拟南芥突变体的相关研究
遗传学
摘要：本文列举了利用正向遗传法对拟南芥突变体的筛选、遗传群体的初步遗传群体及初步遗传图谱的构建和基因的图位克隆、遗传分析及相关基因的功能分析的流程，为拟南芥的研究提供更明确更清晰的思路。
关键词：拟南芥突变体；筛选；图位克隆；功能分析
1 拟南芥突变体的筛选
拟南芥是十字花科拟南芥属植物，近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥的另一优点是很容易被诱变，目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体，这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。这里拟南芥耐低钾突变体的筛选为例，介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。
1.1植物材料诱变
以拟南芥为材料，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒）野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml重蒸水，搅拌30分钟；在4℃，下放置12小时后，把种子转移到盛30ml100mmol/L
磷酸缓冲液（PH6.5）的100ml三角瓶中，加入0.2%（V / V）的甲基磺酸乙酯（EMS），封
口后放在水浴（25℃）振荡器上振荡12h。然后用50ml蒸馏水漂洗种子4次，每次15min。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。
1.2诱变植株培养
将经EMS诱变处理后的拟南芥种子（M1）播种于1/4Hoagland 营养液浸透的混有蛭石的营养土中，然后覆膜保湿。18-22℃、光照强度120umol/m2s-1、光周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子。
1.3 突变体的筛选
拟南芥种子用0.5 %（v/ v）次氯酸钠加0.1%（v/ v）Tri-tonX-100表面消毒10分钟，再用无菌水冲洗3遍。接种前种子与0.4%（w/ v）低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化48小时，之后转入光照培养，培养皿垂直放置。培养箱温度22℃，连续光照，光强30umol/ m2s-1。
在确定的选择压力下，利用根弯曲方法对M2代进行筛选，将筛选得到的可能突变体再
转入含0.65%琼脂（W/V）的MS培养基中，根尖朝下培养一周左右；然后转入含有蛭石的营养土中培养，以收获M3代种子。M3代种子再进行上述低钾条件下的根弯曲试验。若某一株系的M3代幼苗仍表现耐低钾性状，则将其确定为耐低钾突变体。
2拟南芥突变体的遗传分析
M3 代突变体种子种于MS 盐培养基上, 幼苗生长5~ 6d后将其移栽于蛭石上，培养至开花，以野生型为父本，突变体为母本, 进行杂交, 得F1代。杂交试验操作程序为：（1）选择母本花。即在ros 植株主花轴顶端的花序中选择花瓣刚从花萼顶端露出的幼小的花, 小心剥去其花萼, 花瓣和雄蕊。
(2)选择父本花。选择完全开放的花, 花瓣与主花轴几乎垂直, 花药正处于释放花粉时期, 其表面呈颗粒状。
(3)授粉。用镊子从父本植株取下花药, 授粉到准备好的母本植株柱头上, 授粉3~ 7 d 后, 如果杂交成功的话, 肉眼即可看到角果生成, 而杂交不成功的柱头因未授粉而萎蔫。
(4)统计结果。将F1 种子种于MS 培养基上, 生长5~ 6采用根弯曲法检测植株对H2O2 抗性表现, 统计结果用于遗传分析。
(5)结果分析
选ros突变株进行自交和杂交, 检测F1和F2对H2O2 抗性。结果发现, 杂交成功的F1 用10- 4 mol/ L 的H2O2 处理幼苗, 全部不抗H2O2, 即根的生长受到抑制。而在F2 代, 不抗与抗呈现3B1 的比例分离。突变体发生了隐性单基因突变。
3拟南芥的群体遗传变异研究
拟南芥是一种自花授粉物种，在自然界存在的大多数为自交系。且几乎都是纯合子，拟南芥的群体遗传变异已被广泛研究。它的表型和分子特征可以从种子开始分析，包括形态特征、同工酶标记位点( isozymemarkers) 、微卫星(microsatellites) 、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 、切割扩增多型性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS) 标记, 扩增片段长度多态性(Amplication Fragment Length Polymorphism Analysis, AFLP) 标记和大规模DNA测序。而多数研究集中在单拷贝核序列的多态现象。此外，拟南芥重复序列和基因家族也已被分析。包括线粒体
DNA(mtDNA) 、着丝点重复序列和转座子。从所有的研究中可以得知，由于是自花授粉
植物，拟南芥的群体多态性是有限的。不过，利用AFLP、CAPS 和微卫星等基因组标记，在拟南芥中也发现了较高程度的多态现象。拟南芥中至少25 个基因已被系统地测序并在不同种类间加以比对，其数量仍在快速地增加，这些基因主要包括花序形成和分生组织发育相关基因、抗性基因和编码代谢相关酶的基因。测序显示，不同基因的核苷酸多样性范围从ATTI1 的0.0006到CLV2 的0.0558。平均多样性为0.006。从分析拟南芥12 个物种606条序列标签位点( Sequence Tagged Sites, STS) 的结果估计变异的相似度，它们与Col 野生型拟南芥序列的平均差异度是0.68%。由于二种不同群体的杂合，拟南芥基因序列具有二态性的特点。然而，在全基因组中的等位基因似乎没有二态性，其原因也许是自然选择的结果，也可能与自花授粉有关。
4拟南芥自发突变体的表型研究
在不同环境下生长的拟南芥，其形态学和生理学特征上的变异表型可作为拟南芥不同品种的鉴定依据之一。突变表型性状包括几个方面，如花形态、叶形态、分枝等。自发突变也会改变拟南芥生长过程中的一些生理特征，如种子休眠、生理周期、氮利用率等。此外，不同自发突变体中某些生化物质含量不同。如硫代葡萄糖苷( glucosinolates) 、肌醇六磷酸.磷酸盐、代谢酶活性等。拟南芥自发突变可以抵制外界许多不良生物因子。如细菌、真菌、病毒，昆虫和哺乳动物。抗病基因变异数目巨大，包括多种病原体和称之为NBS- LRR( nucleotide binding site plus leucine- rich repeat)核苷酸结合位点和富亮氨酸重复的胞内受体蛋白的约200 种植物抗病基因中一大类。拟南芥自发突变也被用来抵制非生物因子。如冻害、干旱、紫外辐射、盐害、金属毒害等。对于拟南芥自发突变的表型，一般有两个研究过程。通过分析自发突变，确定单个基因的功能，从根本上说，自发突变体表型取决于其野生型基因，而基因互作使一些表型只在某种遗传基因的背景上出现。因此通过自发突变表型确定基因功能非常有限。其次，通过分析拟南芥自发突变表型，进一步了解生态和进化方面的发展前景，从突变的表型和分子机理可确定特定环境下哪
些等位基因发生了改变。拟南芥在花期、萌芽期、逆境中的某些特性。反映其对特定环境的适应能力，具有重要的生态学意义。
5拟南芥人工突变体库的构建
拟南芥人工突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容。基于正向反向遗传学理论的插入敲除突变技术。为此提供了强有力的手段，要获得随机插入突变体主要有两种方法: T- DNA 法和转座子法。T- DNA 插入能有效地产生大量候选基因突变体，这种人工突变体可以用于分析一个QTL 中几乎所有基因敲除后的表型。通过T- DNA 转基因拟南芥植株T2 代的遗传分析，可从中鉴定出一批能引起重要表型变异的基因。目前，一些用于拟南芥基因鉴定和功能研究的大规模突变体库，如SALK、SAIL 等已经公开释放。玉米转座子Ac 和Ds 作为双元标签系统在拟南芥突变体库的构建中也被广泛应用，1999 年开始，建立了大规模含独立转座系的拟南芥Ds 元件插入突变体库。至今为止，拟南芥Ds 元件插入突变体库的种类和数量仍在不断增加。如最近建立了17668 个Ds 起始位点转座突变体库。
除此之外，利用基因陷阱( gene trap) 包括增强子陷阱，启动子陷阱和基因陷阱、RNA 干涉以及EMS 诱导等方法也建立了一些突变体库。
人工突变体库可用于大规模筛选鉴定功能缺失性和功能获得性突变体。如硝酸还原酶缺失等突变体的筛选，极大的促进了高等植物基础理论的研究。这一技术体系也用于水稻与油菜等重要农作物重要农艺性状基因的大规模鉴定上。
6拟南芥突变体的基因功能分析
6. 1 QTL 图谱分析
研究突变体首先需要对突变基因进行数量性状位点(QTL) 分析：其次，可利用高通量遗传学结合功能基因组学的策略。来识别特定基因及QTL 中的核苷酸多态性。由于受多基因控制及环境影响，多数变异存在数量效应，不同物种的分离群体表型经常呈连续变异分布。从一棵植物单一表型不能直接得知相关位点上的等位基因，但它能间接从连锁标记位点推论出。通过
群体实验，估计每个QTL 的数目及其在基因组中位置，并制作QTL 图谱。需要下列各项步骤：( a) 建立图谱种群：( b) 确定标记基因和某一表型：( c) 表型和基因多态标记之间的连锁分析，可利用网上软( http: https://www.doczj.com/doc/aa784809.html,.qtsoftware.html) 。QTL 图谱完成后，控制性状变异遗传基因的位点和数量、相对加性效应、不同位点基因间互作( 上位性) 、每个QTL 作用方式( 位置效应) 都可以被计算出来。绘制拟南芥QTL 图谱可利用经典的群体，如重组自交系RILs( recombinant inbred lines, RILs) 、导入系( introgression lines, ILs) 、近等基因系( near isogenic lines, NILs) 、回交系( backcross inbred lines, BILs) 等。这些群体是纯合的，但拷贝数、环境因素、QTL 数目都会影响表型值，拟南芥DNA 的平均遗传距离为1.2 到12Mb。包含了240 到2400 个预测的开放阅读框(ORFs) 。至今为止，拟南芥QTL 图谱中已确定了花期、肌醇六磷酸含量、抗虫性和硫代葡萄糖苷含量等QTL 基因。单核苷酸多态性( SNPs) 是指DNA 序列上的单个碱基变异。它具有分布广、多态信息量大、易于检测和统计分析等优点。能较好用于基因图谱构建和数量性状QTL 定位研究，拟南芥中可以利用微卫星、AFLP 标记或其它技术寻找SNPs, 用于QTL 图谱的构建. 拟南芥序列多态性有关数据可从网站中获得: http:
https://www.doczj.com/doc/aa784809.html,, 这些数据同时也促进了高通量的微卫星、基因缺失、SNP 等技术的发展。
6. 2QTN( Quantitative Trait Nucleotide ) 分析
QTL 图谱谱制作完成后的主要挑战在于找到突变的分子机制。包括确定突变的基因和核苷酸多态性，即QTN 分析.突变体克隆QTL 位点的方法，是利用重要位点高密度的分子标记，分析连锁重组后大量的分离子代。其原理类似于图位克隆。植物中只有有限几个QTL被克隆，而拟南芥由于遗传效率高及资源丰富等优点已被广泛研究。QTN分析主要通过两个步骤：首先，选择候选基因，通过人工诱导产生特定表型的突变体。随着T- DNA方法的改进和转化效率的提高，目前已经获得了拟南芥T- DNA 插入的突变群体库。可以从中筛选某一已知序列的基因突变。
其次，通过转基因实验证实是否QTL 基因.转基因后，植物显示出预期的QTL 表型效应，
再通过测序，便可得知该QTL 的DNA 序列多态性。然而，要获得精确的QTL 核苷酸序列则需要更进一步的研究。至今为止，拟南芥中已经确定约有15 种自发变异基因。其中大部分与花期、细菌昆虫病原体等性状有关，并编码光感器、转录因子、R-基因家族、硫代葡萄糖苷合成等基因蛋白。已报道了一些具突变表型的核苷酸多态现象。包括单核苷酸多态，如CRY2 和PHYA 基因中的单个氨基酸替换FRI和PHYD基因中的缩减蛋白( truncatedproteins) RPM1、MAM1 和MAM2 中的大规模跨基因缺失：FLC 中的非编码调节区域的转座子插入。
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HY5‐215 The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and?hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995. In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processing In hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an a HY5‐215的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点PsiI，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。 Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0 (https://www.doczj.com/doc/aa784809.html,/dcaps/dcaps.html)
HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8 PsiI: 但是，实验室并没有PsiI ，所以只能再去寻找新的内切酶。在设计的引物有2 个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI 将野生型切断。 HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8 AluI:
t-DNA插入突变体的鉴定 实验时间：2012年5月18日 摘要T i质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。本实验即检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。 1.引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。若将Ti质粒进行改造，把感兴趣的基因放进T-DNA序列中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA 扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA 插入突变纯和体。 PCR（Polymerase Chain Reaction）， 即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术， 具有特异、敏感、产率高、快速、简便、 重复性好、易自动化等突出优点；能在一 个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万 倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本 原理如右图） DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer （本实验中为TAE）中带负电, 在电场中
培养基 MS培养基 (Sigma公司) B5培养基 (pH 5.5) Content mg/L Content mg/L Content mg/L KNO3 2500 ZnSO47H2O 2.0 Nicoti nic 1 CaCl22H2O 150 H3BO3 3.0 Thiami ne HCl 10 MgSO47H2O 250 KI 0.75 Pyri ndox ine 1 NaH2PO4'H2O 150 Na2MoO42H2O 0.25 m-I no sitol 100 FeSC47H2O 27.8 CoCl26H2O 0.025 Glyci ne 200 MnSO4H2O 10 Na2EDTA 37.3 Ki netin 0.1 CuSO45H2O 0.025 IAA 0.1-1 改良的1/4 Hoagland 培养液(mM, pH6.0): Content mM Content mM KNO3 1.25 Zn SO40.002 Ca(NO3)2 1.50 H3BO3 0.050 MgSO40.75 KCl 0.050 KH2PO4 0.5 (NH4)6Mo7°24 0.075 FeSq 0.072 CuSO40.0015 Na2EDTA 0.072 Na2SiO30.1 2植物材料的常规种植 拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌 o 发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 C，16/8 h的光照培养间中生长。 3拟南芥种子的表面灭菌处理 1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天
2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟 3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。 4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。 5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。 6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。 7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。 4植物材料的水培体系 拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/ 皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。 水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagla nd培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换 一次培养液。 5拟南芥T-DNAS入突变体的筛选方法 到网站输入salk号设计引物LP、RP T-DNA LB : LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LP + RP, BP+ RP扩增基因组DNA 方法: 1）将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭石中，待长至抽苔期准备DNA的提取。 2） DNA提取缓冲液的配制： Genome\ /Flankira SaaiifincfiL Pa N pZme Exl5Ext3pZcne EPa w
最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！ Step 1. 打开NCBI主页：https://www.doczj.com/doc/aa784809.html,/ 打开的页面如下： 如下 得到如下页面：
进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图： 记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：https://www.doczj.com/doc/aa784809.html,/ 点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：
显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：
项目编号 东北农业大学大学生科技创新基金 申请书 项目名称：拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定 项目主持人：李松 所在学院：生命科学学院 研究起止时间：2008年11月1日至2009年11月1日 东北农业大学教务处制
项目名称 拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定 研究起止时间2008.11~2009.11 申请金额1000元 项目主持人 姓名李松学号A09060068所在学院生命科学学院所学专业生物技术学生类别二年级年级班级生物技术 指导教师 （1） 姓名才华职称讲师 所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程 指导教师 （2） 姓名纪巍职称助教 所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程 项目组成员姓名刘维学号A0960072 专业班级生技062 姓名肖松学号A09060086 专业班级生技062 姓名王鹏姬学号A09060080 专业班级生技062 姓名卢清瑶学号A09060073 专业班级生技062
一、项研究的目的意义、国内外研究概况、主要创新之处 1．研究的目的意义 基因功能的主要研究方法包括：(1)克隆相关基因，进行异体超表达研究(Meyer 等2000，2004；Schulze等2003); (2)利用T-DNA插入突变技术，获得目的基因敲出突变体(Bouche 和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)，再通过筛选出的纯合突变体，研究目的基因的功能(Meyer等2004)。与前者相比，后者具有许多优势(Meyer 等2004)，已成为反向遗传学研究的主要手段(Bouche和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)。 bZIP类转录因子普遍存在于动植物及微生物中，是植物中一类很大的转录因子家族，在拟南芥中就有75个家族成员，在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中起到重要的作用。本研究利用已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。本研究可为利用突变体进行功能互补研究AtbZIP1基因的功能提供突变体材料，进而为研究AtbZIP1转录因子在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中所起的作用奠定基础。 2．国内外研究概况 1)突变体鉴定的方法的研究现状 反向遗传学研究的首要条件是获得大量基因敲除突变体，建立一套快速、可靠的T-DNA插入突变体鉴定方法对其进行鉴定很重要。目前，鉴定方法主要有2种(https://www.doczj.com/doc/aa784809.html,/tdnaprimers.html): “三引物法”和“双引物法”。 “三引物法”的原理如图1 所示，即采用三引物(LP、RP、LB)进行PCR 扩增。野生型植株(wild type, WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR 产物仅有1 种，分子量即从LP到RP的大小; 纯合突变体植株(homozygous lines, HM)目的基因的两条染色体上均发生T-DNA 插入，而T-DNA 本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP (或RP)为引物进行扩增的产物，分子量即从LP 或RP 到T-DNA 插入位点的片段的长度再加上从LB 到T-DNA载体左边界的片段的长度;杂合突变体植株(heterozygous lines, HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA 插入，所以PCR 扩增后可同时得到
本科生文献综述题目拟南芥突变体的筛选综述 系别林学与园艺学院 班级园艺102班 姓名唐辉 学号103231228 答辩时间年月
新疆农业大学林园学院 拟南芥突变体的筛选综述 唐辉指导老师：王燕凌 摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试 验。在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na 2SeO 3 、钾、硒、NaCl等化合物或者化学 元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及拟南芥突变体在抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐等逆境环境中生长研究方面的观点。总结了拟南芥突变体在先如今人们研究中常用的几种筛选方法，指出了拟南芥突变体筛选的研究需求，并提出筛选拟南芥抗逆突变体的重要意义。 关键词：拟南芥；突变体；筛选；研究 Screening Summary of Arabidopsis Mutants Tang Hui Instructor:Wang Yanling Abstract: This paper summarizes the Arabidopsis drought, oxidation resistance, low potassium, selenium-resistant, salt, late-flowering mutants creening research.And detailed exposition of the various materials and processes Arabidopsis mutants creening methods needed in the screening process.In the anti-oxidation, anti-potassium, selenium resistance will be used Na2SeO3, potassium, selenium, NaCl chemical elements or compounds such mutations affect thegrowth and development of the body to be screened Arabidopsis thaliana mutants.Thus summarizes the growth of Arabidopsis mutants mannitol and simulated drought in Arabidopsis mutants in anti-oxidation, anti-potassium,selenium resistance point of view, salt and other adverse environments grow research.Arabidopsis mutants summarized earlier research that people now commonly used inseveral screening methods, pointed out the Arabidopsis mutant screening research needs and the importance of screening
溶液配制 1、纤维素酶解液：
2、PEG4000溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
3、W5 溶液 4、MM G溶液
5、WI溶液 拟南芥原生质体制备转化方法整理 一、土培室播种种植的拟南芥。 二、生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 三、剪取中部生长良好的叶片用刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。 四、将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
五、用真空泵于黑暗中抽30分钟。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 六、在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少3个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量W5溶液） 七、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。 八、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。 九、先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 十、用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体。 十一、在冰上静至原生质体30分钟。 以下操作在室温23℃下进行
十二、100g离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。 十三、加入10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）至2ml离心管中。 十四、加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。 十五、加入110 ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。 十六、诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 十七、室温下用400-440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 十八、室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
1 培养基 MS培养基（Sigma公司） B5培养基（pH 5.5） 改良的1/4 Hoagland 培养液（mM, pH6.0）： 2 植物材料的常规种植 拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌 发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 o C， 16/8 h的光照培养间中生长。 3 拟南芥种子的表面灭菌处理 1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天。
2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟。 3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。 4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。 5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。 6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。 7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。 4 植物材料的水培体系 拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。 水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagland培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换一次培养液。 5 拟南芥T-DNA插入突变体的筛选方法 到网站https://www.doczj.com/doc/aa784809.html,/tdnaprimers.html输入salk号设计引物LP、RP T-DNA LB：LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LP＋RP，BP＋RP扩增基因组DNA。 方法： 1)将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 姓名：余振洋；班级：09级生技1班；学号：200900140156 时间：2011/11/5 一．选题背景及意义 水资源短缺是目前公认的全球性环境焦点问题之一，我国人均占有水资源量(2300m )仅为世界人均量的1／4，是世界上13个最贫水国家之一，且大部分地区属亚洲季风区，干旱灾害具有普遍性、区域性、季节性和持续性的特点，旱灾十分严重。据1950～1999年统计，全国平均每年受旱面积达2173．33万hm2，成灾面积893．33万hm2，直接减收粮食100亿kg以上，约占各种自然灾害造成粮食损失的60％。干旱不仅造成农业的重大损失，还加剧了生态环境的恶化及土地沙漠化和水土流失，因此，干旱缺水已成为制约我国国民经济可持续发展及西部大开发的重要因素，且在一些地区已威胁到人类生存和发展。 随着分子生物学的迅速发展和应用，农业已成为生物技术应用的第二重大领域，基因工程技术将引发一场新的农业技术革命，使作物在干旱和贫瘠的土地上生长出高新品种，使人类在提高作物抗逆能力的基础上改善其品质和提高产量。因此，作物抗旱分子机制的研究具有重大的理论和实践意义，只有对植物抗旱分子机制彻底地了解后，才有可能为提高作物对干旱的抵抗能力提供理论依据。近年来该领域的研究已引起国内外学者广泛的兴趣和重视，在拟南芥、水稻、小麦等许多植物克隆了干旱胁迫应答基因，并对其表达调控和编码蛋白的功能进行了研究。本文简介了近年来该方面研究进展，为加快抗逆基固工程的研究，培育高品质的抗逆作物提供理论依据。 二．研究方案 1．相关文献： 海藻糖是细胞渗透调节时产生的重要相溶性物质之一，海藻糖一6一磷酸合成酶基因家族(Tre—halose-6一phosphatesynthase，TPS)是从拟南芥、复苏植物Selaginell lipidophylla等真核生物中分离得到的海藻糖合成酶基因。 ——＜A Review on Plant Drought and Salt Tolerance Gene＞，ZENG Hua—zong，LUO Li-jun，Shanghai Agrobiological Gene Center，Shanghai 201 1 06 2．实验材料： 1）海藻糖合成酶基因编号：A T1G16980 2）野生型拟南芥； 3）具抗旱性质基因的T-DNA插入突变种子：SALK_010881.55.00.x LP（左引物）：TTTGGCTTCTTGACAAGCAAC Len 21 TM 60.41 GC 42.86 SELF_ANY_COMPL 0.52 3'_COMPL 0.00 RP（右引物）：CTTGCAGCTGATTTACTTGGG Len 21 TM 59.89 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.52 3'_COMPL 0.00 4）器材：离心机，离心管，PCR仪，点泳池，电泳现象仪
拟南芥原生质体的提取和转化 (1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于 20ml双蒸水中）；共需叶片约90片； (2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时； (3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃， 60g，离心15min； (4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min； (5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min； (6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬； 以下操作均在23℃下进行： (7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪 去前端）轻柔混匀； (8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min； (9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5； (10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀； (11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。 (1)酶解液： cellulose R10 15% Macerozyme R10 0.3% Mannitol 1.09g KCl 0.3M MES 0.3M 调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液 CaCl20.15M β-巯基乙醇0.75mM (2)PEG溶液（40%，v/v） PEG4000 1g 0.8M Mannitol 0.625ml 1M CaCl2 0.25m (3)W5溶液
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。 关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统 1.前言 拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。 2.实验 2.1实验目的 （1）提取植物基因组DNA的方法； （2）PCR操作方法； （3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。 2.2实验原理 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。 将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。 用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 “三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因 型的植株。此法的有点事可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。 “双引物法”的基本原理与“三引物法”相似，即采用特异引物扩增目的基因片段和T-DNA插入片段，通过比对扩增结果进行突变体的鉴定。具体方法图2所示：首先以基因组 DNA为模版，用一对特意产物（LP和RP）扩增目的基因片段，初步鉴定出纯合突变体（图
一、拟南芥的一般生物学特性 1. 形态学描述 拟南芥（Arabidopsis thaliana）为十字花科拟南芥属。一年生细弱草本植物（图21-1 A）。 株高15至30厘米，随生长环境或培养条件变化。基生叶多数，长圆形或椭圆形，呈莲座状排列。茎生叶具短柄或无柄。总状花序顶生，花瓣白色；雄蕊6枚，花药黄色；雌蕊圆柱状。长角果线形，长约10至16毫米，成熟时开裂。种子呈卵形，长约1毫米，成熟时红褐色。有关拟南芥的各种形态特征、形态发生及个体发育的过程等在许多文献中已有很详尽的描述，为研究人员利用拟南芥为实验材料提供了很好的基础和方便。 2. 个体小、易于栽培管理 与其它大多数高等植物相比，拟南芥的个体较小。成熟个体株高在15至30厘米之间。 由于个体小，很容易在面积有限的温室或人工气候室内大批量地种植。特别是对于一些有特殊要求的研究工作，甚至可以在培养器皿中完成生活史（如有时需要在无菌条件下进行培养等）。而且，拟南芥对生长条件的要求并不十分严格，这一特点使得在实验工作中很容易实现拟南芥的栽培管理。 3. 生长周期较短 在一般的温室或人工气候室条件下，从拟南芥种子的春化至第一批角果成熟大约需8周左右时间。当然，也可以通过改变生长条件以达到使拟南芥提前或推后开花结实的目的。如延长每天的光照时间，可使拟南芥明显地提前开花结实，利用每天接近24小时的光照条件培养，甚至在6周左右即可收获第一批成熟角果。拟南芥的这一特性使实验工作周期大大缩短，特别是对于许多遗传分析工作，比利用一般的高等植物材料（如麦类、豆类作物）可以成倍地节约时间。 二、拟南芥的普通遗传学特性 1. 既可自交、又可人工杂交 在自然条件下，拟南芥是典型的自交繁殖植物，这使得拟南芥在种植繁种过程中得以保持其遗传上的稳定性。同时在实验过程中，根据研究目的又可方便地实施人工杂交，使得遗传分析工作很容易完成。 2. 种子结实量大 虽然拟南芥植物个体较小，但其种子结实量非常之大。一个角果可结实数十至上百粒种子；在生长良好的情况下，单株结实量可达上万粒之多！这使得很容易进行后代的遗传分析工作，也很容易扩增所需突变体的种子库。 3. 容易被诱变产生所需突变体 拟南芥在正常条件下通过自交产生后代，在遗传上表现出较高的稳定性。但拟南芥在特殊条件处理后较易发生突变，如利用物理的（如辐射处理）、化学的（如EMS处理）、及遗传转化（如T-DNA插入）等方法进行人工诱变处理，可获得具有各种不同表型性状的突变体。利用这些人工诱变方法产生的突变是随机的，可进一步通过对突变体库的有目的筛选而获得所需的突变体。 4. 染色体结构 通过对细胞周期的中期（metaphase）染色体观察，可以清晰地辨认单倍体拟南芥有5条染色单体（2倍体为10条染色体）。对拟南芥遗传图谱的连锁关系分析，也证实了单倍体拟南芥包含5个遗传连锁群。除去着丝粒、端粒等区域及一些重复序列，目前已经完成测序的第一条至第五条染色体的DNA序列长度依次为29.1 Mb、19.6 Mb、23.2 Mb、 17.5 Mb、26.0 Mb（总长为115.4 Mb），而包括所有序列在内的拟南芥单倍体基因组总 长约为125 Mb（注：此数据为2000年12月14日《自然》杂志公布的数据，随着拟南
拟南芥原生质体制备转化操作流程 主要试剂 1. 纤维素酶解液： 试剂 15ml酶液体系 1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉 2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉 3．0.4M mannitol1.09g干粉 4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液 5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液 6．加入10ml 水 7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2 9．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存） 11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。 2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量） PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g 0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml 1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml 约1.2ml 3. W5 溶液（1000ml） 154mM NaCl, NaCl9g 125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g 5mM KCl, KCl0.37g 2mM MES（PH 5.7），MES0.39g pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 4. MMG溶液 MaMg溶液（500ml） 15mM MgCl2，MgCl0.71g 4 mM MES(PH5.7)MES0.39g 0.4 M mannitol，Mannitol36.5g 用KOH调pH 5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。 5. WI溶液 WI(200ml) 0.5M mannitol，mannitol18.217g 4mM MES,pH5.7，MES0.156g
Step 1. 打开NCBI主页： 打开的页面如下： 如下 得到如下页面： 进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：
记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因 接下来开始查找 APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。 但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法 它的搜索界面一目了然,使用也很方便。 下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：点击 T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：
显示如下，所有信息全在如下窗口中 从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：
我们主要是从 ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。祝实验顺利！
采用PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达法。具体方法如下： 1）在MS培养基上用无菌牙签点种拟南芥种子，萌发后待根长至1-3厘米（2周左右），移栽到营养土:蛭石为1:1的培养土中，置于培养箱，温度22℃，光照16h，湿度70%，培养2-3周； 2）配制酶解液，选10ml酶解体系，置于90mm培养皿中； 3）在长势良好且未抽薹的拟南芥植株上选取鲜嫩叶片10-15片，用洁净的手术刀在培养皿的盖子上将叶片切成1mm宽的细条； 4）将切好的细条均匀铺在含酶解液的培养皿中，可以一边切一边从植株上取； 5）将酶解液和细叶条真空抽滤30 min； 6）将培养皿取出，静置在黑暗中，23℃，酶解3小时； 7）酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于2.0 ml离心管中，常温，100 g离心1 min； 8）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，4℃，100 g，离心1min； 9）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，冰上放置30min； 10）23℃，100 g，离心1min，弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬（本步骤及以下操作均在23℃）； 11）取约10-20ug质粒于2.0 ml EP管中，加100ul 制备好的原生质体，用剪去前端的200ul 枪头轻柔混匀； 12）加入110ul PEG/Ca溶液，轻柔混匀，23℃静置5-30min； 13）加入800 ul W5 溶液，轻柔的颠倒混匀，23℃，100 g，离心1min； 14）弃上清，加100ul W5，混匀，再次再加100ul W5，混匀； 15）上述混合液体置于恒温加热器中，23℃，避光，孵育6-18小时。 16）荧光观察，观察之前轻柔混匀，吸取观察物所用的枪头必须剪去前端。
拟南芥原生质体制备 制备酶解液10 ml 1．取幼嫩拟南芥叶片，使用新的单面刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。 （用胶带把下表皮沾掉，效果更好。放一小培养皿里面降解） 2．材料侵入10 ml酶解液中，暗培养2 h-2.5 h，至原生质体完全从叶片上解离下来。 3．酶解结束后轻轻晃动溶液，镜检酶解结果。 4．使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml。（冰上） 5．100×g，4℃，离心2 min，收集原生质体。 6．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复三次）。（重悬时，先加入少些W5轻轻悬起原生质体，随后再轻轻加入剩W5） 7．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，冰浴30 min。 8．100×g离心2 min，收集原生质体，重悬原生质体于1/10体积Mamg中。（看细胞浓度而定） 9．取少量重悬原生质体镜检，其余用于转化或4℃保存一周内使用。 2.2.8 原生质体转化 1．在2 ml离心管中一次加入10 μl质粒DNA(10-20 μl，大小在5 Kb之内)，100 μl原生质体，充分混匀后加入110 μl PEG4000溶液。（3=1+2） 2．上述混合物室温放置10-30 min。 3．反应结束后加入440 μl W5液体培养基，充分混匀。 4．100×g离心2 min，收集原生质体，移除上清。 5．加入500 μl W5溶液培养基，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复一次,可以重复两次）。 6．重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中，在细胞培养板中，24℃黑暗培养。7．取黑暗培养18 h后的原生质体，加入荧光素底物，使用CCD照相成像保存。
拟南芥原生质体转化实验 每次做大反应（用于CO-IP）最多做8管，每管需3 ml 原生质体溶液，浓度为106 ，10 ml 酶液需要40片叶子。小反应用于用于做蛋白定位，每管需200 μl 原生质体溶液 叶片的选取：，取刚刚完全展开，叶面光滑，非凹凸不平的，最上面最中间的叶片，依次向下选取，取瘦长的，叶缘尖锐的叶片为佳。每四棵苗取8-10片叶子。 1．打开水浴锅，TM=55o C 2. 配40 ml酶解液(8种试剂) Cellulose R10 0.6 g 不要粘在管壁上 Macrozyme R10 0.16 g Mannitol(4 o C) 20 ml KCl 0.4 ml MES 4 ml 55 o C，10 min(严格，前边摇2-3次，待管壁不再粘有酶，溶液澄清就不用摇) 待酶液自然降至室温，加入0.4 mL CaCl2 母液以及15.2 mL DDW ，0.04 g BSA，放置于3．将0.4 M mannitol 滴至一次性培养皿上，将叶片切成细丝，一刀一刀断开切，忌来回蹭。4．23 o C酶解2 h (或3 h，放置时间较长的酶液)，40 rpm。收获前75 rpm，摇1 min。5．配PEG 100 ml用Mannitol(4 o C) PEG 4000 40 g DDW 30 ml Mannitol 25 ml CaCl2 10 ml 6．提前将BD 50 ml 离心管置于冰上，尼龙膜过滤收集原生质体，100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心 7．用5 ml 大枪头吸除酶液，原生质体多则把酶液吸净，少则留一点酶液，加入W5 10-20 ml （依量而定）洗涤。100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心 8．吸去上清，再加入W5 20 ml，轻摇离心管重悬原生质体。100 g，3min，23 o C，升速3，降速3离心。 9．加入3-9 ml Mmg重悬,使原生质体浓度达到106，冰上放置。 10．取50 ml离心管（大反应），每管加入120 μg 质粒/每一种，然后用枪吸打混匀，阴性对照加一种质粒，然后用水补齐使总体积一致，然后用枪吸打混匀。冰上放置。 11．50 ml离心管中加入3 ml 原生质体溶液，沿管壁缓慢加入，充分摇匀。 12．每次室温摇匀后随即每50 ml离心管加入3 ml PEG溶液，轻柔颠倒混匀，不要有PEG 溶液一点一点，而应是充分均匀的溶液。加完PEG后每管室温放置6 min。（PEG刚加入时要分层，否则转化效率不好）。
拟南芥突变体的相关研究 遗传学 摘要：本文列举了利用正向遗传法对拟南芥突变体的筛选、遗传群体的初步遗传群体及初步遗传图谱的构建和基因的图位克隆、遗传分析及相关基因的功能分析的流程，为拟南芥的研究提供更明确更清晰的思路。 关键词：拟南芥突变体；筛选；图位克隆；功能分析 1 拟南芥突变体的筛选 拟南芥是十字花科拟南芥属植物，近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥的另一优点是很容易被诱变，目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体，这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。这里拟南芥耐低钾突变体的筛选为例，介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。 1.1植物材料诱变 以拟南芥为材料，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒）野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml重蒸水，搅拌30分钟；在4℃，下放置12小时后，把种子转移到盛30ml100mmol/L 磷酸缓冲液（PH6.5）的100ml三角瓶中，加入0.2%（V / V）的甲基磺酸乙酯（EMS），封 口后放在水浴（25℃）振荡器上振荡12h。然后用50ml蒸馏水漂洗种子4次，每次15min。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。 1.2诱变植株培养 将经EMS诱变处理后的拟南芥种子（M1）播种于1/4Hoagland 营养液浸透的混有蛭石的营养土中，然后覆膜保湿。18-22℃、光照强度120umol/m2s-1、光周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子。 1.3 突变体的筛选 拟南芥种子用0.5 %（v/ v）次氯酸钠加0.1%（v/ v）Tri-tonX-100表面消毒10分钟，再用无菌水冲洗3遍。接种前种子与0.4%（w/ v）低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化48小时，之后转入光照培养，培养皿垂直放置。培养箱温度22℃，连续光照，光强30umol/ m2s-1。 在确定的选择压力下，利用根弯曲方法对M2代进行筛选，将筛选得到的可能突变体再