27 Blair H.T.et al.,Synaptic plasticity in the lateral amygdala:a cellar hypothesis of fear conditioning.Learning and Memory,2001;8:2272242 28 M iller R.R.,M atzel L.D.M em ory inv olves far m ore than’cons olida2 tion’.Nature Reviews neuroscience,2000;1:2142216
29 K im J.J.,Fanselow M.S.M odality2specific retrograde amnesia of fear.
Science,1992;256:6752677
30 Phillips,R.G.,LeD oux,J.E.Differential contribution of amygdala and hippocam pus to cued and contextual fear conditioning.Behav.Neu2 rosci.,1992;106:274285
31 Selden N.R.,Everitt B.J.,Jarrard L.E.,R obbins T.W.C om plemen2 tary roles for the amygdala and hippocam pus in aversive conditioning to explicit and contextual cues.Neuroscience,1991;42:335250
32 Abeliovich A.,Paylor R.,Chen C.,K im J.J.,W ehner M.,T onegawa S.PK Cg mutant m ice exhibit m ild deficits in spatial in spatial and con2 textual learning.Cell,1993;75:126327133 M aren S.,Aharonov G.,Fanselow M.S.Neurotoxic lesions of the dorsal hippocam pus and Pavlovian fear conditioning in rats.Behav.Brain Res.,1997;88:2612274
34 Frankland P.W.,Cestari V.,Filipkowski R.,M cD onald R.J.,S ilva A.
J.The hippocam pus is essential for contextual discrim ination but not for context recognition in m ice.Behav.Neurosci.,1998
Progress in the R eseach of LTP in H ippcampus Chen G uifen①,Lin Longnian②
①Graduate Student,②Associate Pro fessor,Life Science School,East Chi2 na Normal Univer sity,Shanghai200062
K ey w ord hippcam pus,long2term potentiation,LTP,ass ociative learning, mem ory contextual fear conditioning
糖化酶的研究进展及趋势3
武金霞 王 沛 李晓明 (河北大学生命科学学院)
3全国大学生“挑战杯”资助项目
关键词 糖化酶 酶洛力 多型性 结构基因
阐述了糖化酶的产生菌分布,不同菌株糖化酶的多型性,提高糖化酶酶活力水平的方法,糖化酶基因工程现状以及对糖化酶研究的未来趋势.
葡萄糖淀粉酶(G lucoamylase EC3.2.1.3)又称γ-淀粉酶,简称糖化酶(缩写G A或G),是最重要的工业酶制剂之一,它是一种外切型糖苷酶,从淀粉的非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键,切下一个个葡萄糖单元,并像β-淀粉酶一样,使水解下来的葡萄糖发生构型变化,形成β-D-葡萄糖.对于支链淀粉,当遇到分支点时,它也可以水解α-1,6糖苷键,由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖.糖化酶也能微弱水解α-1,3连接的碳链,它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖,因此被广泛地应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油、淀粉糖等工业中,是我国产量最大的酶制剂产品.
一、糖化酶多型性的研究
20世纪80年代,对于糖化酶的研究发展极快,主要集中于糖化酶菌株的分离及其纯化工作.长期研究证明,糖化酶广泛地分布在微生物中,主要存在于黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中,同时也存在于人的唾液、动物胰腺及细菌中.已报道的产糖化酶真菌微生物有23个属35个种;细菌有3属3种[1].
真菌产糖化酶组分多型性是常见的,Rhizopus nivenus 和Chalara paradoca[2,3]可分别产生5种和6种活性组分.陈冠军、罗贵民等人[4]采用硫酸铵分级沉淀,DEAE-纤维素离子交换层析、Sephadex G-150凝胶过滤等方法,从黑曲霉AS3.4309变异株B-11的发酵液中分离出三种电泳均一的糖化酶GⅠ、GⅡ、GⅢ,其相对分子质量分别为27000、53000和67000;等电点分别为3.38、3.59和3.52;分子含糖量分别为8.7%、18.3%和13.6%;最适温度均为70℃,实验结果证明,三种同工酶都由一条多肽链组成.相对分子质量小的GⅠ具有完整的催化部位结构,而GⅡ和GⅢ多于GⅠ的那部分肽段,则可能起着稳定活性部位和增强结合底物能力的作用.GⅢ比G Ⅱ多一个约含100个残基的肽段,这个肽段可能是GⅢ能被生淀粉吸附的原因所在.One等[5]利用固相Acarbose 柱从市售糖化酶(A.niger)中分离出六种活性组分,每种活性组分均可从可溶性淀粉中释放出单一的β-D-葡萄糖终产物.这六种组分的相对分子质量、沉降系数、化学组成、等电点、酶的动力学及其他性质上各异.但Y a2 suda[6]从Monascus sp.NO.3403中分离出两种组分,电泳和超离心结果证明有同质性、相对分子质量、碳氮含量、
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自然杂志 25卷3期科技进展
最适pH 、最适温度及Km 值都非常接近.管汉成、严自正、张树政[7]发现黑曲霉突变株T -21产生的葡萄糖淀粉酶也具有多型性,经凝胶电泳和酶活力显色得到5条以上具有淀粉酶活力的蛋白质带,并从中分离纯化出能被生淀粉吸附和水解生淀粉的G A Ⅰ和既不被生淀粉吸附又不水解生淀粉的G A Ⅱ.方善康和周凤臻[8]对黑曲霉S4的生淀粉糖化酶进行分离,分离出3个均为酸性糖蛋白的G Ⅰ、G Ⅱ和G Ⅲ.糖化酶的多型性可能由下述原因引起:一是基因调控、转录的方式不同;二是蛋白质合成的修饰作用不同,即结合糖量不同;三是在发酵过程中受到自身蛋白水解酶和糖苷酶的作用,由糖化酶的原始形式衍变成糖化酶的.此外培养基的成分和生长条件也对糖化酶组分多型性有影响.
二、提高糖化酶活力的研究
几十年来我国科研工作者为提高糖化酶的活力进行了不懈的努力,常规的物理及化学诱变的方法仍然是方便有效的途径.谷海先等
[9]
对黑曲霉AN -149菌进行
自然分离、紫外线和NTG 的复合诱变处理,得到了一株高产糖化酶的菌株WG-93,经30L 发酵罐试验,酶活力达29ku/ml (原糖化酶生产发酵水平为12ku/ml ).1993年,李俊刚等[10]对生淀粉糖化菌黑曲霉S -1原生质体采用(λ1=260nm ,λ2=266nm )能量为8m J 的激光直接照射,得到高酶活力的生淀粉糖化酶突变株,比出发株酶活力平均提高37.4%,最高突变株酶活力达到74.5
u/ml ,比出发株提高91%.1998年,李俊刚等[11]又以黑
曲霉523原生质体为对象,经激光、紫外线和亚硝基胍复合诱变,选育出生淀粉糖化酶高产突变株黑曲霉N L -3,其生淀粉酶活力为156u/ml.王海洪等[12]通过分离和筛选,得到一株分解小麦生淀粉能力较强的黑曲霉,其生
淀粉糖化酶活力为171.5u/g ,
α-淀粉酶活力为6.347u/g.DNA 重组技术发展以来,有人尝试将糖化酶基因克
隆到埃希大肠杆菌和酵母菌中,构建了糖化酶高产工程
菌.近几年来,罗进贤等人[13]将酵母T y 转座子的δ序列,黑曲霉糖化酶cDNA 及G 418抗性基因neo 重组进酵母整和型质粒Y iplac128获得含LEU2,neo 双标记基因,糖化酶cDNA 的高整和型表达载体Y I128D.17N ,转化
CRF18(Y I128D.17N )糖化酶基因在该菌株获得高效表
达,产物分泌到胞外.吴晓萍等人[14]将切除了5’端非编码区50碱基对片段的黑曲霉糖化酶G A ⅠcDNA 与大麦
α-淀粉酶基因重组进埃希大肠杆菌-酵母穿梭载体,构建重组表达质粒pM AG 11,转化酿酒酵母G RF18,获得含α-淀粉酶和糖化酶双基因的酵母工程菌G RF18
(pM AG 11),在酵母PGK 基因启动子和终止信号的调控
下,α-淀粉酶和糖化酶基因获得高效表达,99%的表达产物分泌至胞外.
三、糖化酶的基因的研究
对黑曲霉糖化酶基因的研究有了不断的进展,尤其是对其结构基因和调控序列.Boel 等[15]首先从黑曲霉的染色体文库中分离出糖化酶的基因,它含有五个内含子,而泡盛曲霉中含有四个内含子.两种微生物都分泌糖化酶G A Ⅰ、G A Ⅱ,两种酶都由单一基因编码,有相类似的氨基末端氨基酸序列,在一级结构和C -端序列长度上稍有不同.唐国敏等克隆了突变株T 21的糖化酶
cDNA ,并进行了测序[16],实现了糖化酶基因在酿酒酵母
中的表达[17],并将糖化酶基因整合到酿酒酵母的基因组内,实现稳定表达[18],克隆并测定了糖化酶基因启动子区的功能[19],该课题组[20]在1996年以PCR 合成的糖化酶高产菌株黑曲霉T 21糖化酶基因5’近端非编码区588
bp (Eco -BamHI )的序列为探针,从T 21染色体DNA 中克
隆到近2.0kb 的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针,从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T 21的诱变出发株)的染色体DNA 中克隆到1.5kb 的糖化酶基因5’端非编码区序列,并从该二序列的分析测定中得到,黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区被称为“核心启动
子”
(core prom oter )的T AT AAAT 框及G CAAT 框,分别在翻译起始点的-109bp 及-178bp 处,高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化.在1998年[21]又对糖化酶高产菌株A.niger T 21和原始菌株Aniger 3.795的glaA5’上游区的序列进行了分析,证明两者在1.5kb 的区域内有九个部位的碱基不同.构建了以T 21和3.795glaA 基因转录调控区及A.nidulans trpC 基因终止子为表达元件的
E.colihph 基因表达载体(pXH2和p G H1),用pXH2和
p G H1分别转化A.niger T 21,对两种转化子的Hm B 抗性
水平测定和S outhern 杂交分析显示,在转化子XH2C 和
G H1C 中,pXH2和p G H1以相同拷贝数(2拷贝串联)整
合到染色体DNA 的相同位置上,XH2C 的Hm B 抗性水平
(3000μg/ml )为G H1C (1500μg/ml )的2倍.诱变引起的
调控区序列改变使T 21黑曲霉糖化酶基因转录调控区的功能水平比3.795提高1倍.国内对糖化酶研究较多的还有关海山等人[22-24],主要研究不同真菌中糖化酶的基因克隆、表达和糖化酶的性质,在挖掘糖化酶资源方面做了大量工作.
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261?Ziran Zazhi V ol.25N o.3
科技进展
四、扩大糖化酶的应用研究
糖化酶是工业上应用最广泛的酶类之一.除了利用糖化酶水解淀粉为葡萄糖而用于制糖业外,现在人们越来越多地开发糖化酶的新型用途.糖化酶在酿酒工业中也有广泛的应用.传统白酒[24]生产用曲中的微生物是依靠自然界带入的,未经筛选,其糖化力较低,耐酸耐热性都较差.糖化酶作用的pH 范围为3.0～5.5,最适作用范围为4.0～4.5,这使得白酒酿造过程中酸度不断增加,适宜发酵.糖化酶的应用,使粮醅入酵后发酵升温快,升温幅度大,提高原料的出酒率,缩短发酵周期,降低生产成本.在食用醋[25]生产中,应用TH -AATY 和糖化酶,可以解决企业自制酒母质量不稳定和夏季高温等生产难题,使食用醋生产正常进行,它不仅降低了原材料的消耗,减轻了工人的劳动强度,而且显著提高了淀粉利用率和出醋率,得到较好的经济效益.固定化糖化酶应用于糖结晶过程,可以提高糖的出产率[26].今后糖化酶将会被应用于更为广阔的空间.
五、糖化酶研究的展望
虽然对糖化酶的研究已有多年,但是仍有许多问题尚待进一步探索[27].基础研究领域将主要集中在糖化酶的结构研究,如糖链在糖化酶活性、稳定性及构象状态中所起的作用,进一步阐明糖化酶的多型性原因及糖化酶的热稳定性机制.应用研究之一仍将是进一步提高糖化酶的活力,利用诱变、DNA 重组技术或其他方法获得优良菌株,提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平等,进一步优化糖化酶纯化工艺及保存条件;另一方面,诱变筛选耐热糖化酶产生菌或克隆耐热糖化酶基因,将是一个重要方向,因为耐热糖化酶在发酵业的应用将会大大降低能源消耗,从而降低生产成本,将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景.
(2002年10月20日收到)
武金霞 在职博士生,副教授,河北大学生命科学学院生物
技术系,071002
王 沛 河北大学生命科学学院2000级生物技术专业学生李晓明 河北大学生命科学学院2000级生物技术专业学生
1 陈启和,何国庆.糖化酶及其基因研究进展.微生物学杂志,
2000;20(4):462502 Saha C.,Ueda S.J.Ferment Technology ,1983;61:67272
3 Ishigam i H.,Hashim oto H.,K ainuma K.Starch Sci.,1985;32:19722054 陈冠军,罗贵民,程玉华.黑曲霉糖化酶的分离纯化及其性质.微
生物学报,1991;31(3):21322205 One K.,Shigeta S.,Oka S.Agric Biol Chem.,1988;52:168921696
6 Y asuda M.,K uwar M.,M atsushita H.Agric Biol Chem.,1989;53:2472
2567 管汉成,严自正,张树政.黑曲霉突变株分解生淀粉的葡萄糖淀
粉酶的提纯及其一般性质.生物化学与生物物理学报,1993;25(5):45324598 方善康,周凤臻.黑曲霉S4生淀粉糖化酶的分离纯化及其特性.
微生物学报,1993;33(2):10821149 谷海先,张定玲,曹钰.高活力糖化酶菌种选育及发酵研究.食
品与发酵工业,1998;24(5):3123610 李俊刚,方善康.激光诱变黑曲霉原生质体选育高酶活生淀粉糖
化菌的研究.微生物学通报,1993;20(4):213221511 李俊刚,方善康.生淀粉糖化菌N L 23的发酵条件.西南师范大学
学报(自然科学版),1998;23(1):9229612 王海洪,段学军.一株高产生淀粉糖化酶菌株的筛选与研究.中
国酿造,1999;(3):2422513 罗进贤,叶若邻,张添元等.用基因重组技术构建可降解淀粉和
产生酒精的酵母工程菌.食品与发酵工业,2000;26(5):12414 吴晓萍,李文清,罗进贤等.α2淀粉酶和糖化酶的表达及酿酒酵
母工程菌的构建.中山大学学报(自然科学版),1999;38(2):8028415 Boel E.,Hjort I.Norris F.EMBO J.,1984;3:158121589
16 T ang guom in ,et al.Expression and secretion of glucoamylase of as 2
pergillus niger in saccharomyces cerevisiae.Chinese J.o f Biotechnology ,1994;10(3):1632168
17 T ang G uom in ,Y ang K aiyu.Integration of glucoamylase gene from as 2
pergillus niger into saccharomyces cerevisiae genome and its stable ex 2pression.Chinese J.o f Biotechnology ,1995;11(4):2372242
18 T ang G uom in ,et al.Cloning and Funnction Determ ination of Prom oter
Region of glucoamylase gene from A.niger T 21.Chinese J.o f Biotech 2nology ,1996;12(2)19 钟丽婵,乔殿华,唐国敏等.黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化
酶基因调控区的克隆及其分析比较.微生物学报,1996;36(3):181218620 乔殿华,钟丽婵,唐国敏等.黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究.
微生物学报,1998;38(1):2623121 Zhao J.,Chen Y.H.,K wan H.S.M olecular cloning ,characterization ,
and differential expression of a glucoamylase gene from the edible mush 2room lentinula edodes.Applied and Environmental Microbiology ,2000;66:25312253522 Ng W.L.,Ng K.T.,K wan H.S.Developmental regulation of tw o hy 2
drophobins in lentinula edode.FEMS Microbiology Letter s ,2000;185:139214523 刘兴照.谈谈传统白酒生产中糖化酶的应用.中国酿造,1998;4:
2722924 王传荣.TH 2AADY 和糖化酶在食醋生产中的应用试验.中国酿
造,2001;111(1):2322425 柴宝华.固定化糖化酶在结晶糖中的应用.淮海轻工学院学报,
2000;9(1):6226426 杨依军,李多川,沈崇尧.葡萄糖淀粉酶研究进展.微生物学通
报,1996;23(5):3122315
Progress and T rend of G lucoamylase
Wu Jin 2xia ①,Wang Pei ②,Li X iao 2ming ③
①Master ,Ph.D.Candidate ,Sssociate Pro fessor ,Department o f Biotech 2
nology ,College o f Life Science ,H ebei Univer sity ,Baoding ,H ebei 071002
②③Undergraduate ,College o f Life science ,H ebei Univer sity ,Baoding ,
H ebei 071002
K ey w ords glucoamylase ,enzyme activity ,multitype ,structural gene
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361?自然杂志 25卷3期
科技进展
南阳理工学院 本科生毕业设计 学院（系）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生： ******* 指导教师：李慧星 完成日期 2010 年 5 月
南阳理工学院本科生毕业设计 年产5000吨糖化酶发酵车间设计 The design of annual output of 5000 tons of glucoamylase fermentation factory workshop 总计：毕业设计（论文）28页 表格： 5 个 插图： 1 幅
南阳理工学院本科毕业设计 年产5000吨糖化酶发酵车间设计 The design of annual output of 5000 tons of glucoamylase fermentation factory workshop 学院（系）：生物与化学工程学院 专业：生物工程 学生姓名：郭留洋 学号：***** 指导教师：****** 评阅教师： 完成日期：2010年5月 南阳理工学院 Nanyang Institute of Technology
年产5000吨糖化酶发酵车间的工艺设计 生物工程专业郭留洋 【摘要】糖化酶是工业生产的主要酶制剂之一，广泛用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面。本设计以玉米淀粉为主要原料，利用黑曲霉，采用机械搅拌通风罐进行发酵生产，完成生产5000吨糖化酶发酵车间工艺设计，通过工艺流程设计、工艺衡算、设备选型和车间布置设计，设计出生产5000吨糖化酶发酵车间采用3个75m3发酵罐和3个6m3种子罐等，并依据生物工程工厂车间布置原则，对发酵罐车间进行合理布置，绘制了工艺流程图和车间布置图，工艺设计的结果为糖化酶的生产提供一定参考。 【关键字】糖化酶工厂设计深层发酵黑曲霉
目录 第一章绪论 (1) 第二章罐体几何尺寸的确定 (2) 2.1夹套反应釜的总体结构 (2) 2.2 几何尺寸的确定 (2) 第三章罐体主要部件尺寸的设计计算 (5) 3.1 罐体 (5) 3.2 罐体壁厚 (5) 3.5人孔和视镜 (6) 3.6接口管 (6) 3.6.1 管道接口（采用法兰接口） (6) 3.6.2 仪表接口 (7) 第四章冷却装置设计 (8) 4.1 冷却方式 (8) 4.2 装液量 (8) 4.3 冷却水耗量 (9) 4.4 冷却面积 (9) 第五章搅拌器轴功率的计算 (10) 5.1不通气条件下的轴功率P0 (10) 5.2通气搅拌功率Pg的计算 (11) 5.3电机及变速装置选用 (11) 第六章结论 (13) 参考文献 (13)
第一章绪论 我设计的是一台30M3机械搅拌通风发酵罐,发酵生产糖化酶。 糖化酶，也称葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），主要用途是作为淀粉糖化剂。它与a-淀粉酶结合可将淀粉酶转化为葡萄糖，可供葡萄糖工业，酿酒工业和氨基酸工业等应用，是工业生产中最重要的酶类之一，也是我国产量最大的酶制剂产品。黑曲霉A.S.3.4309是国内糖化酶活性最高的菌株之一。 糖化酶生产菌重要的有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉，河枣曲霉，宇佐美曲霉，红曲霉，扣囊拟内孢霉，泡盛曲霉，头孢霉，甘薯曲霉，罗耳伏革菌。 综合温度、PH等因素选择黑曲霉A.S.3.4309菌株，该菌种最适发酵温度为32-34℃，pH为4.5，培养基为玉米粉2.5%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成。 主要生产工艺过程为如下：菌种用蔡式蔗糖斜面于32℃培养6天后，移植在以玉米粉2.5%,玉米浆2%.组成的一级种子培养基中，与32℃摇瓶培养24-36h，再接入（接种量1%）种子罐（培养基成分与摇瓶发酵相同），并与32℃通气培养搅拌24-36h，然后再接入（接种量5%-7%）发酵罐。发酵培养基由玉米粉2.5%,玉米浆2%，豆饼粉2%组成（先用a-淀粉酶液化），发酵温度为32℃，在合适的通气搅拌条件下发酵96小时酶活性可达6000u·ml-1 。 发酵液滤去菌体，如有影响糖化效率的葡萄糖甘转移酶存在，则通过调节滤液PH 等方法使其除去，再通过浓缩将酶调整到一定单位，并加入防腐剂（如苯甲酸）。如制备粉状糖化酶，则可通过盐析或加酒精使酶沉淀，沉淀经过压滤，滤泥再通过压条烘干，粉碎，即可制成商品酶粉。 发酵罐主要由罐体和冷却蛇管，以及搅拌装置，传动装置,轴封装置，人孔和其它的一些附件组成。这次设计就是要对20M3通风发酵罐的几何尺寸进行计算；考虑压力，温度，腐蚀因素，选择罐体材料，确定罐体外形、罐体和封头的壁厚；根据发酵微生物产生的发酵热、发酵罐的装液量、冷却方式等进行冷却装置的设计、计算；根据上面的一系列计算选择适合的搅拌装置，传动装置，和人孔等一些附件的确定,完成整个装备图，完成这次设计。 这次设计包括一套图样，主要是装配图，还有一份说明书。而绘制装配图是生物工程设备的机械设计核心内容，绘制装配图要有合理的选择基本視图，和各种表达方式，
纤维素酶的作用机理及进展的研究 摘要：纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，本文论述了纤维素酶的性质，重点介绍了纤维素酶的作用机理、应用及其研究进展，并对其研究前景做了展望。关键词：纤维素酶；纤维素；作用机理； 0引言 纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。 纤维素占植物干重的35%-50%[1],是世界上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。对人类而言，它又是自然界中最大的可再生物质。纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义[2]。 1 纤维素酶的性质 纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。纤维素酶是四级结构，,产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等。 纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制。纤维素与酶相互作用中，是酶被底物分子所吸附，然后进行酶解催化，酶的活性较低，仅为淀粉酶的1/100[3] 纤维素酶对底物分子的分解，必须先发生吸附作用。纤维素酶的吸附不仅与自身性质有关，也与底物密切相关，但纤维素酶的吸附机制总体并未弄清，仍需进一步研究[4]。 2 纤维素酶的作用原理 （1）、纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时，可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质有利于动物胃肠道的消化吸收。 （2）、纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌，补充内源酶的不足，并对内源酶进行调整，保证动物正常的消化吸收功能，起到防病，促生长的作用。 （3）、消除抗营养因子，促进生物健康生长。半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液，增加消化物的粘度，对内源酶造成障碍，而添加纤维素酶可降低粘度，增加内源酶的扩散，提高酶与养分接触面积，促进饲料的良好消化。 （4）、纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物，在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物，从而使消化道内的消化作用得以顺利进行。也就是说纤维素酶除直接降解纤维素，促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外，还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化。
糖化酶的固定化及其在葡萄糖生产中的应用工艺 姓名：吴启华 12生物工程1班学号：1214200027 指导老师：柯德森、姚焱；同组者：严少杰，李海毅；时间:2015/11/30---2015/12/14 摘要：利用有关固定化酶的理论和方法，研究固定化糖化酶的效率与糖化酶的浓度的关系。 本实验中测定固定化糖化酶偶联率、相对活力、活力回收来衡量其生产工艺的优劣，并探讨糖化酶的浓度对固定化效果及结合牢固程度的影响和验证固定化糖化酶催化生产葡萄糖的重复使用能力及其效率。制备固定化糖化酶的方法为离子吸附法，并且使用DNS法测定固定化酶的活力。结果显示：在该次实验中，固定化的效果较好；加入20g离子交换剂固定化酶的活力回收为79.1%，偶联率为90.46%，相对活力为82.58%，加入25g离子交换剂固定化酶的活力回收为85.2%，偶联率为92.76%，相对活力为92.54%。重复使用葡萄糖固定化酶的过程中，固定化酶的利用效率降低。酶与载体的浓度比例较高固定化酶葡萄糖生产效率高。 关键词：固定化，糖化酶，葡萄糖，酶活力 1、前言： 糖化酶也称葡萄糖淀粉酶（glucoamylase, EC.3.2.1.3）(淀粉-α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶)，它能够催化淀粉液化产物---糊精及低聚糖进一步水解成葡萄糖。糖化酶对底物的作用是由非还原端开始，将α-1，4-键和α-1，6键逐一水解，酶作用时糖苷键在C1-6间断裂，所产生的葡萄糖为 构型，几乎100%转变为葡萄糖。工业生产使用的糖化酶主要来自曲霉、根霉及拟内孢霉，它被广泛应用于酿酒、制糖等行业，是非常重要的酶制剂。 酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大致有三种：非共价结合法（结晶法、分散法、物理吸附法及离子结合法）；化学结合法（包括共价结合法及交联法）；包埋法（包括微囊法及网络法）。 本实验利用离子结合法制备固定化糖化酶。离子结合法就是酶通过离子键结合于具有离子交换基的不溶性载体的固定化方法，常用的载体有：葡聚糖凝胶、离子交换树脂、纤维素等。本实验以离子交换树脂为载体，应用离子交换结合法制备固定化酶，该法操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，酶的活性回收率高，可反复连续生产，对稀酶有浓缩作用，载体可再生使用。其缺点是：载体和酶的结合力弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在高离子强度下进行反应时，酶易从载体上脱落。使用共价结合法不会使酶容易脱落，国外研究者已研究出用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶，结果使酶活较高，并且能连续生产3个酶半衰期。在此次实验中还使用用DNS法测定固定化酶、残留酶、原酶的活力。 2、材料与方法： 2.1材料：（1）糖化酶液，GF-201大孔强碱阴离子交换剂，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基兰，酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁氰化钾，乙酸，乙酸钠(配制pH4.6
1.米曲霉是一种好气性真菌,菌丝一般呈黄绿色,米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 米曲霉在工业上的应用：用于发酵生产豆豉、豆酱；与黑曲霉、绿色木霉复合发酵用于酱油生产；用于饲料工业；用于酿酒制曲、生产低醇乳糖饮料。 2.葡萄糖淀粉酶又称γ一淀粉酶, 简称糖化酶，糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白,在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得,从细菌中也分离到热稳定的糖化酶, 人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶生产方法： a.黑曲霉固体发酵法 工艺流程:试管菌种→三角瓶款曲扩大培养→帘子曲种→通风制曲→成品。 b.液体深层发酵法. 工艺流程:试管斜面种子→种子扩大培养→发酵→过滤→浓缩→干燥→粗酶制剂。
糖化酶成品提取工艺 成品糖化酶可分为液体酶和固体酶2 种, 而固体酶的制备方法又可 分为盐析法、有机溶剂沉淀法和附吸法等, 采用一条合理的提取工艺, 可制备系列酶产品以满足不同行业的需求及降低成品的成本. 目前国外糖化酶生产一般采用液体深层培养, 发酵罐最大可达200m , 罐体都采用不锈钢制造, 冷却系统采用罐外冷却盘管关键阀门都采 用隔膜阀, 培养基可在罐内灭菌, 也可用薄板冷却器作连续灭菌, 并装有节能器, 发酵过程中的控制参数有搅拌功率、溶解氧、空气 中的二氧化碳与氧气量以及温度、P H 等。 糖化酶处理技术： 糖化酶的处理工艺过程分为预处理、固液分离、液体浓缩、酶的沉淀干燥四个工序。国外采用的无机絮凝剂有硫酸铝、碱式氯化铝、氯化铁、锌盐等能在水中形成各种氢氧化物凝胶;采用的有机高分子絮凝剂有聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸(或钠盐) 、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酞胺等。国内外最普遍采用的固液分离设备是板框压滤机, 除此以外, 国外还有管式、多室式、碟式及篮式离心机, 国内主要采用篮式离心机, 也有少数管式离心机的厂家。国内外糖化酶的浓缩方式已从蒸发浓缩发展到超滤浓缩。目前采用的超滤装置有搅拌室式、浅道式系统、套筒膜式和中空纤维。沉淀酶方式, 国内外仍普遍用硫酸钱或硫酸钠等中性盐类盐析糖化酶。 3.植酸提高米曲霉产糖化酶能力:
两种曲酶糖化性质的比较研究在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。 黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。 米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 1 材料与方法 1．1材料 菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-4 1．2培养基 种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液
糖化酶的研究进展 摘要：糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类,介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。 关键词: 糖化酶; 特性; 活力 一、糖化酶的简介 糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。 糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)](缩写GA或G), 糖化酶是一种习惯上的名称,学名为α-1,4-葡萄糖水解酶 (α-1,4-Glucanglucohydrolace). 糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。（深层发酵是利用深层培养基的厌氧环境来培养厌氧细菌，但不能培养严格厌氧细菌,多用于兼性厌氧菌和微耗氧菌的培养） 重要糖化酶生产菌有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉等。 糖化酶是具有外切酶活性的胞外酶。其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。 二、糖化酶的结构组成及分类 糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。
ＲｅｓｅａｒｃｈＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙ ｏｆＧｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ＺＨＯＮＧＨａｏ１，ＴＡＮＸｉｎｇ－ｈｅ１，ＸＩＯＮＧＸｉｎｇ－ｙａｏ２，ＳＵＸｉａｏ－ｊｕｎ２，ＨＵＹａ－ｐｉｎｇ１ （１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＬａｎｄｓｃａｐｅ，ＨｕｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ） 热点论坛 摘要：介绍了糖化酶产生菌株的分布、结构与多型性、作用机制、基因和固定化研究与处理及其 在食品生产中的应用现状，并对其未来发展趋势进行了展望。关键词：糖化酶；性质；基因；固定化；应用 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｅｓｔｒａｉｎｓｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｏｌｙｔｙｐｉｓｍ，ｅｎｚｙｍｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｇｅｎｅ，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｃｔｕａｌｉｔｙｉｎｆｏｏｄｉｎｄｕｓｔｒｙ，ａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｐｒｏｓｐｅｃｔｏｎｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅｗａｓｓｕｍｍａｒｉｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ；ｐｒｏｐｅｒｔｙ；ｇｅｎｅ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ 中图分类号：ＴＳ２０１．２＋５文献标识码：Ａ文章编号：１００９－６２２１（２００８）０３－０００１－０４ 基金项目：湖南省科技厅科技计划重点项目（２００６ＮＫ２００６）作者简介：钟 浩（１９８３—），男，汉族，湖南人，硕士，主要 从事生物能源开发利用研究工作． 糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶（ＧｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅＥＣ． ３．２．１．３．），又称为淀粉α－１，４葡萄糖苷酶、γ－淀粉 酶。因为在发酵行业中主要用作将淀粉转化为葡萄糖，所以习惯上被称为糖化酶，是一种单链的酸性糖苷水解酶，具有外切酶活性。我国古代利用酒曲酿酒就是用的糖化酶的原理。糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精、葡萄糖浆的主要酶类。特别是利用酿酒酵母进行淀粉原料发酵时，淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序，因为大多数酿酒酵母只能利用可发酵的糖。 现在糖化酶不仅用于酒类和酒精生产及制取葡萄糖浆，还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸 的生产。糖化酶是我国产量最大、应用范围最广的酶制剂。 １产糖化酶菌株分布 糖化酶广泛地存在于微生物中。已报道的产 糖化酶菌株中真菌有２３个属３５个种，它们分别是：雪白根霉（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｔｏｎｇｉｎｅｎｓｉｓ）、德氏根霉（Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ）、 河内根霉（Ｒ．ｔｏｎｋｅｎｉｓｉｓ）、爪哇根霉（Ｒ．ｊａ－ｖａｎｉｃ）、台湾根霉（Ｒ．ｆｏｒｍｏｓａｅｎｓｉｓ）、臭曲霉（Ａ．ｓｐｅ． ｒｇｆｌｌｕｓｆｏｅｔＪｄｕｓ）、 黑曲霉（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、海枣曲霉（Ａ．ｐｈｅｎｉ－ｃｉｓ）、 宇佐美曲霉（Ａ．ｕｓａｍｉｉ）、红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓｓｐ）、扣囊拟内孢霉或肋状拟内孢霉（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓｆｉｂｕ－ｌｉｇｅｒ）、 泡盛曲霉（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）等。某些细菌中也可以分离到热稳定的糖化酶， 如Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、 糖化酶研究进展及其在食品工业中 的应用 钟浩１，谭兴和１，熊兴耀２，苏小军２，胡亚平１ （１．湖南农业大学食品科技学院，长沙４１０１２８；２．湖南农业大学园林园艺学院，长沙４１０１２８） １
酶的固定化 固定化酶是酶工程的核心，利于实现酶的重复利用及产物与酶的分离。下面以酶的固定化方法为核心，介绍一些有关固定化技术的研究新进展。 1 吸附法 利用多种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定方法。该方法最显著的优点是操作简便，条件温和，不会引起酶的变异失活，且载体价廉易得，可反复使用。但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。 通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。 酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。纵伟、刘艳芳等(2008)以磁性壳聚糖微球作为新型载体，并采用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定了最优条件，同时比较了游离酶和固定化酶的pH值和热稳定性。结果表明，固定化的适宜条件为：加酶量600 U／g，温度5℃，pH 7．0，固定化时问2 h。固定化酶的pH值和热稳定性都优于游离酶，
固定化酶连续使用5次后，其相对酶活仍为使用前的57.8％，具有较好的操作稳定性。近年来，随着介孔分子筛制备技术的日臻成熟，人们正在考虑用其担当固定化酶的载体。与其他材料相比，介孔分子筛规则的孔道、大的比表面积、极强的吸附性能、稳定的结构等特点，使其具有担当固定化酶载体得天独厚的优势。 王炎等(2008)以介孔分子筛MCM一41作为载体，采用物理吸附法对漆酶进行了固定化，考察了时间、pH和给酶量对固定化效果的影响，并对固定化酶的活性及其稳定性进行了研究，讨论了影响固定化过程和固定化酶性质的主要原因。结果显示，在pH为3.0时，酶和载体比例为62.5 mg／g时吸附12 h固定化效果最好，固定化酶活性回收率为50％。与游离漆酶相比，MCM一41固定化漆酶的最适反应pH略有升高，最适温度没有变化，其pH稳定性和热稳定性都显著优于游离漆酶。固定化漆酶具有可重复操作的性质，与底物反应反复操作1O批次后剩余活性为4O％。 将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合 的固定化方法。该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可以得到较高活性的固定化酶。采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、淀粉酶、纤维素酶等。陈姗姗等(2008)以阴离子交换树脂为载体、戊二醛为交联剂，对果胶酶进行固定化分析，探讨了温度、pH值、时间、加酶量、戊二醛浓度、交联温度、交联时问对果胶酶固定化效果的影响，同时对固定化果胶酶的酶学特性进行研究。研究结果表明，果胶酶的最佳固定化条件为：温
1味精的生产工艺流程简介 味精的生产一般分为制糖、谷氨酸发酵、中和提取及精制 等4个主要工序。 1．1液化和糖化 因为大米涨价，目前大多数味精厂都使用淀粉作为原材 料。淀粉先要经过液化阶段。然后在与B一淀粉酶作用进入糖 化阶段。首先利用一淀粉酶将淀粉浆液化，降低淀粉粘度并 将其水解成糊精和低聚糖，应为淀粉中蛋白质的含量低于原来 的大米，所以经过液化的混合液可直接加入糖化酶进入糖化阶 段，而不用像以大米为原材料那样液化后需经过板筐压滤机滤 去大量蛋白质沉淀。液化过程中除了加淀粉酶还要加氯化钙， 整个液化时间约30min。一定温度下液化后的糊精及低聚糖在 糖化罐内进一步水解为葡萄糖。淀粉浆液化后，通过冷却器降 温至60℃进入糖化罐，加入糖化酶进行糖化。糖化温度控制在60℃左右，PH值4．5，糖化时间18-32h。糖化结束后，将糖化罐加热至80 85℃，灭酶30min。过滤得葡萄糖液，经过压滤 机后进行油水分离(一冷分离，二冷分离)，再经过滤后连续消 毒后进入发酵罐。 1．2谷氨酸发酵发酵 谷氨酸发酵过程消毒后的谷氨酸培养液在流量监控下进入谷氨酸发酵罐，经过罐内冷却蛇管将温度冷却至32℃，置入 菌种，氯化钾、硫酸锰、消泡剂及维生素等，通入消毒空气，经一
段时间适应后，发酵过程即开始缓慢进行。谷氨酸发酵是一个 复杂的微生物生长过程，谷氨酸菌摄取原料的营养，并通过体 内特定的酶进行复杂的生化反应。培养液中的反应物透过细胞 壁和细胞膜进入细胞体内，将反应物转化为谷氨酸产物。整个 发酵过程一般要经历3个时期，即适应期、对数增长期和衰亡期。每个时期对培养液浓度、温度、PH值及供风量都有不同的 要求。因此，在发酵过程中，必须为菌体的生长代谢提供适宜的生长环境。经过大约34小时的培养，当产酸、残糖、光密度等指标均达到一定要求时即可放罐。 1．3 谷氨酸提取与谷氨酸钠生产工艺 该过程在提取罐中进行。利用氨基酸两性的性质，谷氨酸 的等电点在为pH3．0处，谷氨酸在此酸碱度时溶解度最低，可经长时间的沉淀得到谷氨酸。粗得的官司谷氨酸经过于燥后分 装成袋保存。 1．4谷氨酸钠的精制 谷氨酸钠溶液经过活性碳脱色及离子交换柱除去C a 、 Mg 、F e 离子，即可得到高纯度的谷氨酸钠溶液。将纯净的 谷氨酸钠溶液导入结晶罐，进行减压蒸发，当波美度达到295 时放入晶种，进入育晶阶段，根据结晶罐内溶液的饱和度和结 晶情况实时控制谷氨酸钠溶液输入量及进水量。经过十几小时 的蒸发结晶，当结晶形体达到一定要求、物料积累到80％高度时，将料液放至助晶槽，结晶长成后分离出味精，送去干燥和筛
大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在 酿酒酵母中的表达和分泌 3罗进贤 李政海 李文清 (中山大学生物化学系及生物工程中心,广州510275) 摘要 将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA 重组进同一大肠杆菌2酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体pMA G 15.用原生质体转化法将pMA G 15引入酿酒酵母(S.cerevisiae GRF18),在酵母P GK 基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下,实现大麦α2淀粉酶和糖化酶的高效表达,99%以上的酶活力分泌至培养基中.构建的酿酒酵母菌株GRF18(pMA G 15)在含15%可溶性淀粉的培养基中,培养47h 能水解99%的淀粉,并能发酵产生酒精. 关键词 大麦α2淀粉酶 黑曲霉糖化酶 酿酒酵母 表达和分泌 酿酒酵母是酿酒工业、酒精和单细胞蛋白的生产菌,但由于其不具有淀粉水解酶的活力不能发酵淀粉.发酵前淀粉需先经过蒸煮、液化、糖化等工序变成葡萄糖后才能被利用.从80年代中期开始将各种来源的α2淀粉酶和糖化酶基因分别克隆进酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母菌株[1～5].只是由于构建菌株的酶活力不高,降解淀粉的速率较慢还不能用于生产.我们曾将地衣芽孢杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶G AI 的cDNA 分别或同时转入酿酒酵母获得表达和分泌[6～9],其中含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27),酶的表达和分泌水平都很高,但淀粉水解的速率仍较低.本文报道用酶学性质与黑曲霉糖化酶比较接近的大麦α2淀粉酶取代细菌α2淀粉酶,构建含大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母工程菌,实现α2淀粉酶和糖化酶的高表达和分泌,获得能快速分解淀粉的酵母工程菌. 1 材料和方法 111 材料 11111 菌株与质粒 本研究所用菌株与质粒如表1,其中pBAL 27是含大麦α2淀粉酶基因的大肠杆菌2酵母穿梭质粒,pMA G 69为含黑曲霉糖化酶G AI cDNA 的大肠杆菌2酵母穿梭质粒. 11112 培养基 大肠杆菌培养和转化用LB 培养基,酵母的培养和转化使用的YPD , 1996209208收稿,1996211205收修改稿 3广东省自然科学基金资助项目 中国科学 (C 辑) 第28卷 第1期SCIENCE IN CHINA (Series C ) 1998年2月
固定化技术应用－酶和细胞的固定化 试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威 资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。 选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。也就 是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学 会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。 问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固 定化细胞？ 01 1.固定化酶技术 固定化酶技术是用物理或化学手段。将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。 酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。 2.固定化酶技术的发展 以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。
1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。科学家们就开始了同定化酶的研究工作。 1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。 我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。 当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。 邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性，M I E可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，M I E又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。 Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。 3.现阶段固定化酶技术存在的缺点 （1）一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的。 （2）固定化酶一般只适用于水溶性的小分子底物；大分子底物常受载体阻拦，不易接触酶，致使催化活力难以发挥。 （3）首次使用时投入成本较高。
《发酵工艺设计》 30200t／a啤酒厂糖化车间工艺流程设计 设计人：汪海宾 学校：开封大学 专业：生物化工工艺 班级：09生化1 学号：2009051098 指导老师：胡斌杰 2011年10月
目录 一、绪论······················································ 1.1 设计的目的 1.2设计思想 1.3 啤酒酿造业存在的问题 二、设计任务书················································ 三、生产工艺流程图及生产过程·································· 3.1啤酒糖化的流程与说明 (5) 3.2 原辅料预处理 (6) 3.3麦芽汁的制备 (8) 3.3.1 糊 化 (8) 3.3.2 糖 化 (9) 3.3.3 过 滤 (10) 3.3.4 麦汁煮沸与酒花的添 加 (10) 3.3.5 麦汁热凝固物的沉 淀 (11) 3.3.6 麦芽汁冷 (11)
四、30200t／a啤酒厂糖化车间的物料衡算······················· 4.1工艺技术指标及基础数据11 4.2 100kg原料(75％麦芽，25％大米)生产12°淡色啤酒的物料衡算 (12) 4.3生产100L 12°淡色啤酒的物料衡算 (13) 4.4.30200t/a啤酒厂糖化车间的物料衡算 五、啤酒厂糖化车间生产设备的设计与选型························ 5 1.啤酒厂糖化设备的组合方式 5.2.糊化设备 5.2.1.功能用途 5.2.2糊化锅容积的确定 5.2.3糊化锅的主要尺寸 5.2.4换热面积 5.3糖化设备 5.3.1糖化锅容积的确定 5.3.2糖化锅的主要尺寸 5.3.3加热面积 5.4过滤槽 5.5煮沸锅 5.6回旋沉淀槽 ········································ 六、环境保护（啤酒工厂三废处理）········································ 6.1、三废概况················································
生物工程专业综合（设计）性大实验 报告书 (酒精发酵实验) 学生姓名：吴丁柱 学号：3102106216 班级：生工2102 专业：生物工程 指导教师：魏胜华
生物工程专业设计（综合）实验 安徽工程大学实验报告书 学生姓名：吴丁柱学号：3102106216 专业班级：生工2102 实验类型：□验证■综合□设计□创新实验日期：2013.12.17 实验成绩： 一、当前酒精生产工艺的技术进展及现状 1.1现状 酒精是广泛应用在食品、化工、医药、国防和科研等各个领域的重要有机工业原料。 中国工业化生产酒精始于1900年俄国人在哈尔滨建的酒精厂，但发展非常缓慢，新中国成立时，我国酒精产量不到1万吨，专业性酒精厂生产规模大都是千吨小厂，基础十分薄弱。 五十多年来，特别是改革开放以来，随着国民经济的发展，我国酒精生产取得了巨大的发展。现有酒精生产企业450多家，产量在3万吨以上的共26家，其中30万吨以上的3家、10～20万吨7家、3～5万吨9家。2005年酒精产量达368.13万千升（按年销售收入500万元以上的企业计）（不包括自产自用的酒精），比2004年增长33.6%，居世界第三位。 2004年出口酒精74.44万吨比2003年增2.28倍，每吨酒精创汇418.73美元。进口3433吨，其中变性酒精1802.18吨，用汇686.03美元/吨。酒精生产实现了连续化、使用专用酶制作和商品酒精酵母，固定化酒精酵母，淀粉利用率达到90%以上，淀粉出酒率好的企业可以达到55~56%，（96°V/V）原料出酒率可到40~40.88%。随着食用酒精和工业酒精国家标准的4次制订、修订和实施，高纯度特级酒精企业的日益增多，标志着我国酒精生产技术和产品质量水平得到了很大的提高。但是，国外酒精生产技术自石油危机和美国大力发展汽油醇以来，有了更快的进步，特别是在节能、综合利用和自动化等方面，与我国拉开了差距。我国每吨酒精平均能耗酒精800公斤以上，世界水平为300~400公斤。随着我国燃料乙醇的发展，引进、消化、吸收、创新，我国酒精生产技术正在得到飞跃发展和提高，深信21世纪初期一定可以赶上世界先进水平。 1.2国内酒精蒸馏流程的进展 淀粉质原料→ 蒸煮→ 发酵→ 蒸馏→ 酒精 （糖质含糖蜜）（糖质原料无需蒸煮） 1.2.1两塔 （1）50年代初，天津、地方国营哈尔滨（顾乡屯）等酒精厂采用的两塔间断蒸馏流程。 （2）50年代初间歇流程生产能力低、消耗大，相继改为连续蒸馏。上海新亚酒精厂采用的两塔液相过塔流程。 （3）山东黄台酒精厂采用的两塔半液相过塔流程。 （4）1953年南阳酒精厂为降低煤耗采用了两塔气相过塔蒸馏流程生产95%（V）酒精。 （5）1956年部颁医药用酒精标准实施后，上海酒精厂、资中糖厂采用的两塔气相 1
我国糖化酶的研究概况 糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类，介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。主要的内容包括：一、糖化酶的简介 糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。 糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称(缩写GA或G)。它是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。 二、糖化酶的结构组成及分类 糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。 糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到1 000 000间，通常碳水化合物占4％ 18％。但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达80％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖。 三、糖化酶的特性 1、糖化酶的热稳定性 在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上。工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性。一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生
酶学糖化酶的研究进展 2013年
糖化酶的研究进展 摘要:糖化酶是世界上生产量最大和应用X围最广的酶制剂,在工业中具有重要的应用价值。本文从微观学角度出发，主要介绍了糖化酶的结构和催化作用机制；另外介绍了糖化酶的分离纯化手段及其功能应用；最后提出了研究中存在的问题以及解决办法，并对糖化酶应用研究的前景进行了展望。 关键词：糖化酶；结构；催化机制；分离纯化；功能
STUDYING STRUCTURE AND FUNCTION OF GLUCOAMYLASE Abstract:Glucoamylase is the enzyme which has the most output and the vastest application in the world . From the perspective of microscopic science, This review introduces the structure and catalytic mechanism of glucoamylase; additionally introduced separation and purification methods and application of glucoamylase; In the end, put forward the application, the problems and solutions of glucoamylase research, provide future application prospect. Keywords: glucoamylase；structure ；Catalytic mechanism；Purification；function 糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶(glucoamylase),全称是α-（1-4）-葡聚糖—葡萄糖水解酶，它的底物是葡萄糖分子通过α-（1-4）-糖苷键连成的高分子，水解产物是葡萄糖，酶学编号是E3.2.1.3[1]。糖化酶是淀粉转化为葡萄糖过程的主要酶类，早在1500年前，我国已用糖化曲酿酒，本世纪20年代法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲, 并用于酒精生产。目前，糖化酶已涉及到食品、医学、发酵等多个行业，具有广泛的应用价值。1．糖化酶的结构及其催化机制 1.1糖化酶的结构 糖化酶是由微生物分泌产生的，具有外切酶活性的胞外酶，催化淀粉从非还原端水解α-1，4糖苷键逐个释放出单个β-D-葡萄糖。它是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白, 分子量在60000～1000000间，含有一个催化域(CD)和一个淀粉
葡萄糖生产工艺流程图和工艺说明
葡萄糖生产工艺说明 1、第一关键步骤是液化，目的是将水解淀粉的α一1，4糖苷键，属于随机剪切模式，反应后形成麦芽糊精。由于液化酶耐高温，PH 值位于5.5-7之间，因此液化之前需要提高温度到105摄氏度左右，太高温度不划算，太低温度不利于液化酶的效率，105摄氏度最为合适。由于淀粉乳加工过程中，使用了过量的酸，在液化前的调乳阶段需要加入纯碱。 2、第二关键步骤是糖化，目的是将麦芽糊精继续剪切成葡萄糖，使用的淀粉酶是糖化酶，其不仅可以水解淀粉的α一1，4糖苷键，还可以水解淀粉的α一1，6糖苷键，由于糖化酶的最佳温度是55-60摄氏度，PH好滋味4.0-4.5，因此在糖化工艺中，需要进行降温，并加入盐酸以调整PH值到合理的区间。值得注意的是：糖化步骤前需要降温，而液化步骤前需要升温，因此液化工艺和糖化工艺之间有一个换热的过程，糖化降温的热量为液化升温的物料进行预热。 3、第三个关键步骤是过滤脱色，严格来说这是一个步骤，转鼓过滤机的转鼓上涂布了硅藻土，葡萄糖浆经过转鼓时，大部分杂质被硅藻土吸附，葡挞糖浆得以净化，除去了大颗粒的杂质。小颗粒带颜色的杂质继续进入脱色反应釜进行脱色处理，使用活性炭吸收小颗粒颜色杂质后，对活性炭进行过滤。 4、第四个关键步骤是离子交换。对前期加入的氯化钠、盐酸等所含的钠离子、氯离子进行脱离，使用离交柱子，离交柱子吸附钠离子和氯离子之后会失效，这时候需要停止进料，使用备用离交柱子走料，失效的离交柱子使用盐酸和液碱（火碱）进行再生处理。 5、第五个关键步骤是蒸发浓缩，利用蒸汽通入真空蒸发器，进行物料浓缩处理，使得物料达到结晶前粘稠状态。 6、提溜个关键步骤是结晶和离心。投入晶种的目的是为了诱导粘稠物料结晶成型，降温的目的是诱导物料中的晶型在达到结晶温度的同时逐步析出，达到离心的条件。需要注意的是，离心后的母液仍然含有大量的糖，同时，有可能含有部分离子，因此配置在立交之前，而洗水是离心中对晶体洗涤用水，含有离子和过程杂质较少，所以配置在蒸发浓缩工艺中继续回收利用。