DNA 同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入Phylip3.6 软件包，以简约法构建系统发育树。使用 Kimura 2-parameter 法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（ Bootstrap ） 500 次重复检测， DNA 序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。
第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平； 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。 （一）、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )
BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌 属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 （二）、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。 图14-5 显示 6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图
关于微生物的一些基本知识 1、微生物的分类 1.1 从微生物形态与结构 真核细胞型微生物细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体；胞质内有完整的细胞器（如内质网、核糖体及线粒体等）。真菌属于此类型微生物。 原核细胞型微生物细胞核分化程度低，仅有原始核质，没有核膜与核仁；细胞器不很完善。这类微生物种类众多，有细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体和放线菌。 非细胞型微生物没有典型的细胞结构，亦无产生能量的酶系统，只能在活细胞内生长 繁殖。病毒属于此类型微生物。 1.2 从对氧的需求 好氧微生物：亦称需氧菌、需氧微生物。在有氧环境中生长繁殖，氧化有机物或无机 物的产能代谢过程，以分子氧为最终电子受体，进行有氧呼吸。 厌氧微生物：厌氧性细菌anaerobic bacteria 指在无氧条件下生活的细菌。为好氧性细菌的对应词。其中，在氧存在下不能生长的细菌，特称为专性厌氧菌，如梭菌、甲烷菌、 硫酸盐还原菌以及大部分光合细菌。 兼性厌氧细菌：无论有氧状态还是无氧状态都能生长发育的细菌。 1.3 微生物获得碳源与能量的方式 根据微生物对碳源和能源的需求不同，可将微生物分为下列四个营养类型： (1) 光能自养型微生物：以CO2作为惟一或主要碳源，以无机物（如硫化氢、硫代硫 酸钠等无机硫化物）作为供氢体，还原CO2合成细胞物质，并利用光能进行生长。它们都含有叶绿素等光合色素，因此能将光能转化为化学能。藻类、蓝细菌和某些光合细菌（红 硫细菌、绿硫细菌）都属于光能自养微生物。 (2)化能自养型微生物：以CO2或碳酸盐作为惟一或主要碳源，以氢气、硫化氢、二价铁离子或亚硝酸盐等有机物作为电子供体，还原CO2或碳酸盐合成细胞物质，并利用无机物氧化所产生的化学能作为能源。这类微生物包括氢细菌、硫细菌、铁细菌和硝化细菌等。 (3)光能异养型微生物：不能以CO2作为惟一或主要碳源，需要以有机物作为供氢体，具有光合色素，以光作为能源。在生长时，光能异养型微生物常需要外源的生长因子。红 螺菌属、红假单胞菌属和红螺微菌属的一些细菌就属于光能异养型微生物。 (4)化能异养型微生物：以有机化合物作为碳源，并利用有机物质氧化产生的化学能作 为能源，对于这类微生物而言，有机物既是碳源又是能源。 2、微生物的繁殖
一、名词解释： 1.温和噬菌体(temperate phage)：噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬 菌体DNA能随细菌DNA复制，并随细菌的分裂而传代。 2.溶原性：温和噬菌体这种产生成熟噬菌体颗粒（前噬菌体偶尔可自发地或在某些理化和生 物因素的诱导下脱离宿主菌基因组而进入溶菌周期，产生成熟噬菌体，导致细菌 裂解）和溶解宿主菌的潜在能力，称为溶原性。 3.溶原性细菌：带有前噬菌体基因组的细菌称为溶原性细菌。 4.荚膜：荚膜是一些细菌在其细胞表面分泌的一种黏性物质，把细胞壁完全包围封住，这层 黏性物质就叫荚膜。 5.菌胶团：有些细菌由于其遗传特性决定，细菌之间按一定的排列方式互相黏集在一起，被 一个公共荚膜包围形成一定形状的细菌集团，叫做菌胶团。 6. 芽孢:某些细菌遇到不良环境时，在其细胞内形成一个内生孢子叫芽孢。 7.酶的活性中心：是指酶的活性部位，是酶蛋白分子直接参与和底物结合，并与酶的催化 作用直接有关的部位。 8.生长因子：是一类调节微生物正常生长代谢所必需，但不能用简单的碳、氮源自行合成的 有机物。 9.培养基：根据各种微生物对营养的需要（如水，碳源，能源，氮源，无机盐及生长因子等）， 按一定的比例配制而成的，用以培养微生物的基质，称为培养基。
10.选择培养基：根据某微生物的特殊营养要求，或对各种化学物质敏感程度的差异而设计、 配制的培养基，称为选择培养基。 11.鉴别培养基：几种细菌由于对培养基中某一成分的分解能力不同，其菌落通过指示剂显 示出不同的颜色而被区分开，这种起鉴别和区分不同细菌作用的培养基， 叫鉴别培养基。 12.发酵：是指在无外在电子受体时，底物脱氢后所产生的还原力[H]不经呼吸链传递而直接 交给某一内源性中间产物接受，以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧 化反应。 13.好氧呼吸：是有外在最终电子受体（O2）存在时，对底物（能源）的氧化过程。 14.无氧呼吸*：无氧呼吸又称厌氧呼吸，是一类电子传递体系末端的受氢体为外源无机氧化 物的生物氧化。 15.土壤自净：土壤对施入一定负荷的有机物或有机污染物具有吸附和生物降解的能力，通 过各种物理、化学过程自动分解污染物使土壤恢复到原有水平的净化过程， 称土壤净化。 16.水体自净：天然水体受到污染后，在没有人为的干预条件下，借助水体自身的能力使之 得到净化，这种现象成为水体自净，其中包括生物学和生物化学的作用。17：水体富营养化（环化有） 18.硝化作用：氨基酸脱下的氨，在有氧的条件下，经亚硝酸细菌和硝酸细菌的作用转化为 硝酸的过程。
大理大学课程教案 （理论教学） 课程名称：微生物学与人类健康 课程类型：（ 2 ）1、必修；2、选修；3、其它 授课对象：非医学专业（本科）14/15 级 授课时间：2016 至2017 学年 1 学期 计划学时：24 学时（其中：理论24 ，实验：0 ）任课教师：武有聪、张雷 所属学院：基础医学院 课程管理部门（教研室）：医学微生物学及免疫学教研室 大理学院教务处
教材：人民卫生出版社出版（出版社），刘晶星编著，2013年第8版讲授人：武有聪专业技术职务：副教授 学历：研究生学位：博士学位 所属章节：第1-2章计划学时：3h 教学目的和要求： 1.掌握：细菌细胞壁的组成、功能；革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁的不同点及 意义；质粒的概念及其作用；核蛋白体的组成及意义；异染颗粒的意义；L-型细菌的概念及其意义；细菌的特殊结构及意义。细菌生长繁殖的条件及方式；根据细菌对氧需要的分类及细菌厌氧生长的原理；细菌合成代谢产物的种类及意义。 2.熟悉：细菌的大小与测量单位；细菌的基本形态；细菌的基本结构及功能；中介体 的概念；常见细菌生化反应的种类；细菌生化反应的概念及其在细菌鉴别上的意义； 细菌群体的生长繁殖规律。 教学重点及难点： 1.细菌的大小与形态 2.细菌的特殊结构（荚膜，鞭毛，菌毛，芽孢） 3.细菌的基本结构（细胞壁，细胞膜，细胞质） 教学方法：讲授为主、列表法、图示法 使用教具：多媒体 思考题： 1.细菌的基本结构有哪些它们各有什么作用 2.细菌的特殊结构有哪些它们各有什么作用 参考资料： 1.《医学微生物学》（第六版）周正任主编人民卫生出版社 2.《医学微生物学与免疫学》沈关心主编人民卫生出版社 3.《医学微生物学》中国协和医科大学、北京医科大学联合出版社
环境微生物学知识点 教材：环境工程微生物周凤霞白京生主编化学工业出版社 单元知识一绪论 1.环境问题与可持续发展 概念现状 2.微生物作用 微生物概念微生物作用（有益、有害） 3.微生物特点 个体小繁殖快种类多结构简单易变异 单元知识二环境微生物主要类群 1.原核微生物 ①细菌（形态结构及作用 ②放线菌（形态菌落培养污泥丝状膨胀的类型） ③蓝细菌（特征作用水华、赤潮类别） 2.真核微生物 ①酵母菌（类型结构特征应用 ②霉菌（类型结构特征应用特种污水处理优势 ③真核微型藻类（分类作用水华、赤潮类别） 3.原生动物 ①鞭毛虫（形状特征指示性作用） ②肉足虫（形状特征分类指示性作用） ③纤毛虫（形状特征分类 ④包囊（形成原因过程指示性作用） 4.微型后生动物 ①轮虫（形状特征分类指示性作用） ②线虫（形状特征分类指示性作用） ③水蚤（形状特征分类指示性作用） 5.病毒 ①病毒特征 ②病毒结构 ③繁殖（5 ④溶原性 单元知识三微生物原理 1.微生物营养 ①营养要素（5大要素 ②营养类型（4个） ③培养基（原则分类作用生化营养保证） 2.生长曲线（曲线多周期过程及对比分析 3.环境因素影响（温度ph 4.微生物代谢（酶 5.遗传变异（遗传变异污泥驯化） 单元知识四微生物生态
1.微生物环境分布（土壤大气水体） 2.微生物间关系（共生互生寄生拮抗 3.微生物与物质循环（C N P 循环污水处理中应用）单元知识五微生物的环境污染 1.水体富营养化（水华赤潮） 2.产生毒素 单元知识六微生物在水污染治理中的作用 1.污水生物处理分类（好氧厌氧兼氧） 2.活性污泥法（微生物组成净化机理培养驯化） 3.生物膜法（微生物组成净化机理培养驯化）
微生物的概念及其在生物分类中的地位 录入时间:2011-4-15 11:11:57 来源：中国食品商务网 1.1 微生物的概念 微生物（Microorganism, microbe）一词并非生物分类学上的专门名词，而是指大量的、极其多样的、不借助显微镜看不见的微小生物类群的总称。因此，微生物通常包括病毒、细菌、真菌、原生动物和某些藻类，它们的大小和特征见表1-1。 表1-1.微生物形态、大小和细胞类型 微生物大小近似值细胞特征 病毒0.01～0.25μm非细胞的 细菌0.1～10μm原核生物 真菌2μm～1m 真核生物 原生动物2～1000μm真核生物 藻类1μm～几米真核生物 但是有些例外。如许多真菌子实体、蘑菇等常肉眼可见；相同的，某些藻类能生长几米长。一般来说，微生物可以认为是相当简单的生物，大多数的细菌、原生动物、某些藻类和真菌是单细胞的微生物，即使为多细胞的微生物，也没有许多的细胞类型。病毒甚至没有细胞，只有蛋白质外壳包围着的遗传物质，且不能独立生活。 1.2 微生物在生物分类中的地位 在生物发展的历史上，曾把所有的生物分为动物界和植物界两大类。而
微生物，不仅形体微小、结构简单，而且它们中间有些类型像动物，有些类型像植物，还有些类型既有动物的某些特征，又具有植物的某些特征，因而归于动物或植物都不合适。于是，1866年海克尔（Haeckel）提出区别动物界与植物界的第三界——原生生物界。它包括藻类、原生动物、真菌和细菌。
随着科学的发展，新技术和研究方法的应用，尤其是电子显微镜和超显微结构研究技术的应用，发现了生物的细胞核有两种类型，一种是没有真正的核结构，称为原核，其细胞不具核膜，只有一团裸露的核物质；另一种是由核膜、核仁及染色体组成的真正的核结构称为真核。动物界、植物界及原生生物界中的大部分藻类、原生动物和真菌是真核生物，而细菌、蓝细菌则是原核生物。真核生物和原核生物不仅细胞核的结构不同，而且其性状也有差别，真核生物和原核生物性状的比较内容将在第二章详细介绍。 根据核结构的不同，1969年魏塔科（Whittaker）提出五界系统，即动物界、植物界、原生生物界、真菌界和原核生物界。五界系统的生物都有细胞结构。病毒作为一界被提出的较晚，主要原因是①病毒和类病毒是生物还是非生物，是原始类型还是次生类型是长期争论未决的问题；②病毒不是用双命法，分类不用阶元系统。但经过长期研究发现，病毒和细胞型生物是有共同特性：①遗传物质是DNA（部分病毒是RNA）；②使用共同的遗传密码。在此基础上，我国学者于1979年提出将无细胞结构病毒立为病毒界，从而建立了六界系统。 细胞型生物 动物界（Animalia） 植物界（Plantae）
微生物的培养和应用 【学习目标】 1、掌握培养基的分类、组成、功能及配制。 2、掌握无菌技术的内容和无菌操作技术。 3、研究培养基对微生物的选择作用 4、掌握分离、纯化特定微生物的研究思路和方法，掌握从土壤中分理处能够分解尿素的细菌并进行技术的操作过程。 【要点梳理】 要点一、微生物的实验室培养 1、培养基： （1）培养基的配制原则 ①目的要明确（根据微生物的种类、培养目的等）。如培养基可由简单的无机物组成，生产用培养则可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定培养基必须加入已知化学成分的物质。 ②营养要协调。注意各种营养物质的浓度和比例。 ③pH要适宜。各种微生物适宜生长的pH范围不同。如细菌、放线菌和真菌生长的最适pH分别为：6.5～7.5、 7.5～8.5和5.0～6.0。 （2）培养基的种类和用途 （3）选择培养基和鉴别培养基应用实例
（4）培养基中的营养要素 要点诠释： ①微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常用的氮源是铵盐、硝酸盐。 ②对异养微生物来说。含C、H、O、N的化合物既是碳源．又是氮源。 ③有些培养基不需要添加生长因子，生物自己能合成；而绝大多数微生物培养需要加入生长因子，原因是它们缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。 2、无菌技术 （1）无菌技术的概念 在微生物培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，其主要技术是无菌操作。无菌技术是指通过一定物理、化学的手段，防止实验室培养物被外来微生物污染，保持微生物的纯培养的技术，其中包括在微生物的分离、转接、保存等过程中防止其他微生物污染的手段。无菌技术主要围绕如何避免杂菌污染展开的，主要包括以下几方面： ①对实验操作的空间，操作者的手和衣着，进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近或接种箱内进行。 ④应避免已经灭菌处理的材料用具与周围其他物品相接触。 （2）灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法见下表： 注意：灭菌所依据的原理基本上都是使菌体内的蛋白质和核酸发生变性，从而达到杀菌的效果。 （3）消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。 ①煮沸消毒法：在100℃煮沸5 min～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢。 ②巴氏消毒法：在70℃～75℃煮30 min或在80℃煮15 min。可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营
微生物的分类鉴定方法 1. 内容 微生物分类鉴定：经典方法、现代方法。 2. 练习 一、填空题 1.不论鉴定哪一累微生物，其工作步骤都离不开一下3项________，________，________。 答案：获得该微生物的纯培养，测定一系列必要的鉴定指标，查找权威性的菌种鉴定手册。 2.DNA碱基比是指________值，简称GC值。 答案：（G+C）mol% 3. 测验 一、填空题 1.按碱基的互补配对原理，用人工方法对两条不同来源的单链核酸进行________，以重 新构建一条新的________技术，称为核酸杂交。 一、简答题 1.现代微生物鉴定的经典指标有哪些？ 2.核酸分子杂交在微生物的分类鉴别中有何应用？ 4. 案例 5. 资源下载 课程讲义资源（Word文档）、教学课件资源（PPT）、视频录像资源（视频录像）。6. 扩展学习 使用教材： 微生物学教程第3版周德庆主编高等教育出版社2011 参考书目：
1.沈萍主编，《微生物学》，高等教育出版社，2000； 2.沈萍、范秀容、李广武编，《微生物学实验》第3版，高等教育出版社，1999； 3.Prescott LM, Harley JP, and Klein DA. Microbiology (5th ed.), Higher education press and McGraw-Hill Companies, 2002. 4. 闵航（2005）：微生物学. 浙江大学出版社 参考期刊： 微生物学报中国科学院微生物研究所；中国微生物学会主办 微生物学通报中国微生物学会；中国科学院微生物研究所主办 参考网址： 中国微生物信息网络hppt://159.226.80.1/chinese.html 中国微生物资源信息共享https://www.doczj.com/doc/eb12784906.html,/sdinfo 中国微生物信息网络https://www.doczj.com/doc/eb12784906.html,/
微生物学实验复习 3、培养基得配置原则： (1)目得要明确(根据微生物得种类、培养目得等)，如培养基可由简单得无机物组成，生产用培养基内可加入化学成 分不明确得天然物质，而分类、鉴定用培养基内必须加入已知化学成分得物质。 (2)营养要协调：注意各种营养物质得浓度与比例。 (3)pH要适宜：各种微生物适宜生长得pH范围不同，如细菌、放线菌与真菌得最适pH分别 为：6、5～7、5、7、5～8、5与5、0～6、0。
5、细菌培养基得配制过程？ 答：配制培养液→调节PH →分装→包扎→灭菌→搁置斜面（搁置斜面得长度不超过试管总长得1/2） 【问题与探究】 （1）培养基灭菌后，为什么需要冷却到50 ℃左右时，才能用来搁置斜面或倒平板？您用什么办法来估计培养基得温度？ 【提示】 琼脂得凝固点为40 ℃，温度太高易使培养皿破裂，低于40 ℃，培养基已凝固，倒不出，所以培养基灭菌后，需冷却到50 ℃左右时才能用来倒平板，可以用手触摸盛有培养基得试管，感觉试管得温度下降到刚刚不烫手时就可以进行倒平板了。 （2）为什么需要使试管口通过火焰？ 【提示】 通过灼烧灭菌，防止试管口得微生物污染培养基。 （3）为了能彻底灭菌，在操作过程中应注意哪些事项？ 【提示】 使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先得空气排尽，注意恒温灭菌，同时要注意高压蒸汽灭菌锅得压力(100 kPa)、温度(121 ℃)与灭菌时间(20 min)。 6、无菌操作与接种技术 (1)接种 概念：在_无 菌 条件下将微生物接入 培养基____得操作过程。 工具：玻璃刮铲、接种针与接种环。 方法：穿刺接种、斜面划线接种与平板划线接种、涂抹平板等。 （2）无菌操作 ——微生物接种技术得关键 ①培养微生物用得试管、培养皿与微生物培养基等，在接种之前都需要 灭菌_。 ②通常接种操作要在____酒精灯火焰__得附近进行。 【想一想】 在微生物得培养过程中为什么要进行无菌操作？
第十章微生物的分类与鉴定 一、选择题 1.真菌的分类单元-门的词尾为（A ） 2.A、–mycota B、–mycetes C、–mycotina D、-mycetidae 3.下列传统分类指标中始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据的是（A ） 4.A、形态学特征 B、生理特征 C、生态学特征 D、分子生物学特征 5.下列拉丁文哪个书写格式正确（ C ） 6.A、Fusarium oxysporium B、Aspergillus japonicus Saito 7. C、Bacillus amyloliquefaciens D、Clostridium Kluyveri 8.1978年，根据16S rRNA和18S rRNA的碱基序列将生物分为“三域”的科 学家是（D ） 9.A、Ainsworth B、Bergey C、Leedale D、Woese 10.1995年，Ainsworth分类系统把菌物列入真核生物域，将其分为3个界， 下面哪项不属于其中（ D ） 11.A、原生动物界 B、假菌界 C、真菌界 D、菌物界 12.有关菌株的说法，下列哪项说法不对（ B ） 13.A、菌株强调的是遗传型纯的谱系 B、菌株的名称不可随意确定 14.C、菌株与克隆相同，为一个物种内遗传多态性的客观反映 15.D、菌株实际上是某一微生物达到遗传型纯的标志， 二、是非题 1．微生物的种是微生物分类的基本单元，但是目前还没有一个公认的、明确的定义。（√） 2．两个微生物菌株具有相同G+C含量表明它们之间的亲缘关系一定很相近。（×）
3．亚种是进一步细分种时所用的单元，一般指除某一明显而稳定的特征外，其余鉴定特征都与模式种相同的种，其命名方法按“三名法”处 理。（√） 4．变种是亚种的同义词，在《国际细菌命名法规》中不主张使用。（√）5．在微生物分类中，DNA（G+C）mol%的比较只能做否定判断。（√）6．微生物DNA之间的同源性越高，说明它们之间亲缘关系就越近，反之亦然。（×） 7．菌株是一个物种内遗传多态性的客观反应，是遗传型纯的谱系，其名称可以随意确定。（√） 8．模式菌株是一个种的具体活标本。（√） 9．据科学家1992年估计，地球上生存的菌物约有150万种。（√）10．微生物自动化鉴定技术一般都是利用微生物的生理生化反应特性而设计的。（√） 11．细菌分子鉴定常用16S rRNA序列分析，而真菌分子鉴定常用ITS序列分析。（√） 12．所谓“模式菌株”通常是指一个细菌的种内最具代表性的菌株。（×）13．对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。（√） 14．现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。（×） 15．DNA-DNA杂交主要用于种、属水平上的分类研究，而进行亲缘关系更远(属以上等级)分类单元的比较，则需进行DNA-rRNA杂交。（√）
一、填空： 1．微生物菌种的命名采用"双名法",即由属名和种名加词构成。 2．来源于一个细胞在固体平板培养基上形成的群体称菌株。 3．1969年将生物界分成了五界，分别是动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界。4．细菌的分类单元分为七个基本的分类等级，由上而下依次为_界、_门__、纲、目、科、属、种。 5．生物分类的传统指标为形态特征、生理生化反应、和生态特性。 6．形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其主要原因为具有相对稳定性_和易观察。 7．分类学的内容包括_细菌分类_、放线菌分类和真菌分类_三部分，目前进行细菌分类和鉴定的重要参考书目是_《伯杰氏细菌鉴定手册》。 8．微生物分类和鉴定的特征包括_形态特征_和_生理生化反应_，其中__形态特征_对鉴定微生物的系统发育有决定性作用，而_生理生化反应_可作为判断亲缘关系的参考而且对以实用为目的的分类鉴定仍有重要价值。 9．核酸分子杂交_和_rRNA寡核苷酸编目分析__是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。 10．1978年，Woese等提出新的生物分类概念，根据16SrRNA的碱基序列将生物清晰地划分为三原界，即细菌域、古生菌域和真核生物域。 11．对微生物命定学名的表示方法分双名与三名两种。 12．在生物的界级分类学说研究中,1978年由R．H．whittake和“提出了一个崭新的三域学说。13．填写以下10个数据：(1) 对牛奶等进行巴氏消毒时常用 63 ℃的温度；(2)用液氮保藏微生物的温度为 -196 ℃；(3)通常细菌的最适培养温度为 37 ℃：(4)用烘箱进行的干热灭菌温度一般为 150～170 ℃；(5)的代时一般为 17 min；(6)典型的酵母菌S．cerevisiae的代时一般为 120 min，其大小一般为～10 X ～21um 。（7）至今已记载的微生物约 20万种（1995）；(8)我国卫生部门规定自来水中所含的大肠菌群数不得超过 3个/L ；(9)细菌总数不得超过 100个/ml 。 14．血清学反应是抗原和抗体之间发生的反应。 15.在鉴定菌种的一些现代方法中，有核酸分子杂交，rRNA寡核苷酸编目分析，全基因组测定，数值分类等方法。 二、选择题： 1．同种菌不同来源的纯培养称为（ C ） （A）种 (B)变种 (C)菌株 (D)群 2．试排出生物分类等级的正确顺序（D） (A)目→纲→界→门 (B)界→纲→目→门 (C)目→纲→门→界 (D)界→门→纲→目 三、判断题 1．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。√ 2．具有相同G+C含量的生物表明它们之间一定具有相近的亲缘关系。× 四、名词解释 1.种：是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 2.新种：从自然界中分离得到的某一微生物的纯种，如果与文献上记载的典型种的特征有明显差异，即为新种。 3．培养物：根据一定的目的，在培养基上培养的微生物称为培养物。
微生物培菌工知识试卷A 一、选择题（150×0.5/） 1、为在光学显微镜能够看到细菌的荚膜，通常使用下列哪种染色剂进行染色。(D) A 孔雀绿 B 结晶紫 C 硝酸银 D 碳素墨水 2、发现第一个有实用价值抗生素的微生物学家是(C) A Elhrich B Domagk C Fleming D Wakmsan 3、脂多糖中的类脂A是G阴性细菌细胞壁组成成分，但它是下列哪种毒素的毒性中心？(C) A 类毒素B外毒素C内毒素D抗毒素 4、下面哪类细菌形成的菌落，往往外形很不透明或有“干燥”之感，并且表面一般有粗糙和皱褶感。(A) A 产芽孢 B 产荚膜C具鞭毛D具伴孢晶体 5、衣原体与病毒的共同特性是(B) A具核糖体，能合成蛋白质B依赖宿住获得A TP C对抗生素不敏感D二分裂方式繁殖 6、测量细菌个体大小最常用的方法是下面的哪一种？(A) A采用显微镜测微尺B通过摄影法 C 通过照相制成图片，再按放大倍数测算D测定分子量大小 7、细菌细胞膜是一个重要的代谢中心，因此细菌细胞(A) A 可以没有细胞壁绝不能没有细胞膜B既不能无壁也不能无膜 C可以无膜但不能无壁D以上答案都不对 8、若在光学显微镜下观察细菌的细致形态和主要构造时，是否需要进行染色。(B) A一般不需要B一般都需要C没有必要 D 不一定 9、在发明哪种技术以前，人们是无法了解某种微生物对人类或自然界的具体作用的。(C) A显微镜技术B染色技术C纯种分离技术D消毒灭菌技术 10、根据下列哪项指标可将微生物分为原核微生物、真核微生物和非细胞微生物3大类群。(C) A不同进化水平B性状上的明显差异 C不同进化水平和性状的显著差异D个体形态和结构 11、能产生大量分枝和气生菌丝的放线菌菌落，与培养基的结合，往往具有如下特征。(D) A较松、极易挑取B较松，易挑取C较紧、容易挑取 D 较紧、不易挑取 12、微生物通常是指个体小于以下一数字的微小生物。(B) A 1mm B 0.1mm C 0.01mm D 0.001mm 13、立克次氏体与病毒的共同特点是。(B) A 以二均分裂方式繁殖B专性细胞内寄生C对抗生素不敏感D能通过细菌滤器 14、细菌芽孢具有极强的抗逆性，因此，能否灭某些有代表性细菌的某种细胞结构是衡量各种消毒灭菌措施是否有效的主要指标，这种结构是。(B) A 营养细胞B芽孢C芽孢囊 D 伴孢晶体 15、链霉菌菌落表面的典型特征是。(D) A粘稠B奶油状C膏状D颗粒、粉质或绒状 16、引起流行性斑疹伤寒的主要病原体是。(A) A衣原体B立克次氏体C支原体 D 螺旋体 17、至今人类已知的微生物种数达。(A) A 10万种B15万种 C 20万种D 30万种 18、实验室中常选用下面哪种菌为材料来研究细胞膜的化学组成和有关性质。(A) A 革兰氏阳性菌 B 革兰氏阴性菌 C 球状体 D 伤寒杆菌 19、引起沙眼的主要病原体是。(A)
动物界 植物界 真菌界酵母菌、霉菌、担子菌微生物原生生物界单细胞藻类、原生动物 原核生物界细菌、放线菌、蓝细菌、 立克次体、支原体、衣原体 病毒界病毒 微生物的分类和鉴定的相关概念： 微生物的分类和鉴定离不开以下三步： ⑴获得该微生物的纯培养物 ⑵测定一系列鉴定指标 ⑶查找权威性鉴定手册 现代微生物分类方法的依据主要有： ⑴核酸分析 ⑵DNA杂交试验 ⑶细胞壁成分分析 ⑷红外光谱 微生物的分类单位依次为：界、门、纲、目、科、属、种。在科与属之间可加“族”。上述分类单位中以“种”概念的界定最为关键。
种的概念： 种是一个分类的基本单位。它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其它种有着明显差异的菌株的总称。在微生物分类学中，一个种只能用该种内的一个典型菌株来作为具体标本，这个典型菌株就是该种的模式种。 变种是对种的进一步细分的单元。从自然界分离到某一微生物的纯种，必须与已知的典型种所记载的特征完全符合，才能鉴别为同一个种。有时分离到的纯种却有某一特征与典型菌种不相同，其余特征都相同，而且这一特征又是稳定的，我们称这一纯种为典型种的变种。 亚种与变种是近义词，两者经常混用。有时我们将实验室获得的变异型称为亚种或小种。 菌株表示任何一个独立分离的单细胞（或病毒粒子）繁殖而成的纯种群体及其一切后代，即同种微生物的每个不同来源的纯培养物。同一菌种的不同菌株间，作为分类鉴别的主要性状是相同的，但是非鉴别用的“小”性状可以有很大的差异，尤其是生化性状，如代谢产物的产量性状等。菌株实际上是某一微生物达到“遗传性纯”的标志。一旦某菌株发生自发突变或经诱变、杂交或其它方式发生遗传重组后，均应确定新的菌株名称。
第十章微生物的分类和鉴定 一、名词解释： 01.系统学（systematics）：是研究生物多样性及其分类和演化关系的科学。分子 系统学是检测、描述并揭示生物在分子水平上的多样性及其演化规律的科学。研究内容包括了群体遗传结构、分类学、系统发育和分子进化等领域。 02.系统树：在研究生物进化和系统分类中，常用一种树状分支的图型来概括各 种（类）生物之间的亲缘关系，这种树状分支的图型也称为发育树（phylogenetic tree）。 03.分子系统树：通过比较生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分子系 统树。 04.微生物分类学（microbial taxonomy）：是一门按微生物的亲缘关系把它们安 排成条例清楚的各种分类单元或分类群的科学，其具体任务有三，即分类、鉴定和命名。 05.分类（classification）：根据文献资料，经过科学的归纳和理性的思考，整理 成一个科学的分类系统。即解决从个别到一般或从具体到抽象的问题。06.鉴定（identification）：通过详细观察和描述一个未知名称纯种微生物的各种 性状特征，然后查找现成的分类系统，以达到对其知类、辨名的目的。即解决从一般到特殊或从抽象到具体的问题 07.命名（nomenclature）：为一个新发现的微生物确定一个新学名的过程。
08.培养物（culture）：是指一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微 生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。如果某一培养物是由单一微生物细胞繁殖产生的，就称之为该微生物的纯培养物（pure culture)。 09.菌株（strain）：从自然界分离得到的任何一种微生物的纯培养物，都可以称 为微生物的一个菌株；用实验方法（如通过诱变）所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体。 10.标准菌株：指能代表这个种的各典型性状的一个被指定的菌株。 11.种群（population）：也有人译为群体、居群或群丛等，是指一定空间中同种 个体的组合。每一个物种在自然界中的存在，都有一定的空间结构，在其分散的、不连续的居住场所或分布区域内，形成不同的群体单元，这些群体单元就称为居群。 12.种（species）：是生物分类中基本的分类单元和分类等级。它是一大群表型特 征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属的其他物种有明显差异的一大群菌株的总称。 13.型（form / type）：常指亚种以下的细分，当同种或同亚种不同菌株之间的性 状差异，不足以分为心的亚种时，可以细分为不同的型。例如，按抗原特征的差异分为不同的血清型；按对噬菌体裂解反应的不同分为不同的噬菌型等等。
微生物知识点整理 第一章绪论 1、微生物的特点： A. 形体微小，结构简单 B. 种类繁多，分布广泛 C. 代类型多，代能力强 D. 生长繁殖快，培养容易 E. 容易发生变异，适应能力强 2微生物根据进化水平和细胞结构的不同，分为：原核微生物和真核微生物 具有核膜包被的真正细胞核、能进行有丝分裂、细胞质中有线粒体的微小生物，称为真核微生物。 原核微生物：细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体、衣 原体和螺旋体。 真核微生物：真菌、单细胞藻类、原生动物 第二章原核微生物 1、细菌的基本形态:球状、杆状和螺旋状 2、细菌的一般结构和特殊结构 一般结构：细胞壁、细胞膜、细胞质及含物、核区和质粒 特殊结构：糖被、鞭毛、菌毛、性毛、芽孢及其他休眠组织、菌鞘、附器 3、革兰氏染色
步骤：A初染：结晶紫B媒染：碘液C脱色：乙醇D复染：番红 原理：革兰氏阳性菌细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，网孔小，乙醇脱色时肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，且不含类脂，故不会因为乙醇处理而出现孔壁，结果结晶紫与碘的复合物仍存留在细胞壁，使之呈现紫色；革兰氏阴性菌壁薄，肽聚糖含量低，交联度小，网孔大，乙醇脱色时肽聚糖收缩不明显，且类脂含量高，被乙醇溶解使壁出现较大的孔隙，结晶紫和碘的复合物被洗去，复染时染上番红的红色 4、细菌的繁殖方式：裂殖 5、菌落：单个细菌细胞或一小堆同种细胞迅速生长繁殖形成肉眼可见的、有一定形态的子细胞群 6、放线菌：以孢子进行繁殖，分为基菌丝、气生菌丝和孢子丝为什么属于原核生物？ ①放线菌的菌丝体为单细胞，菌丝直径比真菌细，与细菌接近；②无核膜、核仁和线粒体等，核糖体为70S，属原核生物； ③细胞壁含胞壁酸，二氨基庚二酸，不含几丁质，纤维素，革兰氏染色阳性； ④对环境pH值的要近中性或微偏碱，这与细菌相近而不同于真菌 (一般偏酸性)；⑤凡能抑制细菌的抗生素也能
微生物学实验复习 3、培养基的配置原则： (1)目的要明确(根据微生物的种类、培养目的等)，如培养基可由简单的无机物组成，生产用培养基内可加入化学成 分不明确的天然物质，而分类、鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。 (2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌、放线菌和真菌的最适pH分别 为：～、～和～。 5、细菌培养基的配制过程 答：配制培养液→调节PH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面（搁置斜面的长度不超过试管总长的1/2）【问题与探究】 （1）培养基灭菌后，为什么需要冷却到50 ℃左右时，才能用来搁置斜面或倒平板你用什么办法来估计培养基的温度 【提示】琼脂的凝固点为40 ℃，温度太高易使培养皿破裂，低于40 ℃，培养基已凝固，倒不出，所以培养基灭菌后，需冷却到50 ℃左右时才能用来倒平板，可以用手触摸盛有培养基的试管，感觉试管的温度下降到刚刚不烫手时就可以进行倒平板了。 （2）为什么需要使试管口通过火焰 【提示】通过灼烧灭菌，防止试管口的微生物污染培养基。
（3）为了能彻底灭菌，在操作过程中应注意哪些事项 【提示】 使用高压蒸汽灭菌锅时，加压之前一定要把原先的空气排尽，注意恒温灭菌，同时要注意高压蒸汽灭菌锅的压力(100 kPa)、温度(121 ℃)和灭菌时间(20 min)。 6、无菌操作和接种技术 (1)接种 概念：在_无 菌 条件下将微生物接入 培养基____的操作过程。 工具：玻璃刮铲、接种针和接种环。 方法：穿刺接种、斜面划线接种和平板划线接种、涂抹平板等。 （2）无菌操作——微生物接种技术的关键 ①培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基等，在接种之前都需要 灭菌_。 ②通常接种操作要在____酒精灯火焰__的附近进行。 【想一想】 在微生物的培养过程中为什么要进行无菌操作 提示：无菌操作的目的是防止受到空气中的杂菌污染。 7、微生物的分离 （1）原理：根据微生物对_营养成分、氧气、pH 等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的必需条件，或加入某些抑制剂使非目的微生物不能生长，从而达到 选择分离 微生物的目的。 (2)方法 ①据菌落形态特征初步分离 ②常用方法——平板分离法 分类?????_____________ 混合平板法 ______________ ：是常用的平板分离法，有扇形划线、 连续划线、交叉划线和方格划线等 目的：在培养基上得到目的微生物的 单个 菌落 【归纳】无菌技术的具体内容 (1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 (2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 (3)实验操作应在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。 (4)实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触。 （5）在微生物的实验室培养中，无菌技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。 8、平板分离法 ①原理：大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落。平板分离法能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成便于移植的菌落。 ②常用培养基：最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基。 ③.方法：(1)涂抹平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品倒入预先准备好的琼脂平板，用无菌玻璃刮铲将样品涂布均匀，细菌菌落常仅在平板表面生长。 (2)混合平板法：分离材料进行10倍系列稀释，取一定稀释度样品与溶化的琼脂混合，将 与样品混合的琼脂倒入无菌平皿，细菌菌落出现在平板表面及内部。 (3)平板划线法：有扇形划线、连续划线、方格划线等。 涂抹平板法 平板划线法
微生物基础知识 1、微生物概述 （1）定义：生物界中存在的一群形体微小的生物。它的大小通常以微米来表示。 （2）范围：细菌、霉菌、酵母菌、放线菌、支原体、病毒等。（3）特点： ①形体微小、结构简单、生长繁殖快、对物质有强烈的转化作用； ②种类繁多； ③易引起变异； ④数量大、分布广、环境适应性强； （4）与人类的生活密切相关。 2、微生物的分类 微生物可分为八大类： 真菌：蘑菇、霉菌、酵母菌、念珠菌 细菌：肺炎球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌 放线菌： 支原体：肺炎支原体 衣原体：沙眼 立克次体：斑疹伤寒 螺旋体：梅毒 病毒：甲、乙肝病毒，麻疹病毒，狂犬病毒，流感病毒。
（1）按其结构、化学组成可分为： ①原核类：仅有原始核质，无核仁和核膜，细胞器很不完善。如细菌、放线菌、支原体、立克次氏体； ②真核类：细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体，细胞器完整。如真菌（酵母菌和霉菌），原生动物，藻类： ③非细胞类：体积微小，能通过除尘过滤器。如病毒和朊病毒。（2）按其致病性可分为： ①病原性微生物：有致病性； ②非病原性微生物：无致病性； 3、微生物的五大共性 （1）体积小，面积大 （2）吸收多，转化快 （3）生长旺，繁殖快 （4）适应强，易变异 （5）分布广，种类多 4、影响微生物生长的因素 （1）温度：在各种影响微生物生长繁殖的因素中，温度起着最重要的作用，每种微生物都一个最适宜的生长温度，在这种温度下，增代时间最短。一般来讲，高温能杀死微生物，低温可抑制微生物生长；（2）PH值：酸碱环境对微生物的影响；
（3）氧气：真空环境可抑制需氧菌的生长； （4）光线； （5）盐类； （6）水分活性。 5、常见污染药物制剂的微生物 （1）葡萄球菌：可引起局部感染 （2）大肠杆菌：胆道和尿道感染 （3）绿脓杆菌：化脓性感染、中耳炎、肺炎 （4）枯草杆菌：结膜炎 （5）酵母菌：使糖分解，药液产生有机酸 （6）霉菌：是制剂霉坏，酸败变质 6、洁净车间内微生物在哪里？ （1）空气 （2）水 （3）人员 （4）器具 灰尘-----“微生物的飞行器” 微生物不是凭空存在的，99%的微生物都附在颗粒上。控制空气中的微粒数，就是控制了微生物数量。 灰尘、微粒具有沉降和粘附的趋势，所以同一区域内，地面是微
一．绪论 1.微生物:肉眼难以看清、需要借助光学显微镜或电子显微镜才能观察到的一切微小生物的 总称。 分类：无细胞结构：病毒、亚病毒因子 有细胞结构：原核生物、真核生物 六界系统：占4界，病毒界、原核生物界、原生生物界、真菌界 三域学说：古菌域、细菌域、真核生物域 2.列文虎克：微生物学的开拓者、世界上第一个观察到微生物的人——1676 巴斯德：微生物学的奠基人、否定“自然发生”学、说证明微生物引起发酵、制备疫苗预防疾病、发明巴斯德消毒法 科赫：细菌学的奠基人、发明固体培养基、分离出病原菌、提出“科赫法则”、创立显微镜技术 布赫纳：用酵母菌无细胞压榨汁将葡萄糖进行酒精发酵取得成功，发现了微生物酶的重要作用、从此将微生物学推到了生化研究的阶段。 3.微生物的特点： （1）形态微小结构简单（2）代谢旺盛繁殖快速（3）适应性强容易变异 （4）种类繁多分布广泛（5）食谱广、易培养、起源早、休眠长 二．原核微生物 第一节：细菌 1.细菌的基本形态：杆状、球状、螺旋状 2.细菌的大小：度量细菌细胞大小常用的单位是微米um。1m=103mm=106um=109nm. 大肠杆菌可作为典型的细菌细胞大小的代表，平均长度约为2um，宽
0.5um。最小到最大：50nm~0.75mm，相差一万倍。 3.细胞壁的功能：（几乎所有细菌（除支原体外）都有细胞壁） （1）保护细菌免受机械性或其他外力的破坏。 （2）维持细胞特有的形状 （3）屏障保护功能 （4）提供细胞的生长、分裂和鞭毛的着生、运动所必需的结构 （5）赋予细胞特定的抗原性、致病性和对抗生素及噬菌体的敏感性。 4.革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁结构比较 5.细菌的革兰氏染色机制 阳性：肽聚糖的含量与交联程度都比较高，肽聚糖层多，所以细胞壁较厚，壁上的间隙较小， 媒染后形成的结晶紫—碘复合物就不易被洗脱出细胞壁，加上它本来就不含脂质，乙醇洗脱时细胞壁非但没有出现缝隙，反而使肽聚糖层的网孔因脱水而变得通透性更小，结果蓝紫色的结晶紫—碘复合物就留在细胞内而使细胞呈蓝紫色。