叶绿素荧光研究背景知识介绍
前言
近些年来，叶绿素荧光技术已经逐渐成为植物生理生态研究的热门方向。荧光数据是植物光合性能方面的必要研究内容。目前这种趋势由于叶绿素荧光检测仪的改进而得到发展。然而荧光理论和数据解释仍然比较复杂。就我们所了解的情况来看，目前许多研究者对荧光理论不是很清楚，仪器应用仅仅限于简单的数据说明的基础上，本文在此基础上，目的在于简单明晰地介绍相关理论和研究要点，以求简单明确地使用叶绿素荧光检测设备，充分分析实验数据，重点在于植物生理生态学技术的应用和限制。
荧光测量基础
植物叶片所吸收的光的能量有三个走向：光合驱动、热能、叶绿素荧光。三个过程之间存在竞争，其中任何一个效率的增加都将造成另外两个产量的下降。因此，测量叶绿素荧光产量，我们可以获得光化学过程与热耗散的效率的变化信息。尽管叶绿素荧光的总量很小(一般仅占叶片吸收光能总量的1-2%)，测量却非常简单。荧光光谱不同于吸收光谱，其波长更长，因此荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射，同时测量发射光中波长较长的部分光线的量来实现。有一点需要注意的是，这种测量永远是相对的，因为光线不可避免会有损失。因此，所有分析必须把数据进行标准化处理，包括其进一步计算的许多参数也是如此。
调制荧光仪的出现是荧光研究技术的革命性的创新。在这类仪器中，测量光源是调制(高频率开关)的，其检测器也被调谐来仅仅检测被测量光激发的荧光。因此，相对的荧光产量可以在背景光线(主要是指野外全光照的条件下)存在的条件下进行测量。目前绝大多数的荧光仪采用了调制系统，同时也强烈建议选择调制荧光仪(Kate Maxwell,2000)。
为什么荧光产量会发生改变？Kautsky效应和Beyond
叶绿素荧光产量的变化最早在1960年被Kautsky和其合作者发现。他们发现，当把植物叶片从黑暗中转入光下，荧光产量瞬间上升(大约在1秒左右)这种上升可以解释为光合途径中电子受体的还原(可接受电子的受体的减少)。一旦PSII吸收光能，初级电子受体Q A(质体醌)接受了电子，它将不能再接受电子，直到它把电子传递给下一级电子载体Q B。此期间，反应中心是关闭的，反应中心关闭的比
例导致光化学效率的整体下降，进而造成荧光产量的增长。
当叶片从黑暗条件转入光下，PSII(光系统2)反应中心逐渐关闭，这造成了叶绿素荧光产量(1秒钟之内)的上升，在此之后，荧光产量开始下降，持续大约几分钟或几十分钟，这种现象，被称为荧光淬灭。首先，电子被从PSII传递走的速率开始上升，这是由于光诱导对C代谢酶的活化和气孔开放的活化，这种淬灭被称为光化学淬灭。同时，能量转化为热能的效率也提高了，这种过程被称为“非光化学淬灭”(NPQ)。典型植物中，这两个过程变化将在15-20分钟内完成并达到稳定状态。当然这种时间在不同的植物种类之间差异明显。
荧光信号分析
为了通过叶绿素荧光产量的测量来获得植物光合性能的有用信息，我们有必要区分光化学过程与非光化学过程对淬灭的贡献的差异。通常的方法是关闭两者之一，尤其是光化学过程，这样我们就可以测量另外一种情况的影响。传统的方法是加入化学物质，如敌草隆(DCMU)，这种物质抑制PSII活动，从而把光化学降到零。现在的方法是“加光”技术，即它允许光化学淬灭的贡献瞬时减低到零。这种方法中，使用了高光强的短持续时间的光线(光脉冲，一般在0.8秒左右)，这种方法可以在瞬间关闭PSII反映中心。假如这种闪光脉冲时间足够短的话，没有非光化学淬灭的发生，同时也没有诱导光化学效率的长期变化，那么在闪光期间，此时的荧光产量相当于没有光化学淬灭时达到的最大荧光(Fm)。如果我们把光照下荧光稳定状态(Fs)和活化光不存在下荧光产量的数值(Fo)相比较，我们就得出了光化学淬灭效率(可以理解为PSII的性能)的信息。
随着光化学效率的变化，热耗散(非光化学效率)效率也发生了改变，这取决于多种内部和外部因素。这种变化可以通过Fm值的变化来体现，和光化学淬灭不同，我们不可能阻断热耗散的发生，因此不可能测量非光化学淬灭不存在的时候叶绿素荧光的产量。因此，所有非光化学淬灭的估计严格对应于暗适应点(Fm o)。由于这个原因，我们有必要设计这样一种实验，通过这种实验，我们可以估计暗适应的非胁迫的参考点。这种需求是野外条件(通常估计Fm的黎明前的值)的主要限制。
淬灭分析
测量过程可以通过图1来很好地解释。测量开始时首先打开测量光，测量最小荧光信号(Fo)，然后给一个强闪光，测量暗适应状态的最大荧光(Fm o)。紧接着，打开活化光进行持续光照(或者利用野外自然光线进行照射)，并且每隔一个间隔，重复一次饱和闪光照射，通过这个过程，光照下的最大荧光Fm’可以测量到。闪光之前的稳态荧光称为Fs，闪光后，关掉活化光(同时给一个瞬时的远红外光线照射)可以测量Fo’。
图1 典型荧光测量顺序
表1 通常使用的荧光参数
光化学过程
光化学淬灭参数总是和Fm’和Fs的值相关的。最有用的信息是PSII光化学效率(ΦPSII)。这个参数测量了与PSII相关的叶绿素吸收的光用于光化学过程的比例。它可以提供线性电子传递的速率测量(整个光合的指示)。在实验室条件下，这个参数与C固定的效率有显著的线性关系，然而这两个参数在一定的胁迫条件下会存在差异，这是由于光呼吸速率或Pseudocyclic电子传递速率的改变。由于ΦPSII是PSII光化学的量子产量，它可以用于计算线性电子传递速率(J)，因此，光合速率可以描述为：
J=ΦPSII×PFDa×0.5
这里PFDa是吸收的光强(μmolm-2s-1)，0.5是在PSII和PSI之间能量的分配系数。另外一个广泛应用的参数是光化学淬灭qP。尽管与ΦPSII很相似，但是qP是PSII反应中心开放的比例，相反1-qP 是反应中心关闭的比例。ΦPSII和qP都和Fv/Fm(PSII内禀效率，即所有PSI反应中心全部开放)相关联。Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm=ΦPSII/qP。qP的变化由于饱和光导致的反映中心的关闭。Fv/Fm的变化是由于非光化学淬灭的效率的变化。暗适应的Fv/Fm反应了潜在的PSII的量子效率，可以用于植物光合能力的灵敏的指示，绝大多数植物在0.83左右。低于此值将说明植物处于胁迫，尤其是光抑制现象。
qP和Fv/Fm估计的困难在于需要估计测量时的Fo值。在实验室中，这通常可以通过遮挡植物叶片和远红外光线照射几秒种。后者可以确保所有PSII反应中心迅速开放。然而在野外的条件下，遮光仍然存在困难，一般是通过黑布瞬时遮光并同步提供远红外光线照射。
非光化学过程
需要暗适应的问题在量化非光化学淬灭时依然存在。需要测量Fm的暗适应值。这个值在实验室通常采取24小时的暗适应，而且在实验开始之前不能存在任何胁迫。这个过程是为了获得光化学效率最大，热耗散最小的Fm的参考值。可以在黎明前测量Fm值并用做参考值，黎明前Fv/Fm的变化可以说明环境胁迫对植物的影响。量化非光化学淬灭的最直接的方法是Fm的改变除以Fm的值：
NPQ=(Fm o-Fm’)/Fm’
NPQ和热耗散线性相关，其范围大致在0-具体的数字。在一个典型植物中，在饱和光强下大致在0.5-3.5之间。这取决于物种和植物以前的经历过程。qN是非光化学淬灭的比较传统的(老的)术语，有的时候也会被用到。它的范围在0-1之间，因此在淬灭较高时不很敏感。同样的淬灭在参考点淬灭较高时可能会表现为很小的上升，因此直接的比较不很明确。通常，如果暗适应的Fv/Fm明显不同，那
么NPQ也不能直接进行比较。
一般而言，非光化学淬灭的增长可能是由于叶片为免受光破坏的保护机制。研究此过程的一种方法是照光后弛豫的速率。不同的过程有不同的弛豫速率。其时间范围从几分钟到几个小时。这些不同过程的弛豫(Relaxation)动力学用于区分他们。
绝大多数条件下，对NPQ的主要贡献，是高能状态淬灭(也被成为qE)，也被认为在保护叶片免受光诱导破坏的过程中是必须的。当叶片转入黑暗时，高能状态淬灭在几分钟内弛豫。第二个过程称为状态转化，范围为几分钟(qT)。状态转化涉及捕光蛋白可逆磷酸化过程，被认为在低光条件下平衡光能在PSI和PSII之间的分配中非常重要。这两种形式不容易通过弛豫动力学中分离出来。然而qT 通常只对整个淬灭起到很小的贡献而且仅在低光下存在。一般认为，几分钟内的弛豫过程都被认为是蛋白磷酸化过程。
较长时间尺度的弛豫过程通常归因于光抑制(qI)。为更好地理解快速与慢速淬灭的贡献，我们需要进行弛豫分析来测量。实验中，淬灭执行弛豫，在固定间隔内测量Fm的值，间隔选择非常重要，因为，必须保证前一次闪光在间隔期内被充分弛豫。一般而言，5分钟的间隔是充足的，整个弛豫的持续时间在45-60分钟之间。在此基础上做图，横坐标是时间，纵坐标是Fm。数据点可以推断至活化光被关闭的时间。如果在光下仅存在慢速弛豫淬灭，就可以计算Fm(Fm r)的值。慢速和快速弛豫淬灭可以通过以下公式计算：
NPQs=(Fm o-Fm r)/Fm r
NPQ F=(Fm o/Fm’)-(Fm o/Fm r)
NPQ的程度和组分已经被成功用于研究不同基因型和不同表现型之间光保护和光抑制的差别。研究表明，基因型之间在NPQ方面存在差异。在高光生长下和低光条件下不同生态型的qE更高。这样的测量过程在野外不可能实现，一般方法是在关闭光源2-5分钟后单一的闪光来用于估计Fm r。5分钟后，可能快速弛豫仍然存在，所以此时会造成NPQ F的低估和NPQs的高估。而在野外条件下30分钟
后的闪光可以给出足够的Fm r的估计。
Fm r称为可恢复的最大荧光产量。它的获得是在活化光诱导达到光下最大荧光平稳时，关闭活化光，测量Fo’后，把饱和光的闪光延长到180秒/次。得到一组逐渐增大的最大荧光产量，将该组最大荧光产量放在半对数坐标系中即成直线，该直线在Y轴上的截距即为Fm r。以(Fm-Fm r)/ Fm r可以反映不可逆的非光化学淬灭产率，即发生光抑制的可能程度。
荧光诱导动力学
用于分析叶片从黑暗中转入光下造成的荧光上升动力学。此种方法的优点主要在于他可以使用比较廉价的非调制荧光仪。这种研究方法目前还存在争议，需要更多的理论支持。
叶绿素荧光的研究范围
叶绿素荧光可以给出光系统2的状态信息。它可以说明光系统2使用叶绿素吸收能量的程度和它被过量光线破坏的程度。这看起来好象只对那些对光系统2感兴趣的专家才有意义，其实它对于植物生理学家更有意义。通过光系统2的电子流动在许多条件下很明显是整个光合的速率。它提供我们在其他方法无法实现的情况下，快速估计植物光合能力的潜在能力。光系统2也被认为是光合机构中对光诱导破坏最为脆弱的部分。光系统2的破坏是植物叶片胁迫的最早的表现。当然，荧光技术本身也不是没有局限的，荧光的最强有力的应用不是单独使用这一技术，而是结合其他技术，尤其是气体交换，从而获得植物对环境响应的完整说明。
光系统2产量作为光合测量的指针
实验室条件下电子传递速率可以和CO2的固定显著线性相关，但是在野外条件下，这种情况可能不会出现，这是因为CO2固定的相对速率和竞争过程如光呼吸、N代谢和氧对电子利用等过程的变化所造成的。这种差异本身是非常有意义的。但同时也意味着精确的CO2固定速率无法单独依靠荧光测量来实现。电子传递速率的计算首先假定每个光系统2吸收的光线是恒定的，这显然是不准确的。当然，如果我们可以利用积分球来直接测量吸收的话，其中缺陷是可以部分克服的。但是仍然存在光系统化学计量的差异，因此荧光从来也不能用于比较不同植物或不同叶片之间的测量。由于以上原因，使用红外线气体分析仪进行的气体交换测量仍然是植物生理生态研究的核心。
荧光可以提供具体样品的非破坏性的快速测量方法，例如荧光可以被用于研究两个水稻栽培品种在不同发育阶段全天的电子传递速率。个体叶片需要标记并且接下来的测量要在相同的叶片上进行，以确保测量间的可比性。相同的方法用于火炬松在FACE(开放式CO2倍增Free-Air CO2 Enrichment)条件下测量电子传递速率日变化。这些研究者认为，在夏天，CO2浓度的升高将导致电子传递速率的上升；而在冬天，CO2浓度的升高将导致电子传递速率的下降。CAM植物如凤梨科植物，在太阳黑子期间观察到的光系统2量子产量(ΦPSII)与C3植物种类(雨林内)相比有较大的上升。这反映了相对于C3植物光合成本(包括光呼吸)而言，CAM植物夜里积累有机酸的脱羧作用需要大量能量，这支持了在潜在瞬时强光破坏下的光利用。
另外一个应用方面是荧光可用于检查植物对不同微环境的适应。例如，研究ΦPSII可以对野外条件下不同植物光饱和行为进行快速简单的测量。不允许不同生境条件下绝对光合速率的比较，但对于一些植物来说是有效的，如地衣和苔藓等其结构使得他们难以用通常的气体交换来研究。
在实验室条件下，由于实验人员造成的CO2浓度的波动使得研究光线和光合暗反应之间的深入分
析非常困难。因此，特定的密封性能很好的叶室应该和光纤探针结合来进行测量是必要的(6400-40是唯一一款集成在一起的仪器)。系统应该防止光纤对光的遮挡，最好可以控制CO2气体的浓度(这是6400-40以外其他仪器所无法避免的缺陷)。
电子传递与CO2固定的相关性
尽管荧光发射仅来自于绿色组织中的上面几层，但是气体交换数据则测量整个叶片厚度，同步的测量在研究光能利用效率和CO2固定和光抑制之间的关系时至关重要。相对简单并广泛使用的是研究电子传递速率和CO2固定之间的关系，同步地测量不同光强下在非光呼吸条件(升高CO2或通入1-2%的氧气)下CO2同化和ΦPSII的关系。在CO2同化的量子产量(ΦCO2)和PSII量子产量(ΦPSII)之间的线性图，使得每摩尔CO2固定需要的电子数可以得到测量。假定这种关系是在无光呼吸存在的条件下进行，可以估计光呼吸。例如，这个指针被用于研究光呼吸(在干旱胁迫下光保护维持机制)的意义。
Meyer和Genty采用高分辨率的光系统2量子产量来解释脱落酸处理后叶片胞间CO2浓度(Ci)。干旱期间，Ci的测量传统上采用气体交换的技术可能会由于气孔的不均匀响应而高估，同时因为表皮的蒸腾而低估。叶绿素荧光的使用已经表明干旱胁迫的主要影响是气孔关闭减少了Ci从而限制了羧化。此项技术不需要荧光图象技术，其结合了气体交换和荧光技术。Sanchez等人研究了光系统2量子产量和CO2同化速率和Ci之间的关系。然而这种方法要求胁迫强度不能改变，而且Ci可以通过气体交换精确确定(需要排除那些低气孔导度和表面导度的物种)。
荧光分析也能被应用于理解高低温的影响。例如，CO2同化的量子产量(ΦCO2)和PSII量子产量(ΦPSII)的比较可以用于此方面的研究。处于低温时，玉米增加了电子向电子受体的传递，这可能会产生好氧的物种。在生长季早期完全展开的叶片测量，ΦPSII/ΦCO2比非胁迫的高，表明电子利用的途径不是CO2固定。这种增长伴随着抗氧化系统能力的增长，表明叶片正在遭受氧胁迫。
图2 胞间CO2浓度和光合以及ΦPSII之间的关系
(6400-40荧光叶室测量得到的荧光ACi曲线数据在其面板上可以即时显示，
这是其他荧光仪所无法提供的，因为他们无法真正控制CO2浓度)
实际显示荧光ACi曲线期间荧光的数据变化，从350ppm到0，
然后在回到1000ppm的浓度变化过程。
测量胁迫和胁迫耐受力
尽管荧光测量有时会提供植物光合能力的测量，但是他的真正的长处在于别的测量无法提供的信息。因为荧光可以提供植物耐受环境胁迫的能力和胁迫已经损害光系统的程度的有价值的信息。测量日变化可以产生包括NPQ、量子效率、电子传递速率和对光响应的光抑制的程度对光、温度和其他环境胁迫的响应的信息。早期测量往往采用暗适应后Fv/Fm的减少和Fo的增长来表明由于高温、低温、过高的光强和水分胁迫造成的光抑制破坏的发生。尽管现在的测量技术已得到了很大的改进，这些观
察值仍然被广泛使用。然而近些年荧光技术中调制技术的发展已经可以在光下进行测量，可以测量光化学效率、光合和叶黄素循环。研究表明叶片在高光强下通常有高的NPQ，同样的情况也会出现在低温下。我们可以采用NPQ的变化来很好地表现叶黄素循环。另一个实验表明，在野外测量Fm r，耐阴植物比阳生植物表现了更高的响应光抑制的NPQ。
结论
本综述试图解释叶绿素荧光研究可以应用在那些生理生态研究领域。叶绿素荧光测量很容易，但是同时它也容易产生大量无意义的数据，这取决与您的良好的实验设计以确保数据的意义。
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叶绿素的光敏性质探究（与二氢卟吩e4对比） 研究背景 光敏剂的光漂白（photobleaching）是指在光的照射下，光敏剂所激发出来的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃至消失的现象，这是光动力诊断临床应用中考虑光剂量和检测需用时间的一个重要因素。 长波红光在组织中具有较大的穿透深度，从而能保证足够的治疗深度：大的吸光度能保证充分利用光能量和尽可能减少药物剂量；光敏剂吸光度的大小是决定药物剂量的理论依据。过多的光敏剂分布于癌组织中势必会影响光的穿透深度，然而使用过少的光敏剂又不能产生应有的疗效。因此，光敏剂的使用剂量要依据其吸光度的大小和肿瘤组织的大小来权衡。 对于同一种光敏剂，它的漂白时间将随入射光的光能流率的增大而减小。再次，除了与光敏剂的类型有关外，还与初始浓度和入射光源的波长有关。初始浓度越大，光漂白时间越长。 实验意义：探究不同浓度的叶绿素在不同光源、不同时间的照射下，其吸光度随时间的变化，探测其光漂白特性，为更好地在临床应用上要保持光敏剂的有效杀伤浓度，且控制好光敏剂的激发时间，这样才能保证治疗的效果。 初步设想： 探究叶绿素在不同浓度，不同光源，不同光照时间对光的敏感性：（1）用紫外检测得到叶绿素的紫外可见吸收光谱，与二氢卟吩e4的光谱图比较。（最好能同时测定荧光光谱） （2）在叶绿素的最大吸收波长处检测浓度为0.05 mg/ml ，0.1 mg/ml ，0.2 mg/ml ，0.3 mg/ml， 0.4mg/ml的叶绿素的吸光度，并制作曲线图，验证其是否符合朗伯-比尔定律。 （3）实验设置了不同的六组光源：白光、红外光、黄光、绿光、蓝光、紫外光，分别对0.4mg/ml的叶绿素待测样品进行垂直照射10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min，取照射后的各样品进行紫外-可见吸收光谱的检测，通过光谱的变化，探究光敏剂叶绿素明显的光漂白特性。
《高级植物（生理）生态学》课程考试试题 生命科学学院周晓丽学号：G2004477 一、名词解释（30分） 1.光补偿点和光饱和点 光补偿点：光合作用吸收的二氧化碳与呼吸作用放出的二氧化碳数量相等时的光强。阴生植物的光补偿点低于阳生植物，C3植物低于C4植物。 光饱和点：在一定的光强范围内，植物的光合强度随光照度的上升而增加，当光照度上升到某一数值之后，光合强度不再继续提高时的光照度值。 2.CO2饱和点和CO2补偿点 CO2饱和点：CO2浓度增加到一定程度时光合速率不再增加,此时环境中CO2的浓度称二氧化碳饱和点。 CO2补偿点：光合作用释放的氧气与呼吸作用消耗的氧气相等时外界环境中的CO2浓度，就是光合作用的CO2补偿点。 3.量子产率与羧化效率 量子产率：体系吸收每一个光子所引发的某种事件的数目。符号为ψ，Y。积分量子产率为Ф=事件数/吸收光子数。对于光化学反应，ψ=反应物消耗(或产物产生)的数量/吸收光子数量。微分量子产率为φ=(d[x]/dt)/n。式中d[x]/dt为某可测量量的变率，n为单位时间内所吸收的光子数(摩尔或爱因斯坦)。ψ可用于光物理过程或光化学反应。 羧化效率：在低CO2浓度条件下，CO2浓度是光合作用的限制因子，直线的斜率(CE)受羧化酶活性和量的限制。因而，CE被称为羧化效率。CE值大，则表示Rubisco的羧化效率较高。 4.叶面积指数：单位土地面积上植物植株绿叶面积与土地面积的比值。是反映作物群体大小的较好的动态指标。 5.植物的碳同位素区异：主要指C3、C4在植物体内的不同含量。
二、简答题（40分） 1、画图示意光合速率的光响应曲线，并标示出暗呼吸、光补偿点和光饱和 点。 光和响应曲线 2、如何理解叶绿素荧光动力学中的F V/F m和NPQ，它们在分析植物光合生 理分析有何意义？ 调制叶绿素荧光全称脉冲-振幅-调制（Pulse-Amplitude-Modulation,PAM）叶绿素荧光，我们国内一般简称调制叶绿素荧光，测量调制叶绿素荧光的仪器叫调制荧光仪，或叫PAM。 调制叶绿素荧光（PAM）是研究光合作用的强大工具，与光合放氧、气体交换并称为光合作用测量的三大技术。由于其测量快速、简单、可靠、且测量过程对样品生长基本无影响，目前已成为光合作用领域发表文献最多的技术。 调制叶绿素荧光仪的工作原理 1983年，WALZ公司首席科学家，德国乌兹堡大学教授Ulrich Schreiber 博士利用调制技术和饱和脉冲技术，设计制造了全世界第一台脉冲振幅调制（Pulse-Amplitude-Modulation，PAM）荧光仪——PAM-101/102/103。 所谓调制技术，就是说用于激发荧光的测量光具有一定的调制（开/关）频
第一节 叶绿素荧光参数及其意义 韩志国，吕中贤（泽泉开放实验室，上海泽泉科技有限公司，上海，200333） 叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法，已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最 广泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统II 的叶绿素a ，而光系统II 处于整个光合 作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统II ，进而引起 叶绿素a 荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量 方法相比，叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的 应用。 1 叶绿素荧光的来源 藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能，也可以间接获取其它捕光色素（如类胡萝卜素）传递来 的能量。叶绿素分子得到能量后，会从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。根据吸收的能量多少， 叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光，则跃迁到较高激发态；若叶绿素分析 吸收红光，则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，会在几百飞秒（fs ，1 fs=10－15 s ）内通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图1）。而最低激发态的叶绿素分子可以稳定 存在几纳秒（ns ，1 ns=10－9 s ）。 波长吸收荧光红 B 蓝 荧光 热耗散 最低激发态较高激发态基态吸收蓝光吸收红光能量A 图1 叶绿素吸收光能后能级变化（A ）和对应的吸收光谱（B ）（引自韩博平 et al., 2003） 处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径（图2）释放能量回到基态(韩博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）将能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后传递给反应中心叶绿素a ，用于进行光化 学反应；2）以热的形式将能量耗散掉，即非辐射能量耗散（热耗散）；3）放出荧光。这三个途径相互竞 争、此消彼长，往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言，叶绿素荧光发生在纳秒级，而光化 学反应发射在皮秒级（ps ，1 ps=10－12 s ），因此在正常生理状态下（室温下），捕光色素吸收的能量主要用 于进行光化学反应，荧光只占约3%～5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。 在活体细胞内，由于激发能从叶绿素b 到叶绿素a 的传递几乎达到100％的效率，因此基本检测不到 叶绿素b 荧光。在常温常压下，光系统I 的叶绿素a 发出的荧光很弱，基本可以忽略不计，对光系统I 叶 绿素a 荧光的研究要在77 K 的低温下进行。因此，当我们谈到活体叶绿素荧光时，其实指的是来自光系 统II 的叶绿素a 发出的荧光。
部分叶绿素荧光动力学参数的定义： F0：固定荧光，初始荧光(minimalfluorescence)。也称基础荧光，0水平荧光，是光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心处于完全开放时的荧光产量，它与叶片叶绿素浓度有关。 Fm：最大荧光产量(maximalfluorescence)，是PSⅡ反应中心处于完全关闭时的荧光产量。可反映经过PSⅡ的电子传递情况。通常叶片经暗适应20 min后测得。 F：任意时间实际荧光产量(actualfluorescence intensity at any time)。 Fa：稳态荧光产量(fluorescence instable state)。 Fm/F0：反映经过PSⅡ的电子传递情况。 Fv=Fm-F0：为可变荧光(variablefluorescence)，反映了QA的还原情况。 Fv/Fm：是PSⅡ最大光化学量子产量(optimal/maximal photochemical efficiency of PSⅡin the dark)或(optimal/maximalquantum yield of PSⅡ)，反映PSⅡ反应中心内禀光能转换效率(intrinsic PSⅡefficiency)或称最大PSⅡ的光能转换效率(optimal/maximalPSⅡefficiency)，叶暗适应20 min后测得。非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生长条件的影响，胁迫条件下该参数明显下降。 Fv’/Fm’：PSⅡ有效光化学量子产量(photochemicalefficiency of PSⅡin the light)，反映开放的PSⅡ反应中心原初光能捕获效率，叶片不经过暗适应在光下直接测得。 (Fm’-F)/Fm’或△F/Fm’：PSⅡ实际光化学量子产量(actual photochemical efficiency of PSⅡin the light)(Bilger和Bjrkman,1990),它反映PSⅡ反应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率,叶片不经过暗适应在光下直接测得。 荧光淬灭分两种:光化学淬灭和非光化学淬灭。光化学淬灭：以光化学淬灭系数代表：qP=(Fm’-F)/(Fm’-F0’)；非光化学淬灭，有两种表示方法，NPQ=Fm/Fm’-1或qN=1-(Fm’-F0’)/(Fm-F0)=1-Fv’/Fv。 表观光合电子传递速率以[(Fm’-F)Fm’]×PFD表示，也可写成：△F/Fm’×PFD×0.5×0.84，其中系数0.5是因为一个电子传递需要吸收2个量子，而且光合作用包括两个光系统，系数0.84表示在入射的光量子中被吸收的占84%，PFD是光子通量密度；表观热耗散速率以(1-Fv’/Fm’)×PFD表示。 Fmr：可恢复的最大荧光产量，它的获得是在荧光P峰和M峰后，当开放的PSⅡ最大荧光产量平稳时，关闭作用光得到F0’后，把饱和光的闪光间隔期延长到180s/次，得到一组逐渐增大(对数增长)的最大荧光产量，将该组最大荧光产量放在半对数坐标系中即成直线，该直线在Y轴的截距即为Fmr。以(Fm-Fmr)/Fmr可以反映不可逆的非光化学淬灭产率，即发生光抑制的可能程度。 FO(初始荧光),Fm(最大荧光),Fv= Fm-FO(可变荧光),Fv /Fm(PSII最大光化学效率或原初光能转换效率),Fv /FO(PSII的潜在活性),Yield(PSII总的光化学量子产额),ETR(表观电子传递速率),PAR(光合有效辐射),LT(叶面温度)。其中FO、Fm、Fv /FO测定前将叶片暗适应20 min。各参数日变化从6: 00～18: 00,每2h测定一次。 （Fv /Fm）和（Fv /FO）分别用于度量植物叶片PSII原初光能转换效率和PSII潜在活性,-（Yield）是PSII的实际光化学效率,反映叶片用于光合电子传递的能量占所吸收光能的比例,是PSII反应中心部分关闭时的光化学效率,其值大小可以反映PSII反应中心的开放程度。常用来表示植物光合作用电子传递的量子产额,可作为植物叶片光合电子传递速率快慢的相对指标。即在光合作用进程中,PSII每获得一个光量子所能引起的总的光化学反应。因此,较高的Yield值,有利于提高光能转化效率,为暗反应的光合碳同化积累更多所需的能量,以促进碳同化的高效运转和有机物的积累。同样毛蕊红山茶和长毛红山茶的Yield值也较高。
叶绿素荧光研究背景知识介绍 前言 近些年来，叶绿素荧光技术已经逐渐成为植物生理生态研究的热门方向。荧光数据是植物光合性能方面的必要研究内容。目前这种趋势由于叶绿素荧光检测仪的改进而得到发展。然而荧光理论和数据解释仍然比较复杂。就我们所了解的情况来看，目前许多研究者对荧光理论不是很清楚，仪器应用仅仅限于简单的数据说明的基础上，本文在此基础上，目的在于简单明晰地介绍相关理论和研究要点，以求简单明确地使用叶绿素荧光检测设备，充分分析实验数据，重点在于植物生理生态学技术的应用和限制。 荧光测量基础 植物叶片所吸收的光的能量有三个走向：光合驱动、热能、叶绿素荧光。三个过程之间存在竞争，其中任何一个效率的增加都将造成另外两个产量的下降。因此，测量叶绿素荧光产量，我们可以获得光化学过程与热耗散的效率的变化信息。尽管叶绿素荧光的总量很小(一般仅占叶片吸收光能总量的1-2%)，测量却非常简单。荧光光谱不同于吸收光谱，其波长更长，因此荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射，同时测量发射光中波长较长的部分光线的量来实现。有一点需要注意的是，这种测量永远是相对的，因为光线不可避免会有损失。因此，所有分析必须把数据进行标准化处理，包括其进一步计算的许多参数也是如此。 调制荧光仪的出现是荧光研究技术的革命性的创新。在这类仪器中，测量光源是调制(高频率开关)的，其检测器也被调谐来仅仅检测被测量光激发的荧光。因此，相对的荧光产量可以在背景光线(主要是指野外全光照的条件下)存在的条件下进行测量。目前绝大多数的荧光仪采用了调制系统，同时也强烈建议选择调制荧光仪(Kate Maxwell,2000)。 为什么荧光产量会发生改变？Kautsky效应和Beyond 叶绿素荧光产量的变化最早在1960年被Kautsky和其合作者发现。他们发现，当把植物叶片从黑暗中转入光下，荧光产量瞬间上升(大约在1秒左右)这种上升可以解释为光合途径中电子受体的还原(可接受电子的受体的减少)。一旦PSII吸收光能，初级电子受体Q A(质体醌)接受了电子，它将不能再接受电子，直到它把电子传递给下一级电子载体Q B。此期间，反应中心是关闭的，反应中心关闭的比
实验报告 课程名称： 植物生理学（乙）指导老师： 廖敏 成绩： 实验名称： 叶绿素理化性质和含量 实验类型： 定量探究型 同组学生姓名： 方昊 一、实验目的和要求（必填） 三、主要仪器设备（必填） 五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得 二、实验内容和原理（必填） 四、操作方法和实验步骤 六、实验结果与分析（必填） 一、实验目的和要求 掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法； 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量 分析。原理如下： 1. 叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取； 2. 叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素 分开； 3. 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素； 4. 叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光； 5. 叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a 、b 及总量，而652可直接用于总量分析。 专业：农业资源与环境 姓名： 吴主光 学号： 3110100403 日期： 2013.10.17 地点： 生物实验中心 装 订 线
三、主要仪器设备 1. 天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等 四、操作方法、实验步骤以及实验现象 定性分析： 鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆 过滤入三角瓶中，观察荧光现象：透射光绿色，反射光红色。 皂化反应（3ml）：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O1ml分层后观察：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光；下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。 取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素）；取1/2加醋酸铜粉加热，变鲜绿色，为铜代叶绿素。 取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml加热，观察： 3 min变为褐绿色的去镁叶绿素， 5 min后，变为深绿色的铜代叶绿素。 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1） 反复用石油醚粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素(盐)（稀释663nm OD 0.5-1) 在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。 五、实验数据记录和处理
对于叶绿素荧光全方面的研究 叶绿素荧光现象的发现 将暗适应的绿色植物突然暴露在可见光下后，植物绿色组织发出一种暗红色，强度不断变化的荧光。荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。最直观的表现是，叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。其本质是，叶绿素吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体，LHC将其能量传递到光系统2或光系统1，期间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重新发射出来，其波长较长，即叶绿素荧光。 叶绿素荧光动力学研究的特点 1、叶绿素荧光动力学特性包含着光合作用过程的丰富信息 光能的吸收和转换 能量的传递与分配 反应中心的状态 过剩光能及其耗散 光合作用光抑制与光破坏 2、可以对光合器官进行“无损伤探查” 3、操作步骤简单快捷 光合作用的光抑制 光抑制是过剩光能造成光合功能下降的过程。过剩光能指植物所吸收的光能超出光化学反应所能利用的部分。过去人们把光抑制与光破坏等同起来，认为发生了光抑制就意味着光和机构遭到破坏。甚至把光抑制、光破坏、光氧化等，沦为一体。 光抑制的基本特征表现为： 光合效率下降说明叶片吸收的光能不能有效地转化为化学能。光破坏：PSII 是光破坏的主要场所，破坏也可能发生在反应中心也可能发生在与次级电子受体结合的蛋白上。发生光破坏后的结果：电子传递受阻、光合效率下降。当过剩的光能，不能及时有效地排散时，会对光合机构造成不可逆的伤害，如光氧化、光漂白等等。一切影响二氧化碳同化的外界因素，如低温、高温、水分亏缺、矿质元素亏缺等都会减少对光能的利用，导致过剩光能增加，进而加重光破坏。 植物防御破坏的措施 1、减少对光能的吸收 增加叶片的绒毛、蜡质 减少叶片与主茎夹角 2、增强代谢能力 碳同化 光呼吸 氮代谢 3、增加热耗散 依赖叶黄素循环的热耗散 状态转换 作用中心可逆失活 光合作用
植物表型组学研究技术（一） ——FluorCam叶绿素荧光成像技术
FluorCam叶绿素荧光成像技术 Rousseau等（High throughput quantitative phenotyping of plant resistance using chlorophyll fluorescence image analysis.Plant Methods, 2013, 9:17），利用FluorCam开放式叶绿素荧光成像系统作为高通量表型分析平台，采用图像阈值分割等分析方法，对植物病原体感染进行了定量分析检测，根据Fv/Fm将感染分为不同阶段／等级，特别是可以将用其它方法难以分辨出来的感染前期加以分辨，并对5个品种的菜豆对普通细菌性疫病的抗性进行了定量分析评价。 PSI公司首席科学家Nedbal教授与公司总裁Trtilek博士等首次将PAM叶绿素荧光技术（Pulse Amplitude Modulated technique—— 脉冲调制技术）与CCD技术结合在一起，于1996 年在世界上成功研制生产出FluorCam叶绿素荧 光成像系统（Heck等，1999；Nedbal等，2000； Govindjee and Nedbal, 2000）。FluorCam叶 绿素荧光成像技术成为上世纪90年代叶绿素荧 光技术的重要突破，使科学家对光合作用与叶 绿素荧光的研究一下子进入二维世界和显微世 界，广泛应用于植物生理生态、植物胁迫与抗 性监测、作物育种、植物表型分析等。不同于 其它成像分析技术，FluorCam叶绿素荧光成像 只对叶绿素荧光波段敏感，可以有效避免环境 光的干扰，特异性、高灵敏度反映植物生理生 态状况。 主要功能特点如下： 1)高灵敏度CCD，时间分辨率可达50帧／秒，有效抓取叶绿素荧光瞬变；可选配高分 辨率CCD，分辨率1392x1040像素，用于气孔功能成像分析、稳态荧光如GFP荧光测量等
植物体叶绿素荧光测定仪的原理与使用方法 【实验目的】 ?了解目前在光合作用研究中先进的叶绿素荧光技术，了解便携式叶绿素荧光仪测定 植物光合作用叶绿素荧光参数的基本原理和仪器的使用方法。 ?老师演示和学生分组利用便携式叶绿素荧光仪(PAM2100)测定实验植物的叶绿素荧 光基本参数(Fo, Fm, Fv/Fm, Fm’, Fo’, Yield, ETR, PAR, qP, qN等)。 ?了解荧光仪的广泛应用 【实验原理】 仪器介绍和工作原理 叶绿素荧光（Chlorophyll Fluorescence）的产生 ?传统的光合作用测定是通过测量植物光合作用时CO2的消耗或干物质积累计算出 来。叶绿素荧光分析技术通过测量叶绿素荧光量准确获得光合作用量及相关的植物生长潜能数据。 ?叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗 散、分配等方面具有独特的作用，与“表观性”的气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点。 ?本实验以调制式叶绿素荧光仪PAM-2100（W ALZ）为例，测定植物叶绿素荧光主 要参数。植物叶片的生长状况不同，所处位置的不同，光照不同，叶绿素荧光参数数值也会有所不同，所以不同叶片之间叶绿素荧光产量存在着一定的差异。 【实验内容与步骤】 一、仪器使用步骤讲解 1. 仪器安装连接 将光纤和主控单元和叶夹2030-8相连接。光纤的一端必须通过位于前面板的三孔光纤连接器连接到主控单元，光纤的另一端固定到叶夹2030-B上。同时，叶夹2030-B还应通过LEAF CLIP插孔连接到主控单元。 2. 开机 按“POWER ON”键打开内置电脑后，绿色指示灯开始闪烁，说明仪器工作正常。随后在主控单元的显示器中会出现PAM-2100的表示。从仪器启动到进入主控单元界面大概要40秒。 3. PAM-2100的键盘 PAM-2100主控单元上有20个按键，现分别简要介绍主要按键的功能。
一、原理 叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 皂化反应式如下： 二、仪器与用具 20ml刻度试管；10ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯（100ml）；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支；火柴。 三、试剂 1. 95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸； 2. 醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成； 3. KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。 四、方法 用叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。 1.光对叶绿素的破坏作用 （1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。 （2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。 2.荧光现象的观察 取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。 3.皂化作用（绿色素与黄色素的分离） （1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。
第四章 叶绿素荧光技术应用 第一节 叶绿素荧光参数及其意义 韩志国，吕中贤（泽泉开放实验室，上海泽泉科技有限公司，上海，200333） 叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法，已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最广泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统 II 的叶绿素 a ，而光系统 II 处于整个光合作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统 II ，进而引起叶绿素 a 荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量方法相比，叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的应用。 1 叶绿素荧光的来源 藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能，也可以间接获取其它捕光色素（如类胡萝卜素）传递来的能量。叶绿素分子得到能量后，会从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。根据吸收的能量多少，叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光，则跃迁到较高激发态；若叶绿素分析吸收红光，则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，会在几百飞秒（fs ，1 fs=10－15 s ）内通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图 1）。而最低激发态的叶绿素分 子可以稳定存在几纳秒（ns ，1 ns=10－9 s ）。 A 较高激发态 B 热耗散 吸收蓝 光 吸收红光 最低激发态 能量 荧光 基态 蓝 波长 红 荧光 图 1 叶绿素吸收光能后能级变化（A ）和对应的吸收光谱（B ）（引自韩博平 et al., 2003） 处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径（图 2）释放能量回到基态(韩博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）将能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后传递给反应中心叶绿素 a ，用于进行光化学反应；2）以热的形式将能量耗散掉，即非辐射能量耗散（热耗散）；3）放出荧光。这三个途径相互竞争、此消彼长，往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言，叶绿素荧光发生在纳秒级，而光化学反应发射在皮秒级（ps ，1 ps=10－12 s ），因此在正常生理状态下（室温下），捕光色素吸收的能量主要用于进行光化学反应，荧光只占约 3%～5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。 在活体细胞内，由于激发能从叶绿素 b 到叶绿素 a 的传递几乎达到 100％的效率，因此基本检测不到叶绿素 b 荧光。在常温常压下，光系统 I 的叶绿素 a 发出的荧光很弱，基本可以忽略不计，对光系统 I 叶绿素 a 荧光的研究要在 77 K 的低温下进行。因此，当我们谈到活体叶绿素荧光时，其实指的是来自光系统 II 的叶绿素 a 发出的荧光。
收稿日期:2005 01 02 作者简介:李志博(1978 ),男,助理研究员,L zb_o ea@https://www.doczj.com/doc/1d445601.html, 基金项目:石河子大学创新基金(200294);石河子大学高层次人才引进资金专项(R CZX 2004 YS02) 棉花不同叶位叶绿素荧光特性初探 Primary Studies on Chlorophyll Fluorescence Characteristics of Cotton Leaves at Different Leaf Position 李志博,魏亦农,张荣华,张小均 (新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子832003) 植物叶绿素荧光分析技术是近年来发展起来的用于光合作用机理研究和光合生理状况检测的一种新技术。与一些 表观性 的气体交换指标相比,叶绿素荧光参数更具有反映 内在性 的特点,因而被视为研究植物光合作用与环境关系的内在探针。尽管该技术已在植物的抗逆生理、作物育种栽培、植物生态等方面得到了较为广泛的应用,但迄今用于棉花的研究报道还不多见。本文以美国OS5 FL 型饱和脉冲式叶绿素荧光分析仪对棉花不同叶位叶绿素荧光特性进行了初步研究,以期为叶绿素荧光分析技术在棉花上应用提供参考。 1 材料和方法 试验于2004年在新疆兵团农八师新湖农场实验站进行,供试品种为3个棉花高代品系22 2、22 7及22 16,4月24日播种。每个材料为一个处理,重复3次,随机区组设计。小区面积7.0m 2 ,宽窄行种植(30+60+30)cm ,田间管理同常规大田。 每个材料在花蕾期分别选取6个有代表性的 棉株进行标记,采用美国OS5 FL 型饱和脉冲式叶绿素荧光分析仪(kinetic 模式)测定标记棉株的倒1叶,倒3叶及倒5叶的叶绿素荧光参数,包括初始荧光(Fo)、最大荧光(Fm )、最大量子产额(yeild)光化学猝灭系数(qP)及非光化学猝灭系数(qN)等。计算可变荧光Fv(Fv =Fm Fo),Fv/Fm,Fv /Fo 。测定前各个叶片暗适应30min,各个参数取6次平均值。 2 结果与分析 2.1 棉花不同叶位Fv 的变化 Fv 值与植物叶片PS !氧化的水裂解释放O 2的过程有关,可作为PS !反应中心活性大小的相对指标。分析结果(表1)表明,同一棉花品系的不同叶位存在差异,22 7的倒3叶和倒5叶达到了0.05水平上的差异,但二者均与倒1叶无显著差异。22 16的倒1叶不但与倒3叶和倒5叶差异显著,而且与倒5叶的差异达到了极显著水平(r =0.01)。总体看来,各个品系的倒5叶Fv 值均比倒1叶和倒3叶的高,说明棉花倒5叶 表1不同品系的叶绿素荧光变化 Table 1C hang es of chlorophyll fluorescence characteristics in different cotton lines 品种叶位F v Fv/Fm Fv/Fo y ield qP qN 22 2 倒1叶437.000.715 2.510.6543 1.47270.5227倒3叶374.670.797 3.930.66450.93650.2975倒5叶504.500.763 3.220.6773 1.02120.3820平均 438.560.758 3.220.6654 1.14350.400722 7 倒1叶496.67ab 0.709b 2.43b 0.6571 1.03720.2605倒3叶404.67b 0.767ab 3.30b 0.66940.93610.2200倒5叶644.67a 0.870a 6.67a 0.67430.85230.3301平均 514.890.7811 4.130.66690.94190.270222 16 倒1叶424.00b(B)0.677B 2.09B 0.6045b 1.1272a 0.4433倒3叶521.67a 0.747A 2.95A 0.6670a 1.0181b 0.3422倒5叶545.00a(A )0.734A 2.75A 0.6693a 1.0715ab 0.3899平均 496.89 0.7190 2.60 0.6469 1.0723 0.3918 注:表中数值为参数的平均值,采用SSR 法方差检验;a,b 为0.05的差异水平;A ,B 为0.01的差异水平,下同。 棉花学报 Co tton Science 2005,17(3):189~190
Fluorcam荧光成像技术及其在光合作用研究 中的应用 Eco‐lab生态实验室 北京易科泰生态技术有限公司 info@eco‐https://www.doczj.com/doc/1d445601.html,
目录 1、叶绿素荧光成像技术发展过程 2、荧光参数及其生理意义 3、PSI介绍（荧光成像的发明者） 4、PSI产品介绍 5、应用案例
叶绿素荧光技术发展历程 ?Kautsky effect: Kautsky and Hirsch(1931)首次用肉眼发现叶绿素荧光现象并发表论文“CO2同化新实验”，后被称作“Kautsky effect” ?PAM(Pulse Amplitude Modulated Fluorometer): Schreiber（1986）等发明了PAM脉冲调制技术测量叶绿素荧光。?FluorCam：KineKc imaging of chlorophyll fluorescence: Ladislav Nedbal（2000）等于上世纪90年代末期发明了与 PAM技术相结合的叶绿素荧光成像技术
成像测量局部放大
荧光参数及其意义 ?Fo、Fm与QY，此外还有PAR_Abs及ETR ?Kautsky诱导效应：Fo，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd ?荧光淬灭分析：Fo，Fm，Fp，Fs，Fv，QY，NPQ，Qp，Rfd 等50多个参数 ?OJIP曲线：快速荧光诱导曲线。Fo，Fj，Fi，P或Fm，Mo（OJIP曲线初始斜率）、FixArea固定面积、Sm（对关闭所有光反应中心所需能量的量度）、QY、PI等 ?LC光响应曲线：Fo，Fm，QY，QY_Ln
叶绿素荧光仪著名厂商 ?PSI：捷克布尔诺Brno（孟德尔在此发现著名的孟德尔遗传定律），Ladislav Nedbal为首席科学家和主要股东（另一股东为David Kramer，美国密执根州立大学教授），1997年为美国华盛顿大学H.Pakrasi教授研制成了第一台FluorCam荧光成像系统。主要产品有： –FluorCam叶绿素荧光成像系列产品 –FL3500/FL5000双调制荧光仪系列产品 –FluorPen及AquaPen等手持式荧光仪产品 –光养生物反应器等藻类培养与在线监测产品 –光源与植物培养室 ?Optics：美国，主要产品为OS5p‐PAM叶绿素荧光仪等?Walz：德国，主要产品为PAM2500叶绿素荧光仪等
叶绿素的提取及理化性 质的鉴定 文件编码（008-TTIG-UTITD-GKBTT-PUUTI-WYTUI-8256）
植物生理学实验 叶绿体色素的提取分离及其理化性质 姓名 学号 系别 班级 实验日期 同组姓名 摘要：为探究植物叶绿素理化性质，根据不同的叶绿体色素分子结构不同，在有机溶剂中的溶解性和吸附剂上的吸附性差异，本实验在提取菠菜叶片叶绿体色素（叶绿素和类胡萝卜素）后，利用纸层析法将不同的色素分离的方法，对植物叶绿素的理化性质进行观察与检验。 一、实验原理及实验目的 实验原理： 1、提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 2、分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。
3、理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。 分子吸收光能后，从基态转变到激发态。叶绿素分子有两种单线激发态，对应两个主要的光吸收区。 分子在激发态停留的时间不超过数纳秒（10-9秒） 由激发态回到基态的过程称为衰变（Decay)。 叶绿素a：C 55H 72 O 5 N 4 Mg，MW= 叶绿素b：C 55H 70 O 6 N 4 Mg，MW= 胡萝卜素：C 40H 56 ， MW= 叶黄素：C 40H 56 O 2 ， MW= 实验目的： 以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化性质. 二、实验材料和方法 1、实验材料：菠菜 2、实验用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光 镜、量筒、烧杯、试管等
叶片荧光测量实验报告 1.实验目的 2.实验方法 利用PAM100,荧光成像系统测量叶绿素荧光 3.实验原理及一些参数的意义 荧光的变化反映光合与热耗散的变化。 光化学淬灭（Photochemical Quenching）:由于光合作用引起的荧光下降，反映了光合活性的高低。 qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’) （基于“沼泽模型”） qL=(Fm’-F)/(Fm’-Fo’)·Fo’/F=qP·Fo’/F （基于“湖泊模型”） 非光化学淬灭（Non-Photochemical Quenching）:由于热耗散引起的荧光下降。 qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo) NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1 ，不需测定Fo’，适合野外调查qN或NPQ反映了植物耗散过剩光能转化为热的能力，反映了植物的光保护能力。 Fv/Fm =(Fm-Fo)/Fm : PS II的最大量子效率，反映植物潜在最大光合能力，高等植物一般在0.8－0.84之间，当植物受到胁迫（Stress）时，Fv/Fm显著下降。 ΦPS II = Yield = (Fm’-Fs)/Fm’ = ΔF/Fm’= qP·Fv’/Fm’: 任一光照状态下PS II的实际量子产量（实际光合能力、实际光合效率）
不需暗适应，不需测定Fo’，适合野外调查。 Y(NPQ)=1-Y(II)-1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1))：调节性能量耗散，PS II 处调节性能量耗散的量子产量。若Y(NPQ)较高，一方面表明植物接受的光强过剩，另一方面则说明植物仍可以通过调节（如将过剩光能耗散为热）来保护自身。Y（NPQ）是光保护的重要指标。 Y(NO)=1/(NPQ+1+qL(Fm/Fo-1))：非调节性能量耗散 PS II处非调节性能量耗散的量子产量。若Y(NO)较高，则表明光化学能量转换和保护性的调节机制（如热耗散）不足以将植物吸收的光能完全消耗掉。也就是说，入射光强超过了植物能接受的程度。这时，植物可能已经受到损伤，或者（尽管还未受到损伤）继续照光的话植物将要受到损伤。Y（NO）是光损伤的重要指标。 P：光合速率，即相对电子传递速率rETR Pm: 最大光合速率，即最大相对电子传递速率rETRmax α：初始斜率，反映了光能的利用效率 β：光抑制参数 Ik=Pm/α：半饱和光强，反映了样品对强光的耐受能力。
植物叶绿素荧光成像技术在国内的应用（第四期） 植物叶绿素荧光成像技术作为最早实用化的叶绿素荧光成像技术，是目前世界上最权威、使用范围最广、种类最全面、发表论文最多的叶绿素荧光成像技术。涵盖了从叶绿体、单个细胞、微藻到叶片、果实、花朵，乃至整株植物和植物灌层，几乎可以测量所有的植物样品，甚至包括含有叶绿素的微生物和动物。 叶绿素荧光成像技术最早在21世纪初引进到国内，但一直到2010年后国内的科学家才在国际交流中逐渐发现这项技术的巨大价值，在短短数年中也利用这一技术发表了几十篇高水平SCI 文献。本期主要介绍目前叶绿素荧光成像技术在国内的应用情况。 一、 植物光合生理研究 叶绿素荧光可以直接反应植物光系统的生理状况，因此从叶绿素荧光技术发明之初，就被用于各种植物光合生理研究。 山东农科院使用FluorCam 叶绿素荧光成像技术研究了小麦旗叶与外露花梗光合能力的差异[1]。研究中发现在小麦生长前中期，旗叶与外露花梗的最大光化学效率Fv/Fm 和量子产额ΦPSII 基本相同。但在生长后期，旗叶的光合能力显著下降，而花梗光合能力的下降幅度要小于旗叶（图1）。这证明了在生长后期的灌浆期，花梗对维持籽粒的生长更为重要。 之后，他们又研究了小麦叶片和颖片季节衰老过程中以及颖果发育过程中光合特性的变化[2；3，图2]。 图2. 不同生长期小麦叶片和颖片的最大光化学效率Fv/Fm （A ）、量子产额ΦPSII （B ）和非光化学淬灭NPQ （C ）的变 化 图1. 不同生长阶段的旗叶（A ，C ）和外露花梗（B ，D ）的Fv/Fm （A ，B ）和ΦPSII （C ，D ）典型叶绿素荧光成像图
叶绿素荧光技术及其在藻类研究中的应用 自从上世纪六十年代Carl Lorenzen（1966）首次将海水泵入安装在考察船上的叶绿素荧光仪进行藻类研究以来，叶绿素荧光技术很快成为海洋湖泊藻类研究的重要技术手段。特别是上世纪九十年代以来，Kolber等（1993,1998）、Trtilek等（1997）、Nedbal等（1999）、Dijkman等（1999）、Koblizek等（1999）等科学家采用P&P技术“pump-and-probe”、双调制技术（Dual-modulation）FRR技术（fast repetition rate）对海洋湖泊藻类进行了大量研究，奠定了叶绿素荧光技术在藻类研究监测中的重要地位。下面就一系列国际先进的用于藻类研究监测的叶绿素荧光仪器技术做一简单介绍。 栅藻（Scenedesmus）FKM叶绿素荧光成像及不同栅藻的叶绿素荧光动态曲线 1. FL3500叶绿素荧光仪 1995年Trtilek等研制生产了世界上首款FL100双调制叶绿素荧光仪（Trtilek等，1997；Koblizek等，1997；Nedbal等，1999），时间分辨率可达1μs。FL3500历经FL200等几次升级换代，是世界上时间分辨率最高、功能最为强大、配置灵活多样的叶绿素荧光技术仪器，由控制单元（主机）和功能多样化的测量单元组成，其主要功能特点为： 1)通用455nm和625nm蓝光和橙红光双色光源，满足所有藻类叶绿素荧光激发测量； 2)双色调制测量光、双色调制光化学光和双色持续光化学光； 3)除通用蓝光和橙红光双激发光测量单元外，还可选配其它波长的测量单元，组成2 个以上多激发光叶绿素荧光系统； 4)既可进行PAM（脉冲调制）测量，还可进行STF单周转光闪、TTF双周转光闪、MTF 多周转光闪及FRR程序测量，测量程序（protocols）包括单光闪荧光诱导、 OJIP-test、QA－再氧化动力学、放氧复合体S状态转换等； 5)可选配时间分辨率为4μs的标配测量单元或时间分辨率达1μs的快速测量单元， 还可选配水下原位叶绿素荧光测量单元及叶夹式测量单元，从而组成功能强大多 样化的叶绿素荧光测量系统，既可测量水体微藻叶绿素荧光，还可原位测量水下