遗传学实验报告
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
一、实验目的：
1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能
2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理
1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）
十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；
生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；
种子多，每株可产生数千粒种子；
形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；
遗传转化简单，转化效率高；
基因组小，只有5对染色体，125MB；
在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体
突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理
T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定
图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计
三、实验材料
1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；
2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；
3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
四、实验步骤
1、植物DNA提取方法（CTAB法）
1)水浴加热CTAB提取液至65℃；
2)取叶片100mg, 液氮研磨成粉末；
3)加入600μl CTAB提取液并混匀；
4)65 ℃水浴45min（至少30min）；
5)12,000rpm 离心10min；
6)将上清转移到新离心管，加入等体积氯仿/异戊醇, 混匀；
7)12,000rpm离心5-10min, 将上清液转移到新管中；
8)向上清中加入1/10体积3M NaAc,再加入预冷的等体积异丙醇或2V无水乙醇, 混匀冰上
放置10min；
9)12,000rpm 离心10min，弃上清，加入500μl 70％乙醇洗涤2min；
10)12,000rpm 离心5min，弃上清，吸干残留并干燥；
11)加20-50 μl TE缓冲液溶解DNA。
2、PCR反应
1)引物设计
LP: 5’-TCA TCC ACC ATG GAA GAA AAG
RP: 5’-TTG GAT ACG ATG CGA GTA AAC
BP: 5’- TTG TTC ACG TAG TGG GCC ATC G
LP+RP:1107bp
BP+RP: 560-860bp
2）PCR 反应体系
H2O: 12.4 μl
10×Buffer: 2 μl
dNTP: 0.5 μl
MgCl2: 2 μl
LP/BP: 0.5 μl
R P: 0.5 μl
Taq: 0.1 μl
DNA: 2 μl
Total: 20 μl
3)PCR温度设定
94℃5min
33 cycle
?变性：94℃30s
?退火：53℃30s
?延伸：72℃1min30s
72℃7min
3、琼脂糖凝胶电泳分析
1)500-1000bp：1.2%，Agarose 0.5×TBE；
2)化胶时应注意不能沸出，冷却至约60℃制胶，凝胶充分冷却凝固后点样进行电泳；
3)PCR产物加3-4 μl 6×loading buffer；
4)120V稳压电泳；
5)EB染色10min，紫外观察。
五、结果分析
图 3 PCR产物电泳条带图
在图3，第7泳道为DL 2000 DNA marker，第5泳道是BP-RP引物体系，第六泳道是LP-RP 引物体系。BP-RP体系的PCR产物产生一条略大于750bp的DNA条带，而LP-RP引物体系中没有在大致900bp的位置产生条带。由此，可以断定此样品为纯和突变体。
六、思考与讨论
1、加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。本次试验中，离心管出现了冰霜，可能对最后的结果有影响。
2、DNA有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。
3、加液氮碾磨时，注意不要将叶片挤到离心管的底部，那样会导致碾磨不充分。遇到这种情况，建议重做。
4、PCR中所需的各种试剂都应避免污染，而且尽量减少冻融的次数。
HY5‐215 The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and?hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995. In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processing In hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an a HY5‐215的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点PsiI，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。 Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0 (https://www.doczj.com/doc/cc1537292.html,/dcaps/dcaps.html)
HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8 PsiI: 但是，实验室并没有PsiI ，所以只能再去寻找新的内切酶。在设计的引物有2 个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI 将野生型切断。 HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8 AluI:
t-DNA插入突变体的鉴定 实验时间：2012年5月18日 摘要T i质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。本实验即检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。 1.引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。若将Ti质粒进行改造，把感兴趣的基因放进T-DNA序列中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA 扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA 插入突变纯和体。 PCR（Polymerase Chain Reaction）， 即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术， 具有特异、敏感、产率高、快速、简便、 重复性好、易自动化等突出优点；能在一 个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万 倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本 原理如右图） DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer （本实验中为TAE）中带负电, 在电场中
培养基 MS培养基 (Sigma公司) B5培养基 (pH 5.5) Content mg/L Content mg/L Content mg/L KNO3 2500 ZnSO47H2O 2.0 Nicoti nic 1 CaCl22H2O 150 H3BO3 3.0 Thiami ne HCl 10 MgSO47H2O 250 KI 0.75 Pyri ndox ine 1 NaH2PO4'H2O 150 Na2MoO42H2O 0.25 m-I no sitol 100 FeSC47H2O 27.8 CoCl26H2O 0.025 Glyci ne 200 MnSO4H2O 10 Na2EDTA 37.3 Ki netin 0.1 CuSO45H2O 0.025 IAA 0.1-1 改良的1/4 Hoagland 培养液(mM, pH6.0): Content mM Content mM KNO3 1.25 Zn SO40.002 Ca(NO3)2 1.50 H3BO3 0.050 MgSO40.75 KCl 0.050 KH2PO4 0.5 (NH4)6Mo7°24 0.075 FeSq 0.072 CuSO40.0015 Na2EDTA 0.072 Na2SiO30.1 2植物材料的常规种植 拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌 o 发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 C，16/8 h的光照培养间中生长。 3拟南芥种子的表面灭菌处理 1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天
2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟 3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。 4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。 5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。 6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。 7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。 4植物材料的水培体系 拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/ 皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。 水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagla nd培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换 一次培养液。 5拟南芥T-DNAS入突变体的筛选方法 到网站输入salk号设计引物LP、RP T-DNA LB : LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LP + RP, BP+ RP扩增基因组DNA 方法: 1）将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭石中，待长至抽苔期准备DNA的提取。 2） DNA提取缓冲液的配制： Genome\ /Flankira SaaiifincfiL Pa N pZme Exl5Ext3pZcne EPa w
最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！ Step 1. 打开NCBI主页：https://www.doczj.com/doc/cc1537292.html,/ 打开的页面如下： 如下 得到如下页面：
进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图： 记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：https://www.doczj.com/doc/cc1537292.html,/ 点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：
显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：
项目编号 东北农业大学大学生科技创新基金 申请书 项目名称：拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定 项目主持人：李松 所在学院：生命科学学院 研究起止时间：2008年11月1日至2009年11月1日 东北农业大学教务处制
项目名称 拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定 研究起止时间2008.11~2009.11 申请金额1000元 项目主持人 姓名李松学号A09060068所在学院生命科学学院所学专业生物技术学生类别二年级年级班级生物技术 指导教师 （1） 姓名才华职称讲师 所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程 指导教师 （2） 姓名纪巍职称助教 所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程 项目组成员姓名刘维学号A0960072 专业班级生技062 姓名肖松学号A09060086 专业班级生技062 姓名王鹏姬学号A09060080 专业班级生技062 姓名卢清瑶学号A09060073 专业班级生技062
一、项研究的目的意义、国内外研究概况、主要创新之处 1．研究的目的意义 基因功能的主要研究方法包括：(1)克隆相关基因，进行异体超表达研究(Meyer 等2000，2004；Schulze等2003); (2)利用T-DNA插入突变技术，获得目的基因敲出突变体(Bouche 和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)，再通过筛选出的纯合突变体，研究目的基因的功能(Meyer等2004)。与前者相比，后者具有许多优势(Meyer 等2004)，已成为反向遗传学研究的主要手段(Bouche和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)。 bZIP类转录因子普遍存在于动植物及微生物中，是植物中一类很大的转录因子家族，在拟南芥中就有75个家族成员，在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中起到重要的作用。本研究利用已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。本研究可为利用突变体进行功能互补研究AtbZIP1基因的功能提供突变体材料，进而为研究AtbZIP1转录因子在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中所起的作用奠定基础。 2．国内外研究概况 1)突变体鉴定的方法的研究现状 反向遗传学研究的首要条件是获得大量基因敲除突变体，建立一套快速、可靠的T-DNA插入突变体鉴定方法对其进行鉴定很重要。目前，鉴定方法主要有2种(https://www.doczj.com/doc/cc1537292.html,/tdnaprimers.html): “三引物法”和“双引物法”。 “三引物法”的原理如图1 所示，即采用三引物(LP、RP、LB)进行PCR 扩增。野生型植株(wild type, WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR 产物仅有1 种，分子量即从LP到RP的大小; 纯合突变体植株(homozygous lines, HM)目的基因的两条染色体上均发生T-DNA 插入，而T-DNA 本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP (或RP)为引物进行扩增的产物，分子量即从LP 或RP 到T-DNA 插入位点的片段的长度再加上从LB 到T-DNA载体左边界的片段的长度;杂合突变体植株(heterozygous lines, HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA 插入，所以PCR 扩增后可同时得到
本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述 系别林学与园艺学院 班级园艺102班 姓名唐辉 学号103231228 答辩时间年月
新疆农业大学林园学院 拟南芥突变体的筛选综述 唐辉指导老师：王燕凌 摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试 验。在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na 2SeO 3 、钾、硒、NaCl等化合物或者化学 元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。 关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究 Screening Summary of Arabidopsis Mutants Tang Hui Instructor:Wang Yanling Abstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screening
1 培养基 MS培养基（Sigma公司） B5培养基（pH 5.5） 改良的1/4 Hoagland 培养液（mM, pH6.0）： 2 植物材料的常规种植 拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌 发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 o C， 16/8 h的光照培养间中生长。 3 拟南芥种子的表面灭菌处理 1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天。
2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟。 3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。 4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。 5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。 6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。 7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。 4 植物材料的水培体系 拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。 水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagland培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换一次培养液。 5 拟南芥T-DNA插入突变体的筛选方法 到网站https://www.doczj.com/doc/cc1537292.html,/tdnaprimers.html输入salk号设计引物LP、RP T-DNA LB：LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LP＋RP，BP＋RP扩增基因组DNA。 方法： 1)将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 姓名：余振洋；班级：09级生技1班；学号：200900140156 时间：2011/11/5 一．选题背景及意义 水资源短缺是目前公认的全球性环境焦点问题之一，我国人均占有水资源量(2300m )仅为世界人均量的1／4，是世界上13个最贫水国家之一，且大部分地区属亚洲季风区，干旱灾害具有普遍性、区域性、季节性和持续性的特点，旱灾十分严重。据1950～1999年统计，全国平均每年受旱面积达2173．33万hm2，成灾面积893．33万hm2，直接减收粮食100亿kg以上，约占各种自然灾害造成粮食损失的60％。干旱不仅造成农业的重大损失，还加剧了生态环境的恶化及土地沙漠化和水土流失，因此，干旱缺水已成为制约我国国民经济可持续发展及西部大开发的重要因素，且在一些地区已威胁到人类生存和发展。 随着分子生物学的迅速发展和应用，农业已成为生物技术应用的第二重大领域，基因工程技术将引发一场新的农业技术革命，使作物在干旱和贫瘠的土地上生长出高新品种，使人类在提高作物抗逆能力的基础上改善其品质和提高产量。因此，作物抗旱分子机制的研究具有重大的理论和实践意义，只有对植物抗旱分子机制彻底地了解后，才有可能为提高作物对干旱的抵抗能力提供理论依据。近年来该领域的研究已引起国内外学者广泛的兴趣和重视，在拟南芥、水稻、小麦等许多植物克隆了干旱胁迫应答基因，并对其表达调控和编码蛋白的功能进行了研究。本文简介了近年来该方面研究进展，为加快抗逆基固工程的研究，培育高品质的抗逆作物提供理论依据。 二．研究方案 1．相关文献： 海藻糖是细胞渗透调节时产生的重要相溶性物质之一，海藻糖一6一磷酸合成酶基因家族(Tre—halose-6一phosphatesynthase，TPS)是从拟南芥、复苏植物Selaginell lipidophylla等真核生物中分离得到的海藻糖合成酶基因。 ——＜A Review on Plant Drought and Salt Tolerance Gene＞，ZENG Hua—zong，LUO Li-jun，Shanghai Agrobiological Gene Center，Shanghai 201 1 06 2．实验材料： 1）海藻糖合成酶基因编号：A T1G16980 2）野生型拟南芥； 3）具抗旱性质基因的T-DNA插入突变种子：SALK_010881.55.00.x LP（左引物）：TTTGGCTTCTTGACAAGCAAC Len 21 TM 60.41 GC 42.86 SELF_ANY_COMPL 0.52 3'_COMPL 0.00 RP（右引物）：CTTGCAGCTGATTTACTTGGG Len 21 TM 59.89 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.52 3'_COMPL 0.00 4）器材：离心机，离心管，PCR仪，点泳池，电泳现象仪
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。 关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统 1.前言 拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。 2.实验 2.1实验目的 （1）提取植物基因组DNA的方法； （2）PCR操作方法； （3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。 2.2实验原理 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。 将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。 用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 “三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因 型的植株。此法的有点事可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。 “双引物法”的基本原理与“三引物法”相似，即采用特异引物扩增目的基因片段和T-DNA插入片段，通过比对扩增结果进行突变体的鉴定。具体方法图2所示：首先以基因组 DNA为模版，用一对特意产物（LP和RP）扩增目的基因片段，初步鉴定出纯合突变体（图
一、拟南芥的一般生物学特性 1. 形态学描述 拟南芥（Arabidopsis thaliana）为十字花科拟南芥属。一年生细弱草本植物（图21-1 A）。 株高15至30厘米，随生长环境或培养条件变化。基生叶多数，长圆形或椭圆形，呈莲座状排列。茎生叶具短柄或无柄。总状花序顶生，花瓣白色；雄蕊6枚，花药黄色；雌蕊圆柱状。长角果线形，长约10至16毫米，成熟时开裂。种子呈卵形，长约1毫米，成熟时红褐色。有关拟南芥的各种形态特征、形态发生及个体发育的过程等在许多文献中已有很详尽的描述，为研究人员利用拟南芥为实验材料提供了很好的基础和方便。 2. 个体小、易于栽培管理 与其它大多数高等植物相比，拟南芥的个体较小。成熟个体株高在15至30厘米之间。 由于个体小，很容易在面积有限的温室或人工气候室内大批量地种植。特别是对于一些有特殊要求的研究工作，甚至可以在培养器皿中完成生活史（如有时需要在无菌条件下进行培养等）。而且，拟南芥对生长条件的要求并不十分严格，这一特点使得在实验工作中很容易实现拟南芥的栽培管理。 3. 生长周期较短 在一般的温室或人工气候室条件下，从拟南芥种子的春化至第一批角果成熟大约需8周左右时间。当然，也可以通过改变生长条件以达到使拟南芥提前或推后开花结实的目的。如延长每天的光照时间，可使拟南芥明显地提前开花结实，利用每天接近24小时的光照条件培养，甚至在6周左右即可收获第一批成熟角果。拟南芥的这一特性使实验工作周期大大缩短，特别是对于许多遗传分析工作，比利用一般的高等植物材料（如麦类、豆类作物）可以成倍地节约时间。 二、拟南芥的普通遗传学特性 1. 既可自交、又可人工杂交 在自然条件下，拟南芥是典型的自交繁殖植物，这使得拟南芥在种植繁种过程中得以保持其遗传上的稳定性。同时在实验过程中，根据研究目的又可方便地实施人工杂交，使得遗传分析工作很容易完成。 2. 种子结实量大 虽然拟南芥植物个体较小，但其种子结实量非常之大。一个角果可结实数十至上百粒种子；在生长良好的情况下，单株结实量可达上万粒之多！这使得很容易进行后代的遗传分析工作，也很容易扩增所需突变体的种子库。 3. 容易被诱变产生所需突变体 拟南芥在正常条件下通过自交产生后代，在遗传上表现出较高的稳定性。但拟南芥在特殊条件处理后较易发生突变，如利用物理的（如辐射处理）、化学的（如EMS处理）、及遗传转化（如T-DNA插入）等方法进行人工诱变处理，可获得具有各种不同表型性状的突变体。利用这些人工诱变方法产生的突变是随机的，可进一步通过对突变体库的有目的筛选而获得所需的突变体。 4. 染色体结构 通过对细胞周期的中期（metaphase）染色体观察，可以清晰地辨认单倍体拟南芥有5条染色单体（2倍体为10条染色体）。对拟南芥遗传图谱的连锁关系分析，也证实了单倍体拟南芥包含5个遗传连锁群。除去着丝粒、端粒等区域及一些重复序列，目前已经完成测序的第一条至第五条染色体的DNA序列长度依次为29.1 Mb、19.6 Mb、23.2 Mb、 17.5 Mb、26.0 Mb（总长为115.4 Mb），而包括所有序列在内的拟南芥单倍体基因组总 长约为125 Mb（注：此数据为2000年12月14日《自然》杂志公布的数据，随着拟南
Step 1. 打开NCBI主页： 打开的页面如下： 如下 得到如下页面： 进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：
记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找 APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：点击 T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：
显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：
我们主要是从 ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。祝实验顺利！
拟南芥突变体的相关研究 遗传学 摘要：本文列举了利用正向遗传法对拟南芥突变体的筛选、遗传群体的初步遗传群体及初步遗传图谱的构建和基因的图位克隆、遗传分析及相关基因的功能分析的流程，为拟南芥的研究提供更明确更清晰的思路。 关键词：拟南芥突变体；筛选；图位克隆；功能分析 1 拟南芥突变体的筛选 拟南芥是十字花科拟南芥属植物，近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥的另一优点是很容易被诱变，目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体，这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。这里拟南芥耐低钾突变体的筛选为例，介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。 1.1植物材料诱变 以拟南芥为材料，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒）野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml重蒸水，搅拌30分钟；在4℃，下放置12小时后，把种子转移到盛30ml100mmol/L 磷酸缓冲液（PH6.5）的100ml三角瓶中，加入0.2%（V / V）的甲基磺酸乙酯（EMS），封 口后放在水浴（25℃）振荡器上振荡12h。然后用50ml蒸馏水漂洗种子4次，每次15min。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。 1.2诱变植株培养 将经EMS诱变处理后的拟南芥种子（M1）播种于1/4Hoagland 营养液浸透的混有蛭石的营养土中，然后覆膜保湿。18-22℃、光照强度120umol/m2s-1、光周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子。 1.3 突变体的筛选 拟南芥种子用0.5 %（v/ v）次氯酸钠加0.1%（v/ v）Tri-tonX-100表面消毒10分钟，再用无菌水冲洗3遍。接种前种子与0.4%（w/ v）低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化48小时，之后转入光照培养，培养皿垂直放置。培养箱温度22℃，连续光照，光强30umol/ m2s-1。 在确定的选择压力下，利用根弯曲方法对M2代进行筛选，将筛选得到的可能突变体再
姓名系年级学号日期 科目遗传学实验题目模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 摘要： 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。本次实验意在对模式植物拟南芥T-DNA插入突变体进行鉴定。实验中用到的主要实验方法有：CTAB法提取拟南芥基因组DNA、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。DNA经EB染色，EB可与核酸结合，在紫外光激发下产生荧光。现广泛应用于核酸的研究中。 引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 T-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的
拟南芥突变体的观察和鉴别
00911081 程万里 周一组 摘要：拟南芥是目前世界通用的一种高等植物研究的模式生物，属于十字花科，鼠耳芥 属，具有其生长快速、后代数量大、遗传和分子实验易操作等等的特点。这些优点使其成为 遗传、发育研究中很好的素材。本实验选用两种突变型（pid-2 和 scr-3）与野生型（Ler） 进行观察和鉴别， 比较其表型上的不同之处并做各种指标的测量以进行确认， 最终结果表明 pid-2 品系发育畸形(表现在花形态异常角果弯曲)，scr-3 个体生长缓慢（表现在植株和根 的长度较短以及败育现象严重） 关键词：拟南芥 突变体 pid-2 scr-3 Ler
1.引言
拟南芥是一种世界通用的，在高等植物研究方面十分重要的模式生物，属于十字花科， 鼠耳芥属，个体形态小，具有生长周期快，生命力顽强，后代数量多且遗传操作相对简单等 诸多优势。拟南芥基因组小且测序已全部完成。这些特点也决定了其在遗传学，发育生物学 上的不可替代性。 目前发现的拟南芥共有750多个生态型，不同生态型的拟南芥在形态发育，生理反应方 面有着相当大的差异， 本次选用的Ler野生型属于常见拟南芥品系之一。 而是用pid-2和scr-3 突变体与野生型（Ler）进行对比，可以通过各项指标的对比，确定突变基因对拟南芥发育 的影响。
2.材料与方法1
2.1 材料 2.1.1 生物材料： 拟南芥野生型（Ler）种子 突变体（pid-2、scr-3）种子
1
发育生物学实验讲义
2.1.2 试剂溶液： 70%乙醇 10%NaClO（次氯酸钠） 无菌水 2.1.3 仪器用具： MS 固体培养平板 玻璃涂棒 剪刀 镊子 胶头吸管 三角瓶 显微镜 1.5ml 离心管 培养土 培养钵 2.2 方法 (1)将种子放于 4℃冰箱内 2-3 天，进行种子的纯化处理 (2)取适量种子于 1.5ml 离心管中，加入 1ml 70%乙醇，轻微震荡 1min (3)吸去乙醇，加入 1ml 体积分数为 10%的 NaClO（次氯酸钠），消毒 8-10min (4)吸去 NaClO，用无菌水冲洗种子 5 次后，加入 600ul 无菌水 (5)用移液器将水连同种子吸起，均匀涂布于 MS 平板 (6)吸去并风干培养基表面多余的水分 (7)加盖，封口，置于光照培养箱内 (8)7-14 天后，当幼苗具 4 片真叶时转入土壤 (9)植株生长 6 周后，进行野生型和突变体的性状鉴别和数据统计
3.结果
3.1 拟南芥发育各时期图
作物突变体的细胞学研究 一、突变体的初步观察和遗传分析 在某品系材料A中发现一株突变体，将其命名为M，优先将M自交，得到具有突变性状的纯系，如果为不育等特殊性状则可以采取不断回交的方式得到相应 纯系；再将M与A和另外一品系Y分别正交和反交，得到F 1世代；将得到的F 1 自交得到各个的F 2世代；将F 1 与M进行回交，分别得到对应的BC 1 世代；如果需 要，还可以继续回交得BC 2 等世代。 观察M的突变性状在自交过程中是否始终存在，则能初步判别此突变性状是否为可遗传性状； 分别统计M与A，M与Y的正反交的表型数据，分析所有正交与反交的差异，可以判别此性状是由核基因控制或者细胞质基因控制，甚至为核质互作控制； 结合M自交过程中的突变性状的遗传特性和所有F 1 突变性状，可判别突变性状为隐性或显性； 统计分析F 2和BC 1 世代的突变表型数据，可判别控制突变性状为质量性状或 者数量性状，以及质量性状中的的基因的对数。 在数据的分析过程中要充分应用生物统计的方法，如方差分析，Χ2检验等。 二、突变体的细胞学观察 核型分析原理与步骤 核型分析是指在一个物种内，对其染色体数目。结构及其它特征进行描述性分析，从而对单一染色体进行初步分析的过程。在突变基因确定为核基因后，则可以进行核型分析。 不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。因此，染色体核型分析是植物遗传性研究的重要内容。 染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。染色体的长度差异有两种，一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异，一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。
遗传学实验报告 拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 一、实验目的： 1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能 2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。 二、实验原理 1、拟南芥（Arabidopsis thaliana） 十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。 植株形态个体小，高度只有30cm左右； 生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养； 遗传转化简单，转化效率高； 基因组小，只有5对染色体，125MB； 在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。 2、突变体 突变体是遗传学研究的最重要材料。 突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。 拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。 由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。 3、T-DNA插入突变原理 T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。 除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。 4、T-DNA插入突变体PCR鉴定 图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计
RMD水稻突变体信息及基因型鉴定 1.背景介绍： 突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。 植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。 2.原理： 2.1农杆菌介导的T-DNA 插入 农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。 研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA 类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。 2.2 水稻Tos17 反转录转座子 创造水稻突变体的另一种方法是利用植物的反转录转座子，它们是以DNA→RNA→DNA 的方式进行转座，在水稻上已发现大约40 种长未端重复的反转录转座子，它们是Tos1-Tos32，RIRE1-RIRE8，其中5 类被证明是有转座活性的，分别是Tos10、Tos17、Tos19、Tos25 和Tos27。这些反转录转座子只有在组织培养条件下才具备转座活性，其中Tos17 的转座活性最强，容易插入到富含基因的区域，因此可以直接用于创造插入失活的突变体库。利用含有Tos17 插入的水稻突变体库，可以进行突变性状的筛选， T os17 反转录转座子正成为水稻功能基因组研究的一个有力工具。由于Tos17 反转录转座子为水稻内源的转座子，不需要进行转基因的过程，而且平均每株含有8 个Tos17 个拷贝，在正常情况下能够稳定遗传，因此Tos17 转座子突变体库是水稻功能基因组研究的一个有用资源。但也有研究表明，Tos17 在转座过程中
EMS突变体致变基因鉴定 在植物遗传学研究中，研究者除了采用传统的正向遗传学手段外，反向遗传学也得到广泛应用。采用各种物理或化学突变，导致遗传物质发生突变，进而根据突变性状来研究变异基因的生物学功能。在众多的致突变手段中，EMS突变技术由于导致的突变多为单碱基突变，且遵循C>T突变规律，在近代遗传学研究中得到广泛的应用。常规的对突变基因的鉴定多采用建立F2连锁群体，通过分子标记进行图位克隆，研究的周期长、工作量大且过程繁琐。随着高通量测序技术的快速发展，实现了在短期时间内获得植物的基因组信息，为研究突变体的突变基因的鉴定提供了一条新的研究途径。 根据对研究材料中突变基因的信息不同可以分为两种策略： 方案一：对于已经比较纯合的突变体植株，可以直接对野生型植物和突变体植株进行深度测序，通过对野生型和突变体中的变异信息的分析，直接对导致表型的致变位点进行鉴定。 方案二：对于没有初步定位突变位点信息的材料，可以对突变植株的自交F2后代中，选择具有突变表型的植株进行混合测序，突变位点在混合群体中应该处于高度纯合而极低的杂合度，因此通过对全基因组中位点进行扫描，从而定位到突变位点。该方法特别适合于大量突变体的鉴定，可以同时鉴定大量的株系，且群体建立方法简便，工作量低。
变位点，并定位突变基因，然后对可能的突变基因的表达进行检测。 方案二：如果没有定位信息，可以将多株具有突变表型的F2个体的DNA按等量混合，并进行低深度（30X）测序，即可减少工作量
又可降低测序成本。由于EMS诱变F2代中具有表型的多为隐性纯合突变，突变基因所在区间为纯合子，为了减少假阳性出现，结合分析该区间的杂合度综合分析，获得突变位点后在扩大样品群体中进一步验证，即可定位导致突变表型的位点和基因。 水稻、拟南芥、玉米等重要模式和粮食作物已经完成了基因组的完整测序，为基于高通量测序技术的突变基因的鉴定奠定了丰富的资源基础。该方案的实施将为加快作物突变体的鉴定具有重要的推动作用，并为作物功能基因组研究提供了一种高效、便捷的技术手段。该方案一中针对具有明显表型的突变体方案包括以下三个步骤：（1）测序样本的选择及测序深度的确定 选择连续多代自交的突变体植株，以及野生型植株个体，提取基因组DNA，按照标准的Illunima 建库流程，建立插入片段为350bp 的文库，根据不同作物基因组大小进行30X测序。 （2）基因组重测序数据的获得与生物信息学分析 通过对测序数据的质控之后，将获得的reads同野生型基因组序列进行，找出测序数据中的SNP、InDel，对全基因组的SNP纯合度进行分析，找出可能的突变位点，并进一步采用其他分析软件进行确认，从而锁定出突变表型相关位点及基因。 （3）突变位点的鉴定和扩大群体中验证 根据生物信息学获得突变位点信息，利用Sanger测序进一步在突变体中进行验证。