项目编号
东北农业大学大学生科技创新基金
申请书
项目名称：拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540
的突变体鉴定
项目主持人：李松
所在学院：生命科学学院
研究起止时间：2008年11月1日至2009年11月1日
东北农业大学教务处制
项目名称
拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540
的突变体鉴定
研究起止时间2008.11~2009.11 申请金额1000元
项目主持人
姓名李松学号A09060068所在学院生命科学学院所学专业生物技术学生类别二年级年级班级生物技术
指导教师
（1）
姓名才华职称讲师
所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程
指导教师
（2）
姓名纪巍职称助教
所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程
项目组成员姓名刘维学号A0960072 专业班级生技062 姓名肖松学号A09060086 专业班级生技062 姓名王鹏姬学号A09060080 专业班级生技062 姓名卢清瑶学号A09060073 专业班级生技062
一、项研究的目的意义、国内外研究概况、主要创新之处
1．研究的目的意义
基因功能的主要研究方法包括：(1)克隆相关基因，进行异体超表达研究(Meyer 等2000，2004；Schulze等2003); (2)利用T-DNA插入突变技术，获得目的基因敲出突变体(Bouche 和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)，再通过筛选出的纯合突变体，研究目的基因的功能(Meyer等2004)。与前者相比，后者具有许多优势(Meyer 等2004)，已成为反向遗传学研究的主要手段(Bouche和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)。
bZIP类转录因子普遍存在于动植物及微生物中，是植物中一类很大的转录因子家族，在拟南芥中就有75个家族成员，在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中起到重要的作用。本研究利用已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。本研究可为利用突变体进行功能互补研究AtbZIP1基因的功能提供突变体材料，进而为研究AtbZIP1转录因子在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中所起的作用奠定基础。
2．国内外研究概况
1)突变体鉴定的方法的研究现状
反向遗传学研究的首要条件是获得大量基因敲除突变体，建立一套快速、可靠的T-DNA插入突变体鉴定方法对其进行鉴定很重要。目前，鉴定方法主要有2种(https://www.doczj.com/doc/283585398.html,/tdnaprimers.html): “三引物法”和“双引物法”。
“三引物法”的原理如图1 所示，即采用三引物(LP、RP、LB)进行PCR 扩增。野生型植株(wild type, WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR 产物仅有1 种，分子量即从LP到RP的大小; 纯合突变体植株(homozygous lines, HM)目的基因的两条染色体上均发生T-DNA 插入，而T-DNA 本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP (或RP)为引物进行扩增的产物，分子量即从LP 或RP 到T-DNA 插入位点的片段的长度再加上从LB 到T-DNA载体左边界的片段的长度;杂合突变体植株(heterozygous lines, HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA 插入，所以PCR 扩增后可同时得到
两种产物(如图1所示)。
图1. “三引物法”鉴定突变体的原理(https://www.doczj.com/doc/283585398.html,/tdnaprimers.html) a: T-DNA 插入目的基因编码序列的方式、位置以及PCR 鉴定反应所需引物。LP、RP：与目
的基因片段互补的特异引物；插入T-DNA 片段的特异引物；N：T-DNA 的实际插入位点与侧翼序列之间的距离(通常为0~300 bp)。
b：3 种可能的基因型植株PCR 产物的差异。WT ：野生型植株；HZ ：杂合突变体植株；HM ：纯合突变体植株。
2)AtbZIP1转录因子的研究进展
在对植物逆境信号传导的研究中发现，转录因子是一个很关键的因素，在胁迫刺激下它们不断合成，并将信号传递和放大，调控下游基因的表达，从而引起植物生理生化的改变。bZIP类转录因子是植物中比较重要的转录因子家族，参与众多的生理生化反应。而最近发现，其在植物抗非生物胁迫反应中也起到一定的作用。
植物体内存在大量的转录因子，拟南芥(Arabidopsis thaliana)中就有5.6%的基因是编码转录因子的。典型的转录因子含有DNA结合区(DNA-binding domain)、转录激活区(activation domain)、寡聚化位点(oligomerization site)以及核定位信号区(nuclear localization signal)等4个主要的功能区域，这些功能区域决定转录因子的功能和特性。根据转录因子表达的特点可以将其分为两类，一类是组成型转录因子，无论在逆境还是正常状况下基因都表达。另一类是诱导型转录因子，只有在逆境下基因才会表达，绝大部分的转录因子都是这种自身的反馈调节。
bZIP类转录因子是植物中一类很大的转录因子家族，其共同特点是：含有与特异DNA序列相结合的碱性结构域；参与寡聚化作用的亮氨酸拉链区与碱性区紧密相连；转录因子的N-末端含有酸性激活区；以二聚体形式结合DNA，肽链N-末端的碱性区与DNA直接结合。
bZIP类转录因子中有两类成员和植物非生物胁迫应答密切相关，一类是TGA/OBF 蛋白，D-亚家族的成员。它们可以结合到as-1/ocs 类顺式元件上，在植物非生物胁迫应答及发育中起重要作用。另一类转录因子是ABF/ABRE蛋白，A-亚家族的大多数成员属于此类蛋白。该类转录因子可以识别ABRE类顺式作用元件
（CACGTG），在盐胁迫和干旱胁迫中起重要作用[7]。利用酵母单杂交的方法从拟南芥中分离出逆境诱导的4种bZIP蛋白，属于ABRE 结合因子（ABRE binding factors，ABFs）/ABRE结合蛋白（ABA-responsive element binding, AREB），分别是ABF1、ABF2/AREB1、ABF3和ABF4/AREB2。在干旱、盐胁迫和ABA处理条件下这4种转录因子大量表达，诱导ABA的过敏感以及其他表现型，使植物体内的糖积累，内源ABA 合成，耐盐和耐旱等诸多抗性相关基因的表达增强。
参考文献
[1]陈丽. (1999) 植物转录因子的结构与功能. 植物生理学通讯, 33:401~409.
[2]Yamaguchi S K, Shinozaki K. (1994) A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness
to drought, low-temperature or high-salt stress. Plant Cell, 6:251~264.
[3]Liu Qiang, Zhang Gui-You, Chen Shou-Yi. (2001) Structure and regulatory function of plant transcription factors.
Chinese Science Bulletin, 46(4):271～278.
[4]Liu L, White MJ, MacRae TH. (1999) Transcription factors and their genes in higher plants
functional domains, evolution and regulation. Eur J Biochem, 262:247~257.
3.创新点
1）利用“三引物法”对拟南芥突变体进行插入T-DNA纯合鉴定；
2）通过RT-PCR在转录水平上进一步鉴定突变体。
二、项目主要研究内容、目标与技术经济指标
1．项目主要研究内容
本研究利用植物生物工程研究室已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。
2．目标与主要技术经济指标
（1）建立一套通用的植物突变体鉴定的方法；
（2）获得AtbZIP1基因的拟南芥插入纯合突变体10株；
（3）发表学术论文1篇。
三、项目研究方法与技术路线
1． 项目研究方法
（1） 种植拟南芥突变体；
（2） 提取拟南芥的DNA ，利用“三引物法”鉴定插入纯合；
（3） 提取拟南芥的RNA ，消除基因组DNA ；
（4） 对提取得拟南芥RNA 进行反转录；
（5） 用RT-PCR 鉴定AtbZIP1基因是否表达。
2． 技术路线
四、项目前期研究基础、实验条件
1．项目前期研究基础 本研究所依托的植物生物工程研究室长期从事植物基因工程的研究，近五年完成和在研科研项目19项，其中“973”前期、“948”项目和国家转基因专项和国家自然科学基金等。研究室具有丰富的研究经验和基因资源。
本研究已购买了拟南芥突变体，为实验的进行提供了研究材料。本组成员由于对科学研究的共同爱好自由组合。目前已完成大学一年的学习任务；掌握了有关的基础知识；在课下学习了基因工程的有关理论知识；阅读了有关基因工程和植物生理相关拟南芥突变体种植
确认拟南芥突变体
“三引物法”鉴定纯合体 拟南芥DNA 提取 拟南芥RNA 提取
“三引物法”鉴定插入 RNA 反转录
RT-PCR 鉴定
的书籍；查阅了关于突变体鉴定的相关文献，及PCR和RT-PCR的相关实验技术资料。
在实验能力方面，通过大一一年的实验课的训练，已掌握了基本的实验技能；课下学习了植物基因组DNA, RNA 提取以及PCR检测的实验及方法，能够独立进行研究中的有关操作。
2．实验条件
本研究所依托的植物生物工程研究室建立了植物基因组DNA, RNA 提取以及PCR 检测平台，并拥有大量分子生物学研究的仪器设备。
五、经费预算（实验材料费、资料费等）
1．实验材料费
植物材料处理费200元
PCR 引物合成费200元
2．仪器使用费
使用食品中心开放实验室仪器，仪器使用费600元
申请经费总额1000元。
六、年度研究计划及预期进展
2008年11月~2009年1月
（1）拟南芥突变体的种植
（2）拟南芥基因组DNA的提取
2009年2月
（1）“三引物法”鉴定插入纯合的PCR反应体系及条件探讨
（2）利用“三引物法”鉴定纯合体
（3）对纯合体进行T-DNA插入鉴定
2009年3月~2009年5月
（1）拟南芥总RNA的提取
（2）拟南芥总RNA的反转录
2009年6月~2009年7月
（1）拟南芥内参基因RT-PCR
（2）A tbZIP1基因At5g49540的反转录PCR鉴定
（3）分析整理数据。
2009年8月
撰写论文和结题报告；并根据实验的结果进行更新的实验设计，对问题进行深入研究。
七、指导教师意见(项目的科学性、可行性、经费预算审核)
1. 项目的科学性
随着生物技术的不断发展，利用突变体鉴定基因的功能，已成为反向遗传学研究的主要手段。本研究分别从DNA, RNA 水平鉴定突变体，具有理论依据。并且该研究结果将为植物突变体的鉴定提供一种较为理想的方法。研究目标明确、内容具体、技术路线清晰，具有重要的科学研究价值。
2. 项目的可行性
该研究所用的拟南芥突变体是本研究室人员购买的，即具有分子生物学证据，在此基础上继续研究，能够保证结果的可靠性。采用“三引物法”以及RT-PCR分别从不同水平鉴定突变体，此方法科学准确，所用的仪器本研究室都有提供，为该研究的顺利完成提供了良好的条件。从事该项研究的学生均为生命科学学院生物科学的学生，他们在基础课和专业课的学习中将学到该研究所涉及到的原理和方法，具备进行该项研究的能力。
3. 经费预算审核
项目经费预算合理，植物生物工程研究室在实验指导、经费、仪器上将给予全力的支持。
指导教师签字：
年月日
八、评审意见
（一）学院教授委员会意见：
主任签字：
（单位公章）
年月日（二）教务处审核意见：
处长签字：
（单位公章）
年月日（三）学校审批意见：
主管校长签字：
年月日
t-DNA插入突变体的鉴定 实验时间：2012年5月18日 摘要T i质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。本实验即检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。 1.引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。若将Ti质粒进行改造，把感兴趣的基因放进T-DNA序列中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA 扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA 插入突变纯和体。 PCR（Polymerase Chain Reaction）， 即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术， 具有特异、敏感、产率高、快速、简便、 重复性好、易自动化等突出优点；能在一 个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万 倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本 原理如右图） DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer （本实验中为TAE）中带负电, 在电场中
培养基 MS培养基 (Sigma公司) B5培养基 (pH 5.5) Content mg/L Content mg/L Content mg/L KNO3 2500 ZnSO47H2O 2.0 Nicoti nic 1 CaCl22H2O 150 H3BO3 3.0 Thiami ne HCl 10 MgSO47H2O 250 KI 0.75 Pyri ndox ine 1 NaH2PO4'H2O 150 Na2MoO42H2O 0.25 m-I no sitol 100 FeSC47H2O 27.8 CoCl26H2O 0.025 Glyci ne 200 MnSO4H2O 10 Na2EDTA 37.3 Ki netin 0.1 CuSO45H2O 0.025 IAA 0.1-1 改良的1/4 Hoagland 培养液(mM, pH6.0): Content mM Content mM KNO3 1.25 Zn SO40.002 Ca(NO3)2 1.50 H3BO3 0.050 MgSO40.75 KCl 0.050 KH2PO4 0.5 (NH4)6Mo7°24 0.075 FeSq 0.072 CuSO40.0015 Na2EDTA 0.072 Na2SiO30.1 2植物材料的常规种植 拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌 o 发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 C，16/8 h的光照培养间中生长。 3拟南芥种子的表面灭菌处理 1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天
2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟 3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。 4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。 5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。 6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。 7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。 4植物材料的水培体系 拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/ 皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。 水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagla nd培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换 一次培养液。 5拟南芥T-DNAS入突变体的筛选方法 到网站输入salk号设计引物LP、RP T-DNA LB : LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LP + RP, BP+ RP扩增基因组DNA 方法: 1）将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭石中，待长至抽苔期准备DNA的提取。 2） DNA提取缓冲液的配制： Genome\ /Flankira SaaiifincfiL Pa N pZme Exl5Ext3pZcne EPa w
HY5‐215 The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and?hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995. In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processing In hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an a HY5‐215的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点PsiI，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。 Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0 (https://www.doczj.com/doc/283585398.html,/dcaps/dcaps.html)
HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8 PsiI: 但是，实验室并没有PsiI ，所以只能再去寻找新的内切酶。在设计的引物有2 个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI 将野生型切断。 HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8 AluI:
项目编号 东北农业大学大学生科技创新基金 申请书 项目名称：拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定 项目主持人：李松 所在学院：生命科学学院 研究起止时间：2008年11月1日至2009年11月1日 东北农业大学教务处制
项目名称 拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定 研究起止时间2008.11~2009.11 申请金额1000元 项目主持人 姓名李松学号A09060068所在学院生命科学学院所学专业生物技术学生类别二年级年级班级生物技术 指导教师 （1） 姓名才华职称讲师 所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程 指导教师 （2） 姓名纪巍职称助教 所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程 项目组成员姓名刘维学号A0960072 专业班级生技062 姓名肖松学号A09060086 专业班级生技062 姓名王鹏姬学号A09060080 专业班级生技062 姓名卢清瑶学号A09060073 专业班级生技062
一、项研究的目的意义、国内外研究概况、主要创新之处 1．研究的目的意义 基因功能的主要研究方法包括：(1)克隆相关基因，进行异体超表达研究(Meyer 等2000，2004；Schulze等2003); (2)利用T-DNA插入突变技术，获得目的基因敲出突变体(Bouche 和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)，再通过筛选出的纯合突变体，研究目的基因的功能(Meyer等2004)。与前者相比，后者具有许多优势(Meyer 等2004)，已成为反向遗传学研究的主要手段(Bouche和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)。 bZIP类转录因子普遍存在于动植物及微生物中，是植物中一类很大的转录因子家族，在拟南芥中就有75个家族成员，在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中起到重要的作用。本研究利用已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。本研究可为利用突变体进行功能互补研究AtbZIP1基因的功能提供突变体材料，进而为研究AtbZIP1转录因子在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中所起的作用奠定基础。 2．国内外研究概况 1)突变体鉴定的方法的研究现状 反向遗传学研究的首要条件是获得大量基因敲除突变体，建立一套快速、可靠的T-DNA插入突变体鉴定方法对其进行鉴定很重要。目前，鉴定方法主要有2种(https://www.doczj.com/doc/283585398.html,/tdnaprimers.html): “三引物法”和“双引物法”。 “三引物法”的原理如图1 所示，即采用三引物(LP、RP、LB)进行PCR 扩增。野生型植株(wild type, WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR 产物仅有1 种，分子量即从LP到RP的大小; 纯合突变体植株(homozygous lines, HM)目的基因的两条染色体上均发生T-DNA 插入，而T-DNA 本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP (或RP)为引物进行扩增的产物，分子量即从LP 或RP 到T-DNA 插入位点的片段的长度再加上从LB 到T-DNA载体左边界的片段的长度;杂合突变体植株(heterozygous lines, HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA 插入，所以PCR 扩增后可同时得到
最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！ Step 1. 打开NCBI主页：https://www.doczj.com/doc/283585398.html,/ 打开的页面如下： 如下 得到如下页面：
进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图： 记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：https://www.doczj.com/doc/283585398.html,/ 点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：
显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：
第一部分基础练习 一、名词解释 1.末端产物阻遏：是指由某代谢途径末端产物的过量累积时而引起的反馈阻遏，是一种较为重要的反馈阻遏。 2.分解代谢物阻遏：是指细胞内同时存在两种碳源(或两种氮源)时，利用快的那种碳源(或氮源)会阻遏利用慢的那种碳源(或氮源)的有关酶合成的现象。 3.代谢调控:在发酵工业中，为了大量积累人们所需要的某一代谢产物，常人为地打破微生物细胞内的自动代谢调节机制，使代谢朝人们所希望的方向进行，这就是所谓的代谢调控。 4.营养缺陷型菌株因基因突变致使某一合成途径中断，丧失合成其生长中必需的某种物质的能力，使末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈抑制或调节，可使代谢途径中的某一中间产物过量积累，也可使分子代谢的中间产物和另一分支途径中的末端产物积累。 5.外源诱导物：抗生素生物合成过程中，参与次级代谢的酶，有些是诱导酶，诱导物有的是外界加入的，称外源诱导物。 二、问答题 1.答：氨基酸生产方法主要有合成法与发酵法两种。 2.答：野生型菌株，营养缺陷型突变株，或是氨基酸结构类似物抗性突变株. 3.答：氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制和在合成途径分枝点处的优先合成，除此之外，还有一些特殊的调节机制，如协同反馈抑制、合作（或增效）反馈抑制、同功酶控制、顺序控制、平衡合成、代谢互锁等。 4.答：在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸合成分支上的第一个酶——二氢吡啶合成酶（DDP合成酶）受到与本途径无关的另一种氨基酸——亮氨酸的阻遏（即代谢互锁）。 5.答：具有分子代谢途径的分支点。即在分支合成途径中，分支点后的两种酶竞争同一种底物，由于两种酶对底物的Km值（即对底物的亲和力）不同，故 两条支路的一条优先合成。 第二部分技能训练 一、选择题 1.D 2.C 3.D 4.B 5.B 6.A 7.C 二、问答题
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 姓名：余振洋；班级：09级生技1班；学号：200900140156 时间：2011/11/5 一．选题背景及意义 水资源短缺是目前公认的全球性环境焦点问题之一，我国人均占有水资源量(2300m )仅为世界人均量的1／4，是世界上13个最贫水国家之一，且大部分地区属亚洲季风区，干旱灾害具有普遍性、区域性、季节性和持续性的特点，旱灾十分严重。据1950～1999年统计，全国平均每年受旱面积达2173．33万hm2，成灾面积893．33万hm2，直接减收粮食100亿kg以上，约占各种自然灾害造成粮食损失的60％。干旱不仅造成农业的重大损失，还加剧了生态环境的恶化及土地沙漠化和水土流失，因此，干旱缺水已成为制约我国国民经济可持续发展及西部大开发的重要因素，且在一些地区已威胁到人类生存和发展。 随着分子生物学的迅速发展和应用，农业已成为生物技术应用的第二重大领域，基因工程技术将引发一场新的农业技术革命，使作物在干旱和贫瘠的土地上生长出高新品种，使人类在提高作物抗逆能力的基础上改善其品质和提高产量。因此，作物抗旱分子机制的研究具有重大的理论和实践意义，只有对植物抗旱分子机制彻底地了解后，才有可能为提高作物对干旱的抵抗能力提供理论依据。近年来该领域的研究已引起国内外学者广泛的兴趣和重视，在拟南芥、水稻、小麦等许多植物克隆了干旱胁迫应答基因，并对其表达调控和编码蛋白的功能进行了研究。本文简介了近年来该方面研究进展，为加快抗逆基固工程的研究，培育高品质的抗逆作物提供理论依据。 二．研究方案 1．相关文献： 海藻糖是细胞渗透调节时产生的重要相溶性物质之一，海藻糖一6一磷酸合成酶基因家族(Tre—halose-6一phosphatesynthase，TPS)是从拟南芥、复苏植物Selaginell lipidophylla等真核生物中分离得到的海藻糖合成酶基因。 ——＜A Review on Plant Drought and Salt Tolerance Gene＞，ZENG Hua—zong，LUO Li-jun，Shanghai Agrobiological Gene Center，Shanghai 201 1 06 2．实验材料： 1）海藻糖合成酶基因编号：A T1G16980 2）野生型拟南芥； 3）具抗旱性质基因的T-DNA插入突变种子：SALK_010881.55.00.x LP（左引物）：TTTGGCTTCTTGACAAGCAAC Len 21 TM 60.41 GC 42.86 SELF_ANY_COMPL 0.52 3'_COMPL 0.00 RP（右引物）：CTTGCAGCTGATTTACTTGGG Len 21 TM 59.89 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.52 3'_COMPL 0.00 4）器材：离心机，离心管，PCR仪，点泳池，电泳现象仪
本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述 系别林学与园艺学院 班级园艺102班 姓名唐辉 学号103231228 答辩时间年月
新疆农业大学林园学院 拟南芥突变体的筛选综述 唐辉指导老师：王燕凌 摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试 验。在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na 2SeO 3 、钾、硒、NaCl等化合物或者化学 元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。 关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究 Screening Summary of Arabidopsis Mutants Tang Hui Instructor:Wang Yanling Abstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screening
1 培养基 MS培养基（Sigma公司） B5培养基（pH 5.5） 改良的1/4 Hoagland 培养液（mM, pH6.0）： 2 植物材料的常规种植 拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌 发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 o C， 16/8 h的光照培养间中生长。 3 拟南芥种子的表面灭菌处理 1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天。
2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟。 3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。 4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。 5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。 6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。 7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。 4 植物材料的水培体系 拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。 水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagland培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换一次培养液。 5 拟南芥T-DNA插入突变体的筛选方法 到网站https://www.doczj.com/doc/283585398.html,/tdnaprimers.html输入salk号设计引物LP、RP T-DNA LB：LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LP＋RP，BP＋RP扩增基因组DNA。 方法： 1)将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭
弱化子是指原核生物操纵子中能显著减弱甚至终止转录作用的一段核苷酸序列，该区域能形成不同的二级结构，利用原核生物转录与翻译的偶联机制对转录进行调节。 分子伴侣是一类序列上没有相关性担忧共同功能的保守性蛋白质，它们在细胞内能帮助其他多肽进行正确的折叠、组装、运转和降解 基因家族在基因进化过程中一个基因通过基因重复产生两个或更多的拷贝，这些基因构成一个基因家族，是具有显著性的一组基因，编码相似的蛋白质的产物。 操纵子是指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。 重叠基因具有部分公用核苷酸序列的基因，即同一段DNA携带了不同蛋白质的编码信息。重叠的序列可以是调控基因，也可以是结构基因的部分。 基因重排是指将一个基因从远离启动子的地方移到距启动子很近的地方从而启动转录的方式。 看家基因（管家基因）在个体的所有细胞中持续表达的基因。 复制子单独复制的一个DNA单元被称为一个复制子，它是一个可移动的单位。一个复制子在任何一个细胞周期只复制一次。 逆转录以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。此过程中，核酸合成与转录过程与遗传信息的流动方向相反，故称为逆转录。逆转录过程是RNA 病毒的复制形式之一，需逆转录酶的催化。 沉默突变（同义突变）是指碱基的改变不引起氨基酸改变的突变。 同工tRNA指几个代表相同的氨基酸，能够被一个特殊的氨酰—tRNA合成酶识别的tRNA. 无义突变在DNA序列中任何导致编码氨基酸的三联密码子转变为终止密码子的突变，它使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽。 端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期。 核心启动子是指保证RNA聚合酶II转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点上游 -25 ~ -30bp处的TATA区。 切除修复DNA损伤的一种修复机制，直接切除受损伤的一条DNA片段，以其互补链为模板新合成DNA来取代切除的受损片段。 错配修复是对DNA错配区的修复。通过母链甲基化原则找出区分母链与子链从而修正子链上错配的碱基。 转座子能够在没有序列相关性的情况下独立插入基因组新位点上的一段DNA序列，是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。参与转座子移位及DNA链整合的酶称为转座酶。 密码的简并由一种以上密码子编码同一氨基酸的现象，对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子。 基因组一个细胞或病毒携带的全部遗传信息或整套基因，包括每一条染色体和所有亚细胞器的DNA序列信息。顺式作用元件是指启动子和基因的调节序列，主要包括启动子、增强子和沉默子。 DNA有义链DNA分子两条链中只有一条具有转录功能叫做模板链或反义链，无转录功能的链叫做编码链或有义链，这个基因的有义链可能是另一个基因的反义链。 -35序列23.-10序列在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。顺反子功能基因，意为通过顺式及反式试验所确定的一个遗传学单位。 核酶是一类具有催化活性的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性的剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。 比较基因组学在基因组图谱和序列分析的基础上，对已知基因和基因结构进行比较，了解基因的功能、表达调控机制和物种进化过程的学科。 SD 序列存在于原核生物起始密码子AUG上游7~12个核苷酸处的一种4~7个核苷酸的保守片段，它与168-rRNA 3'端反向互补，所以可以将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。根据首次识别其功能意义的科学家命名。 基因敲除针对一个序列已知但功能未知的基因，从DNA水平设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除其表达机制，从而推测该基因的生物学功能 冈崎片段是在DNA半不连续中产生的长度1000—2000个碱基的短的DNA片段，能被连接形成一条完整的DNA 链 C 值反常. 也称C值谬误，指C指往往与种系的进化复杂性不一致的现象，即基因组大小与遗传复杂性之间没有必要的联系，某些较低等的生物C值却很大。 弱化子是指原核生物操纵子中能显著减弱甚至终止转
Step 1. 打开NCBI主页： 打开的页面如下： 如下 得到如下页面： 进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：
记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找 APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：点击 T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：
显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：
我们主要是从 ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。祝实验顺利！
氨基酸生产工艺 主讲人：韩北忠 刘萍 氨基酸是构成蛋白成分 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。 氨基酸 α 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。 氨基酸的用途 1. 食品工业： 强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中) 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。 2. 饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 3. 医药工业： 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 4. 化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。 氨基酸的生产方法 发酵法： 直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。 添加前体法 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。 生产氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。 在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品, 1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。 关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统 1.前言 拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。 2.实验 2.1实验目的 （1）提取植物基因组DNA的方法； （2）PCR操作方法； （3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。 2.2实验原理 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。 将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。 用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 “三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因 型的植株。此法的有点事可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。 “双引物法”的基本原理与“三引物法”相似，即采用特异引物扩增目的基因片段和T-DNA插入片段，通过比对扩增结果进行突变体的鉴定。具体方法图2所示：首先以基因组 DNA为模版，用一对特意产物（LP和RP）扩增目的基因片段，初步鉴定出纯合突变体（图
姓名系年级学号日期 科目遗传学实验题目模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 摘要： 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。本次实验意在对模式植物拟南芥T-DNA插入突变体进行鉴定。实验中用到的主要实验方法有：CTAB法提取拟南芥基因组DNA、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。DNA经EB染色，EB可与核酸结合，在紫外光激发下产生荧光。现广泛应用于核酸的研究中。 引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 T-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的
拟南芥突变体的相关研究 遗传学 摘要：本文列举了利用正向遗传法对拟南芥突变体的筛选、遗传群体的初步遗传群体及初步遗传图谱的构建和基因的图位克隆、遗传分析及相关基因的功能分析的流程，为拟南芥的研究提供更明确更清晰的思路。 关键词：拟南芥突变体；筛选；图位克隆；功能分析 1 拟南芥突变体的筛选 拟南芥是十字花科拟南芥属植物，近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥的另一优点是很容易被诱变，目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体，这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。这里拟南芥耐低钾突变体的筛选为例，介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。 1.1植物材料诱变 以拟南芥为材料，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒）野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml重蒸水，搅拌30分钟；在4℃，下放置12小时后，把种子转移到盛30ml100mmol/L 磷酸缓冲液（PH6.5）的100ml三角瓶中，加入0.2%（V / V）的甲基磺酸乙酯（EMS），封 口后放在水浴（25℃）振荡器上振荡12h。然后用50ml蒸馏水漂洗种子4次，每次15min。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。 1.2诱变植株培养 将经EMS诱变处理后的拟南芥种子（M1）播种于1/4Hoagland 营养液浸透的混有蛭石的营养土中，然后覆膜保湿。18-22℃、光照强度120umol/m2s-1、光周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子。 1.3 突变体的筛选 拟南芥种子用0.5 %（v/ v）次氯酸钠加0.1%（v/ v）Tri-tonX-100表面消毒10分钟，再用无菌水冲洗3遍。接种前种子与0.4%（w/ v）低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化48小时，之后转入光照培养，培养皿垂直放置。培养箱温度22℃，连续光照，光强30umol/ m2s-1。 在确定的选择压力下，利用根弯曲方法对M2代进行筛选，将筛选得到的可能突变体再
作物突变体的细胞学研究 一、突变体的初步观察和遗传分析 在某品系材料A中发现一株突变体，将其命名为M，优先将M自交，得到具有突变性状的纯系，如果为不育等特殊性状则可以采取不断回交的方式得到相应 纯系；再将M与A和另外一品系Y分别正交和反交，得到F 1世代；将得到的F 1 自交得到各个的F 2世代；将F 1 与M进行回交，分别得到对应的BC 1 世代；如果需 要，还可以继续回交得BC 2 等世代。 观察M的突变性状在自交过程中是否始终存在，则能初步判别此突变性状是否为可遗传性状； 分别统计M与A，M与Y的正反交的表型数据，分析所有正交与反交的差异，可以判别此性状是由核基因控制或者细胞质基因控制，甚至为核质互作控制； 结合M自交过程中的突变性状的遗传特性和所有F 1 突变性状，可判别突变性状为隐性或显性； 统计分析F 2和BC 1 世代的突变表型数据，可判别控制突变性状为质量性状或 者数量性状，以及质量性状中的的基因的对数。 在数据的分析过程中要充分应用生物统计的方法，如方差分析，Χ2检验等。 二、突变体的细胞学观察 核型分析原理与步骤 核型分析是指在一个物种内，对其染色体数目。结构及其它特征进行描述性分析，从而对单一染色体进行初步分析的过程。在突变基因确定为核基因后，则可以进行核型分析。 不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。因此，染色体核型分析是植物遗传性研究的重要内容。 染色体核型分析主要包括染色体长度、染色体臂比、着丝点位置、次缢痕等。染色体的长度差异有两种，一种是不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度差异，一种是同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。
拟南芥突变体的观察和鉴别
00911081 程万里 周一组 摘要：拟南芥是目前世界通用的一种高等植物研究的模式生物，属于十字花科，鼠耳芥 属，具有其生长快速、后代数量大、遗传和分子实验易操作等等的特点。这些优点使其成为 遗传、发育研究中很好的素材。本实验选用两种突变型（pid-2 和 scr-3）与野生型（Ler） 进行观察和鉴别， 比较其表型上的不同之处并做各种指标的测量以进行确认， 最终结果表明 pid-2 品系发育畸形(表现在花形态异常角果弯曲)，scr-3 个体生长缓慢（表现在植株和根 的长度较短以及败育现象严重） 关键词：拟南芥 突变体 pid-2 scr-3 Ler
1.引言
拟南芥是一种世界通用的，在高等植物研究方面十分重要的模式生物，属于十字花科， 鼠耳芥属，个体形态小，具有生长周期快，生命力顽强，后代数量多且遗传操作相对简单等 诸多优势。拟南芥基因组小且测序已全部完成。这些特点也决定了其在遗传学，发育生物学 上的不可替代性。 目前发现的拟南芥共有750多个生态型，不同生态型的拟南芥在形态发育，生理反应方 面有着相当大的差异， 本次选用的Ler野生型属于常见拟南芥品系之一。 而是用pid-2和scr-3 突变体与野生型（Ler）进行对比，可以通过各项指标的对比，确定突变基因对拟南芥发育 的影响。
2.材料与方法1
2.1 材料 2.1.1 生物材料： 拟南芥野生型（Ler）种子 突变体（pid-2、scr-3）种子
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发育生物学实验讲义
2.1.2 试剂溶液： 70%乙醇 10%NaClO（次氯酸钠） 无菌水 2.1.3 仪器用具： MS 固体培养平板 玻璃涂棒 剪刀 镊子 胶头吸管 三角瓶 显微镜 1.5ml 离心管 培养土 培养钵 2.2 方法 (1)将种子放于 4℃冰箱内 2-3 天，进行种子的纯化处理 (2)取适量种子于 1.5ml 离心管中，加入 1ml 70%乙醇，轻微震荡 1min (3)吸去乙醇，加入 1ml 体积分数为 10%的 NaClO（次氯酸钠），消毒 8-10min (4)吸去 NaClO，用无菌水冲洗种子 5 次后，加入 600ul 无菌水 (5)用移液器将水连同种子吸起，均匀涂布于 MS 平板 (6)吸去并风干培养基表面多余的水分 (7)加盖，封口，置于光照培养箱内 (8)7-14 天后，当幼苗具 4 片真叶时转入土壤 (9)植株生长 6 周后，进行野生型和突变体的性状鉴别和数据统计
3.结果
3.1 拟南芥发育各时期图
遗传学实验报告 拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 一、实验目的： 1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能 2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。 二、实验原理 1、拟南芥（Arabidopsis thaliana） 十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。 植株形态个体小，高度只有30cm左右； 生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养； 遗传转化简单，转化效率高； 基因组小，只有5对染色体，125MB； 在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。 2、突变体 突变体是遗传学研究的最重要材料。 突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。 拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。 由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。 3、T-DNA插入突变原理 T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。 除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。 4、T-DNA插入突变体PCR鉴定 图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计