第四章 叶绿素荧光技术应用
第一节 叶绿素荧光参数及其意义
韩志国，吕中贤（泽泉开放实验室，上海泽泉科技有限公司，上海，200333）
叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法，已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最广泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统 II 的叶绿素 a ，而光系统 II 处于整个光合作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统 II ，进而引起叶绿素 a 荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量方法相比，叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的应用。
1 叶绿素荧光的来源
藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能，也可以间接获取其它捕光色素（如类胡萝卜素）传递来的能量。叶绿素分子得到能量后，会从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。根据吸收的能量多少，叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光，则跃迁到较高激发态；若叶绿素分析吸收红光，则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，会在几百飞秒（fs ，1 fs=10－15 s ）内通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图 1）。而最低激发态的叶绿素分
子可以稳定存在几纳秒（ns ，1 ns=10－9
s ）。 A 较高激发态 B 热耗散
吸收蓝
光 吸收红光 最低激发态 能量
荧光 基态
蓝
波长
红
荧光
图 1 叶绿素吸收光能后能级变化（A ）和对应的吸收光谱（B ）（引自韩博平 et al., 2003）
处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径（图 2）释放能量回到基态(韩博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）将能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后传递给反应中心叶绿素 a ，用于进行光化学反应；2）以热的形式将能量耗散掉，即非辐射能量耗散（热耗散）；3）放出荧光。这三个途径相互竞争、此消彼长，往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言，叶绿素荧光发生在纳秒级，而光化学反应发射在皮秒级（ps ，1 ps=10－12 s ），因此在正常生理状态下（室温下），捕光色素吸收的能量主要用于进行光化学反应，荧光只占约 3%～5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。 在活体细胞内，由于激发能从叶绿素 b 到叶绿素 a 的传递几乎达到 100％的效率，因此基本检测不到叶绿素 b 荧光。在常温常压下，光系统 I 的叶绿素 a 发出的荧光很弱，基本可以忽略不计，对光系统 I 叶绿素 a 荧光的研究要在 77 K 的低温下进行。因此，当我们谈到活体叶绿素荧光时，其实指的是来自光系统 II 的叶绿素 a 发出的荧光。
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图2激发能的三种去激途径（引自韩博平et al., 2003）
LHC，捕光色素蛋白复合体。
2 叶绿素荧光的研究历史
在19世纪就有了关于叶绿素荧光现象的记载。最初是在1834年由欧洲传教士Brewster发现，当强光穿过月桂叶子的乙醇提取液时，溶液的颜色由绿色变成了红色。1852年Stokes认识到这是一种光发射现象，并创造了“fluorescence”一词。
1931 年，德国科学家 Kautsky 和 Hirsch 用肉眼观察并记录了叶绿素荧光诱导现象，明确指出暗适应处理的叶片照光后的诱导过程中，叶绿素荧光强度的变化与CO2固定呈相反的关系(Kautsky and Hirsch, 1931;Govindjee, 1995)，此后的10 余年中，Kautsky 和他的学生Franck 就这一现象作了系统的研究(Kautsky and Franck, 1943)。在Kautsky 研究的基础上，后人进一步对叶绿素荧光诱导现象进行了广泛而深入的研究，并逐步形成了光合作用荧光诱导理论，被广泛应用于光合作用研究。由于Kautsky的杰出贡献，叶绿素荧光诱导现象也被称为Kautsky效应（Kautsky Effect）。
从1960年代到1980年代早期，叶绿素荧光这一生物物理学的技术被广泛用于光合作用基础研究，很多重要发现都与这一技术有关，如光合作用存在两个光反应的提出(Duysens and Sweers, 1963)就是采用的这一技术应用的典型代表。但在那个年代，所有的叶绿素荧光测量都只能在完全遮蔽环境光的“黑匣子”里进行，这大大限制了叶绿素荧光技术在植物胁迫生理学、生理生态学和植物病理学等领域的应用。因此在很长一段时间中，叶绿素荧光技术在基础研究和应用研究的使用中存在一个鸿沟。尽管如此，情况还是在逐步好转。这是因为虽然叶绿素荧光信号虽然复杂，但确实提供了可靠的、定量的信息，并且可以由越来越小型化的仪器来进行测量。
1980 年代中期，德国乌兹堡大学的 Schreiber 提出了叶绿素荧光测量的饱和脉冲理论，并发明了脉冲- 振幅-调制（Pulse-Amplitude-Modulation）叶绿素荧光仪(Schreiber, 1986; Schreiber et al., 1986)，也就是今天大名鼎鼎的调制叶绿素荧光仪PAM。Schreiber早年师从Kautsky的学生Franck，在后者的指导下很早就开始进行叶绿素荧光研究(Schreiber et al., 1971; Gielen et al., 2007)，并在1975年就设计出了科研界第一款便携式叶绿素荧光仪(Schreiber et al., 1975)。但受限于光电技术的发展，当时这款荧光仪只能测量叶绿素荧光诱导曲线，不能进行深入的淬灭分析，直到PAM的出现才解决了这个问题。
调制叶绿素荧光仪PAM和调制叶绿素荧光测量技术在叶绿素荧光的研究历史上具有里程碑意义。它采用了调制技术进行测量，从而可以在有环境光照（甚至是很强的太阳光）的情况下记录叶绿素荧光信号；
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它采用了饱和脉冲技术，使得光化学淬灭和非光化学淬灭的测量成为可能。PAM面世后，很快就替代了传统的光合放氧和CO2同化技术，成为使用最广泛的光合活性测量技术。
早期的调制叶绿素荧光仪主要在实验室内进行测量，到了1990年代发展到可以非常方便的在野外现场测量。早期的仪器采用光电二极管作为检测器，只能测量叶片或细胞浓度很高的藻液，后来采用光电倍增管后可以直接检测大洋海水的叶绿素荧光。随着技术的发展，陆续出现了叶绿素荧光成像测量技术、水下原位叶绿素荧光测量技术、显微叶绿素荧光测量技术、无线远程叶绿素荧光测量技术和利用叶绿素对浮游植物进行分类的技术等，这些技术均在藻类学界得到了广泛的应用。
3 调制叶绿素荧光原理
为了更好的理解调制叶绿素荧光，首先要知道“荧光强度（intensity）”和“荧光产量（yield）”的区别。“荧光强度”的高低依赖于激发光的强度和仪器的信号放大倍数，其变化可以达到几个数量级的幅度。而“荧光产量”可以理解为固定仪器设置下的荧光强度，其变化不会超过5-6倍，是真正包含了光合作用信息的参数。例如针对一个暗适应处理后的样品，照射0.5 mol m-2s-1的测量光后，其荧光产量是非常稳定的。假设此时仪器的增益设置为1，荧光强度为300 mV；当仪器的增益设置改为3后，荧光强度变为900 mV。但实际上由于激发光恒定，样品发出的荧光产量是恒定的，只是在不同的信号放大倍数下检测到的荧光强度不同而已。
理想的荧光仪必须能在不改变样品状态的情况下（即非破坏性）进行生理活性测量，需要满足如下几条要求(Schreiber, 1986; Schreiber et al., 1986; Schreiber, 2004)：
1）测量光必须足够低，只激发色素的本底荧光而不引起光合作用，这样才能获得暗适应后的最小荧光Fo；
2）测量光由一系列微秒级的光脉冲组成，这些短光脉冲可以不同的频率给出。在很低的频率下，即使单个微秒级光脉冲的强度比较高，也不会引起光合作用；
3）用反应迅速、线性范围大的光电二极管（或光电倍增管）来检测这些由微秒级测量光脉冲激发的微秒级荧光脉冲；
4）荧光脉冲信号首先由交流耦合放大器放大，然后进一步经选择性锁相放大器处理，只放大和调制测量光同频率的荧光信号，可以有效屏蔽环境中本身就存在的与叶绿素荧光同波长的背
景噪音（这就好比选择调频收音机的某个频道，就可以在浩如烟海的无线电波噪音中获得选
择性接收您需要的无线电波，采用调制技术，可以在大量的环境光背景噪音中选择性测量叶
绿素a发出的荧光）；
5）当打开光化光或饱和脉冲时，可以自动提高测量光频率，以提高信号采点率，有效记录一些比较快速的荧光动力学变化（如荧光快速上升动力学）。
调制叶绿素荧光仪有两大核心技术，一个是上文提到的光调制技术，有了它才能使得我们在有环境
光的情况下测量叶绿素荧光；另一个就是饱和脉冲技术。
所谓饱和脉冲技术，就是提供一个瞬间的强光脉冲，来暂时打断光系统II电子传递过程。我们已经知道，光合机构吸收的光能有三条去激途径：光化学反应（Photochemistry, P）、叶绿素荧光（Fluroescence, F）和热耗散（Dissipation, D）。根据能量守恒原理，假设吸收的光能为常数1，得到1=P+F+D。叶绿素荧光产量可以测量出来，而我们希望得出P和D两个参数。根据基本的数学原理，一个等式有两个未知数是无解的。此时如果给出一个饱和脉冲，暂时打断光化学反应过程，则P=0，这个等式就可以求解了。由此可知，饱和脉冲技术的基本作用就是打断光合作用，用于求出光化学反应和热耗散分别用去了多少能量。
早期，科研人员只能通过人为加入农药敌草隆（DCMU）来阻断光系统II的电子传递过程，从而获得最大荧光Fm，而这是不可逆的。后来，Schreiber在“光强倍增”技术(Bradbury and Baker, 1981; Quick and Horton, 1984)的基础上提出了“饱和脉冲”技术(Schreiber et al., 1986)。饱和脉冲技术的最大优点在于，它是暂
时阻断光系统II的电子传递过程，由于持续时间很短（一般0.2-1.5 s），因此饱和脉冲关闭后光合电子传递会在极端的时间内恢复运转。所以说这是一种可逆的过程，正是有了饱和脉冲技术，我们才能不破
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坏样品的完整性就获得其光合生理参数。
4叶绿素荧光诱导曲线和典型参数
从Kautsky 发现叶绿素荧光诱导现象并提出其与光合作用的关系后，80 多年来利用叶绿素荧光研究光合作用采用的最主要技术就是荧光诱导曲线。那么什么是叶绿素荧光诱导曲线呢？测量叶绿素荧光诱导曲线能获得哪些生物信息呢？
所谓叶绿素荧光诱导，就是将样品在黑暗的状态下适应一段时间，然后照射光化光，观察样品的光合机构从暗转到光下的响应过程。为什么要暗适应呢？在光合电子传递链上有一个叫做质体醌（PQ）的载体，是整个电子传递过程的限速步骤，可以通俗的称之为电子门。在光合膜上PQ的数量与捕光色素吸收的光子数（微摩尔级）相比是微不足道的。因此光合作用进行时，光系统II释放出的电子总是有部分会累积在电子门PQ处，这部分处于还原态（累积电子）的电子门就处于关闭态，或者说光系统II的反应中心处于关闭态。在暗适应过程中，光系统II无法获得光能激发，因此不会继续释放电子，累积在PQ处的电子会继续往光系统I传递，直到所有电子都传递完毕。当PQ处不再累积电子后，暗适应就足够了。
暗适应结束后，就可以照光进行荧光诱导了。那么采用什么光进行诱导呢？只要能够引起光合作用的光也就是波长在400-700 nm的可见光，都可以进行荧光诱导，我们给它一个专业术语叫做光化光（Actinic Light），也有人翻译为作用光。在光合作用领域，400-700 nm 的光也被称为光合有效辐射（Photosynthetic Active Radiation, PAR）。光化光可以为人工光，如来自日光灯、卤素灯或发光二极管的光，也可以为自然光（直接或间接的太阳光）。但为了使我们的实验具有可重复性，多数荧光诱导的测量会采用仪器提供的恒定光强的人工光（新型仪器多以光强稳定的发光二极管为主）来诱导。只有保证测量条件一致，才能对不同材料或不同处理的样品进行直接比较。
图3叶绿素荧光诱导曲线（韩志国and吕中贤，未发表数据）
SP，饱和脉冲（Saturation Pulse）；AL，光化光（Actinic Light）。
Fo，最小荧光；Fm，最大荧光。
整个测量过程中调制测量光需要一直打开。
图3是一条典型的叶绿素荧光诱导曲线，其测量步骤如下：
1）样品首先暗适应处理一段时间，以便累积在PQ 处的所有电子都被传走，光系统II 的所有反应中心都处于开放态。然后打开测量光（Measuring Light, ML），记录暗适应后的最小荧光Fo。测量光很
弱（一般小于1μmol m-2s-1），只激发色素的本底荧光但不足以引起任何的光合作用。
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2）紧接着打开一个持续时间仅有 0.2-1.5 s 的饱和脉冲（Saturation Pulse，SP），测量暗适应后的最大荧光Fm。饱和脉冲打开后，由光系统II处释放的电子迅速将PQ全部还原（电子门全部关
闭），光化学反应被打断，光能全部转化为叶绿素荧光和热量，荧光迅速达到最大值Fm。饱和
脉冲的强度非常强，高等植物一般要求达到8000-10000μmol m-2s-1，藻类一般大于4000
μmol m-2 s-1即可。
3）饱和脉冲关闭后荧光迅速回到 Fo 附近，然后打开光化光（Actinic Light，AL），记录叶绿素荧光从黑暗转到光照的响应过程。如上所述，光合作用进行时，总是有部分电子门处于关闭态。这部分处
于关闭态的电子门本应用于光合作用的能量就转化为了叶绿素荧光和热。饱和脉冲关闭后，电子
门迅速全部打开。此时打开光化光，光系统II瞬间释放出大量电子，导致许多电子门被关闭，因
此实时荧光迅速上升。此时，光合器官会迅速启动调节机制来适应这种光照状态，光系统I逐渐
从PQ处获取电子。在恒定的光化光强度下，PS II释放的电子数是恒定的，因此随着时间的延
长，处于关闭态的电子门越来越少，荧光逐渐下降并达到稳态。此时，处于关闭态的电子门数量
达到动态平衡，也就是说光系统II和光系统I达到了动态平衡。
4）等荧光曲线达到稳态后关闭光化光，并结束整个测量过程。有时，为了精确的获得 Fo’这个参数，会在关闭光化光的同时打开一个持续几秒的远红光（Far-red Light, FL）（图3中未示
出），以加快电子从PQ向光系统I的传递。
根据图3中的Fo和Fm，可以计算出光系统II的最大光合效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(Kitajima and Butler, 1975)，它反映了植物的潜在最大光能转换效率。这是用得最广、使用频率最高的一个参数。早在 1987 年
科研人员就已经阐明多数健康维管束植物的Fv/Fm值为0.832 0.004(Bj?rkman and Demmig, 1987)。目前科研界已基本达成共识，在健康生理状态下，绝大多数高等植物的Fv/Fm在0.8-0.85之间，当Fv/Fm 下降时，代表植物受到了胁迫。因此，F v/F m是研究光抑制或各种环境胁迫对光合作用影响的重要指标。
对藻类而言，由于其进化程度差异大，健康生理状态下的Fv/Fm没有很固定的值。但笔者结合大量文献报道和实际经验，总结出了一些基本的规律。如绿藻门的最大Fv/Fm一般在0.7-0.75之间，没有很大的种间差异性；硅藻门和甲藻门的最大Fv/Fm一般在0.65-0.7之间，也没有很大的种间差异性。对蓝藻门和红藻门而言，由于其捕光结构为藻胆体，而藻胆体可以在光系统II和光系统I之间滑动，造成不同的藻之间没有可以直接比较的最大Fv/Fm值。
若在打开光化光进行叶绿素荧光诱导的过程中，间隔一段时间打开一个饱和脉冲，则可以将光化学反应和热耗散计算出来。图4就是利用这种方法测量出的叶绿素荧光诱导曲线。
图4带淬灭分析的叶绿素荧光诱导曲线（韩志国and吕中贤，未发表数据）
打开光化光进行光合诱导时，在PQ处会累积电子，只有部分电子门处于开放态。如果给出一个饱和
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