纤维素酶的生产工艺主要有两种，即固体发酵和液体发酵，其工艺如下：
影响产酶量和活力的因素：
影响纤维素酶产量和活力的因素很多，除菌种外，还有培养温度、pH、水分、基质、培养时间等。这些因素不是孤立的，而是相互联系的。以绿色木霉（T.ViriclePers.expr）为菌种，研究了影响产纤维素酶的五大因素对产酶量和活力的作用，认为基质粗纤维含量为40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃条件下培养45h可获得最大产酶量26mg/g和CMC酶活力
20mg/g·h。其诱变筛选的里氏木霉91-3的产酶条件，结果表明该菌种以7：3的秸秆粉和麦麸，另添加4%硫酸铵、0.4%磷酸二氢钾、0.1%硫酸镁为最佳培养基，28-32℃为适宜培养温度，30℃为最佳温度，4%为最佳接种量，96h到达发酵高峰。以康氏木霉W-925为出发菌，经诱变后得到的Wu-932纤维素酶高产菌的最佳发酵条件。结果表明，以1：2的麦麸和稻草粉为培养基，5%的接种量，稻草粉碎平均长度3-5mm，初始pH4-5，温度在28-35℃，发酵时间72h为最佳发酵条件。
污染菌的控制：
饲用纤维素酶普遍存在一种俗称的“白毛菌”污染。污染后轻者酶活性下降，重者发酵失败。为此，研究控制发酵污染意义很大。“白毛菌”的菌落特征、来源、生长和生理特征及控制方法，找到了一种与康氏木霉Wu-932呈共生关系，而与“白毛菌”呈竞争性抑制关系的热带假丝酵母菌J-931。利用此菌进行混合发酵，可有效地控制“白毛菌”的污染。
谷氨酸发酵过程控制 【摘要】谷氨酸是构成蛋白质的20种常见α氨基酸之一。作为谷氨酰胺、脯氨酸以及精氨酸的前体。谷氨酸的质量受到发酵的条件、菌种、温度、pH、接种量和种龄等因素的影响。如果控制不好这些因素整个发酵过程发酵液受污染、出现菌体的生长缓慢和代谢产物的积累很少、发酵周期延长甚至所得产品不是最终产品。本文通过综述发酵培养基、培养条件的控制及发酵过程温度、pH、接种量和种龄的控制，以及消泡等多方面因素，来提控制高谷氨酸发酵过程的参数来提高发酵的质量以些方法。 【关键词】谷氨酸、发酵、控制 1.谷氨酸概述 谷氨酸学名：2-氨基-5-羧基戊酸。构成蛋白质的20种常见α氨基酸之一。作为谷氨酰胺、脯氨酸以及精氨酸的前体。L-谷氨酸是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸，在体内可以由葡萄糖转变而来。D-谷氨酸参与多种细菌细胞壁和某些细菌杆菌肽的组成。符号：E。 1.1谷氨酸用途 1）下游产品开发 将有一定反应活性的双功能基试剂氯乙醇和L—谷氨酸直接酯化保护羧基，用三光气活化成其相应的N—羧酸酐，可直接得到侧链具有一定反应活性的聚L—氯乙基谷氨酸酯。谷氨酸可生产许多重要下游产品如L—谷氨酸钠、L—苏氨酸、聚谷氨酸等。 2）食品业 谷氨酸是在食品工业中应用较多的氨基酸。谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。用于食品内，能显着提高食品的风味和有增香作用。谷氨酸作为风味增强剂可用于增强饮料和食品的味道，不仅能增强食品风味，对动物性食品有保鲜作用。 3）日用化妆品等 谷氨酸为世界上氨基酸产量最大的品种。如：N—酰基谷氨酸钠系列产品是由谷氨酸缩合而成的性能优良的阴离子表面活性剂，广泛用于化妆品、香皂、牙膏、香波、泡沫浴液、洗洁净等产品中。谷氨酸作为营养药物可用于皮肤和毛发。用于生发剂，能被头皮吸收，预防脱发并使头发新生，对毛乳头、毛母细胞有营养
第一章概论 1.1引言 沼气是有机物质在厌氧条件下，经过微生物的发酵作用而生成的一种可燃气体。由于这种气体最先是在沼泽中发现的，所以称为沼气。人畜粪便、秸秆、污水等各种有机物在密闭的沼气池内，在厌氧（没有氧气）条件下发酵，即被种类繁多的沼气发酵微生物分解转化，从而产生沼气。沼气是一种混合气体，可以燃烧。沼气是有机物经微生物厌氧消化而产生的可燃性气体。 沼气是一种可持续利用的生态资源。利用沼气，可以节省大量的秸秆、干草等物料，有助于发酵出更多动物饲料和制作更多的纸张；沼气还可以用来做饭、照明、发电等，大大的节省了农民家庭的开支，减少了生活负担；沼气剩下的沼渣和沼液可以当作有机肥料，用于农作物和田地的施肥，增强农作物的抵抗力，减少农作物的病虫发生率，促进营养成分的吸收，改善土壤的板结，持续的保肥保水。 沼气工程技术，是一项以开发利用养殖场粪污为对象，以获取能源和治理环境污染为目的，实现农业生态良性循环的农村能源工程技术。它包括厌氧发酵主体及配套工程技术，主要是通过厌氧发酵及相关处理降低粪水有机质含量，达到或接近排放标准并按设计工艺要求获取能源—沼气：沼气利用产品与设备技术，主要是利用沼气或直接用于生活用能，或发电、或烧锅炉、或直接用于生产供暖、或作为化工原料等：沼肥制成液肥和复合肥技术，则主要是通过固液分离，添加必
要元素和成份，使沼肥制成液肥或复合肥，供自身使用或销售。 1.2我国沼气工程发展现状 随着城镇工业和农村集约化养殖业的发展, 生产过程中排出的各种有机废弃物的污染治理及其资源的综合利用, 已成为当今国际社会普遍关注的问题。在过去20 多年里, 我国利用厌氧消化技术处理工农业有机废弃物取得了较好的能源、环保和经济效益, 并逐步形成了沼气一能源环保工程规模。据报道, 全国现有大中型沼气工程60 0 多处, 总池容21 万多立方米, 年产沼气3 6 7 8万立方米, 年处工业废水和禽畜粪便能力达50 0 多万吨。我们自19 9 2年开始收集大中型沼气工程资料, 并对近百座工程进行了书面调查或实地考察。调查结果表明: “我国大中型沼气工程技术日趋成熟, 工程的整体技术水平和资源利用率近些年提高幅度较大, 各类的沼气工程, 都已从过去单纯追求能源效益, 转入注重发挥沼气技术多功能优势, 为配合菜篮子工程和改善农业生态环境, 为发展农村经济服务, 广泛地开展了沼气及发酵残余物在种植业和养殖业等生产方面的综合利用, “八五”期间建设的沼气工程与“六五”、“七五”期间作比较其工程运行稳定率提高了20 % 一3 0 %, 工程投资回收年限缩短了10 %一20 %。 当前, 大中型沼气工程存在的主要问题是: 有的工程处理技术不完善, 设备匹配不尽合理, 工程运转故障较多; 有的工程采用的厌氧消化工艺及装置与所处理的原料不相适应, 工程处理能力低, 经济效益差; 还有的工程由于原料不足, 造成设备利用率低。认真分
纤维素酶活力的测定 1.纤维素酶活力单位定义 在37?,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液 中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u. 2.测定原理 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还 原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与 酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力. 3.试剂与溶液 除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水. 3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml: 称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml. 3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L: 吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml. 3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L: 称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml. 3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L: 称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml. 3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5: 称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定 溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至 5.5. 3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)
年产2万吨谷氨酸发酵生产的初步设计
第一章总论 一、设计项目： （1）设计课题：年产2万吨谷氨酸发酵工厂的初步设计 （2）厂址：某市 （3）重点工段：糖化 （4）重点设备：糖化罐 二、设计范围： （1）厂址选择及全厂概况介绍（地貌、资源、建设规模、人员）；（2）产品的生产方案、生产方法、工艺流程及技术条件的制定；（3）重点车间详细工艺设计、工艺论证、设备选型及计算；（4）全厂的物料衡算； （5）全厂的水、电、热、冷、气的衡算； （6）车间的布置和说明； （7）重点设备的设计计算； （8）对锅炉、电站、空压站等提出要求及选型； （9）对生产和环境措施提出可行方案。 三、要完成的设计图纸： （1）全厂工艺流程图一张； （2）重点车间工艺流程图一张； （3）重点车间设备布置立面图一张；
（4）重点车间设备布置平面图一张； （5）重点设备装配图一张。 四、设计依据： （1）批准的设计任务书和附件可行性报告，以及可靠的设计基础资料。 （2）我国现行的有关设计和安装的设计规范和标准 （3）广东轻工职业技术学院食品系下达的毕业设计任务书 五、设计原则： （1）设计工作要围绕现代化建设这个中心，为这个中心服务。首先要有加速社会主义四个现代化早日实现的明确指导思想，做到精心设计，投资省，技术新，质量好，收效快，收回期短，使设计工作符合社会主义经济建设的总原则。 （2）要学会查阅文献，收集设计必要的技术基础资料，要善于从实际出发去分析研究问题，加强技术经济的分析工作。（3）要解放思想，积极采用技术，力求设计上具有现实性和先进性，在经济上具有合理性，尽可能做到能提高生产率，实现机械化和自动化，同时兼顾社会和环境的效益。 （4）设计必须结合实际，因地制宜，体现设计的通用性和独特性相结合，工厂生产规模、产品品种的确定，要适应国民经济的需求，要考虑资金的来源，建厂的地点、时间、三废综合
R U RAL EN ER GY No.42000(92Issue i n All)?20? 沼气正常发酵的工艺条件 孙进杰赵丽兰(山东省蓬莱市农业局蓬莱265600) (1)厌养环境在厌氧发酵过程中,大多数不产甲烷微生物为厌氧菌,须要在无氧条件下,将复杂的有机物质分解成简单的有机酸等。产甲烷菌则是专性厌养菌,氧对产甲烷菌不仅不会起促进作用,相反会起到毒害、抑制作用。因此,修建沼气池要确保池壁不渗水、不漏气。 (2)发酵原料在厌氧发酵过程中,原料既是产生沼气的基质,又是沼气发酵微生物赖以生存的养料来源。除了矿物油和木质素外,自然界中的有机物质一般都能被微生物发酵产生沼气,但不同的有机物有不同的产气量和产气速度。较难分解的有机物质,在投料前要进行切碎、堆沤等预处理。若有机物已经过牲畜肠胃消化、阴沟厌养消化及工业发酵,因此,粪便、阴沟污泥、酒厂废液、酵母厂废水、豆制品厂废水及纸浆废水等都是较好的沼气发酵原料。 (3)发酵温度沼气发酵与温度有密切的关系,在一定温度范围内,温度越高,产气量也越高。但是产气量并不与温度的增高呈正比,在30～60℃之间有两个产气高峰:一个介于30～40℃之间,另一个介于50～60℃之间,这是因为有两个不同的微生物群在起作用。另外,沼气发酵温度突然上升或下降,对产气量有明显的影响。若温度突然上升或下降5℃,产气量会显著降低,若变化过大,则产气过程停止。为防止沼气发酵温度的突变,沼气池应采取必要的保温措施。将沼气池建于温室大棚内(夏季遮阴),是防止温度突变的有效措施之一。 (4)p H值沼气微生物的正常生长、代谢需要适中的p H值(6.5～7.5),p H值在6.4以下和7.6以上都会对产气产生抑制作用。p H值在5.5以下时,产甲烷菌的活动完全受到抑制。在沼气发酵过程中,池内p H值会有规律地发生变化。在发酵初期,池内产生大量的酸,p H值下降。随后,氨化作用产生的一部分氨,会中和掉一部分酸,同时,由于产甲烷活动利用了大量的挥发酸,会使p H 值恢复正常。这就是说,在正常情况下,沼气发酵过程中的p H值变化是一个自然平衡过程,一般不须要进行人为的调节。但如果配料不当,或操作管理不合理,可能会导致大量挥发酸积累,从而使p H值下降。在日常管理中,可能会遇到p H值过高或过低影响产气的情况,此时便须要进行人为调节。调节方法有以下几种,一是经常换料(少量),以稀释发酵液中的挥发酸,提高p H值;二是向池中加入适量的草木灰或氨水,调节p H值;三是适当加入牛、马粪便,并加水冲淡,此法可用于p H值过高时。 (5)接种物在发酵过程中,菌种质量的好坏、数量的多少将直接影响到产气率的高低。实际操作中,要视发酵原料的不同,决定是否须要接种。如果原料是粪便及其他已发酵过的原料,由于本身含有大量的发酵微生物,不须要接种。如果原料是工、农业废水,由于这些物质不含有发酵微生物或数量太少,入池后,必须加入足够量的接种物。接种物可以从自然界中方便地获得,阴沟污泥、粪坑底脚污泥等都可作接种物。如果条件允许,在沼气池大换料时,采用发酵液作为接种物,可以取得同样好的结果。加入接种物的数量,要视接种物的来源确定。如果采用沼气池发酵液作接种物,接种量应占总发酵料液的30%以上;若采用沼
山东大学实验报告2011年4月20日 姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105 一、实验目的 1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、巩固使用分光光度计 二、实验原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。 三、实验器材 （1）722型分光光度计（2）恒温水浴 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）分析天平（7）试管架 （8）胶头滴管 （9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球 四、实验材料 （1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）； （2）3、5—二硝基水杨酸显色液； （3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）； （5）蒸馏水。 五、实验操作 1.空白管的测定：
发酵工艺标准操作流程 (SOP) 一生产前准备 每次生产前按品种配方将所需原料称重准备齐全,并确认生产原料库存量,保证原料库存量足够下次生产所需、 二生产前检查 1检查蒸汽、压缩空气、冷却水进出的管路就是否畅通,所有阀门就是否良好,并关闭所有阀门、 2检查电路、控制柜、开关的状态,确保控制柜运行正常、 3检查空压机油表油表及轴承、三角带、气缸等就是否正常,确保空压机运行正常、 4检查发酵罐搅拌减速机的油量及密封轴降温水就是否正常、 三总过滤器灭菌 当蒸汽总管路上的压力为0、2-0、25MPa时,打开总过滤器进气阀输入蒸汽,同时打开出气阀的跑分阀、排气阀、排污阀,当三个阀均排出蒸汽时,调整进气阀、排污阀,稳定总过滤器压力0、15-0、2MPa,此时打开压力表下跑分,计时灭菌2-2、5小时、灭菌结束后启动空压机,当空气输入管道压力大于总过滤器压力时,关闭蒸汽阀,打开空气阀,将空气出入总过滤器,然后调整进气阀与排污阀,稳定总过滤器压力在0、15-0、2MPa,保持通气在15-20小时,当出气阀跑分与排污阀放出的空气为干燥空气时,完成灭菌、 四分过滤器灭菌 1当蒸汽管路压力为0、2-0、25MPa时,打开蒸汽过滤器的进气阀与排污阀,当蒸汽管路中无蒸汽凝结液后,再将蒸汽输入空气管路,然后打开分过滤器的进气阀、排污阀及出气阀上的跑分,当所有阀门均有蒸汽排出后,调整进气与排污阀,就是压力稳定在0、11-0、15MPa,计时灭菌30-35分钟、灭菌结束后,关闭蒸汽过滤器进出气阀、排污阀,并立即将空气输入预过滤器,使空气通过预过滤器进入到分过滤器,再调整分过滤器排污阀使压力稳定在0、11-0、15MPa,备用、
发酵生产纤维素酶研究进展 摘要：纤维素酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于能源、饲料、纺织、食品、工业洗涤、石油开采、农业、医药等领域。纤维素酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。综述了纤维素酶的种类、高产纤维素酶菌种选育、发酵类型与优化等方面的研究进展，并展望了纤维素酶发酵生产的研究方向及前景。 关键词：发酵 纤维素酶 液体发酵 固体发酵 优化 纤维素原料是地球上分布广泛且含量丰富的可再生资源，其生物合成和降解过程是自然界中碳循环的中心环节。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。随着纤维素资源越来越受到人们的重视，其能量密度低，难降解等特性却阻碍了其开发利用的进程。 纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它的作用是将纤维素转化为糖类，能够降解细胞壁，使细胞内溶物释放。作为重要的工业用酶，纤维素酶广泛应用于在能源、饲料、纺织、食品、工业洗涤、石油开采、农业、医药等诸多领域。 1977年，Elwyn T. Reese 发现木霉属中的菌株具有分泌纤维素酶的能力，并将该具有分泌纤维素酶能力的菌株命名为里氏木霉（Trichoderma reese ），该发现为工业大规模发酵生产纤维素酶奠定了基础。纤维素酶广泛存在广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、动物体内等，其中真菌纤维素酶种类最多，最易获得和用于大规模生产，且具有较稳定的pH 、温度适应性，因此是工业用纤维素酶的重要来源。目前应用最广的纤维素酶生产菌是里氏木霉，也有曲霉属（Aspergillus ）、青霉属（Penicillium ）的菌种。 自20世纪50年代首次发现以来，便得到广泛的研究与应用。近几年来，真菌纤维素酶发酵研究主要集中在高产菌株的筛选、常规诱变育种、基因工程菌的构建、发酵工艺条件优化、发酵工艺放大和酶的分离纯化等方面。 1 纤维素酶的种类 纤维素酶(cellulase)指的是降解纤维素的一类酶的总称，它不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系。包括内切 1，4-葡聚糖酶（C 酶），外切葡聚糖酶 （C 酶）和β-葡萄糖苷酶（C 酶）。 X 1B 作用方式如下图：
沼气发酵 食品院轻化071 肖小根 目录 ?课程感言 ?沼气发酵简介 ?沼气发酵机理 ?沼气发酵工艺 ?沼气发酵工艺条件 ?沼气池的类型 ?沼气的利用与前景 ?中国发展沼气产业的现实意义 课程感言 “发酵工程原理与技术”这门课程内容分为五篇，前三篇从原料到产物阐述了发酵的整个过程后两篇是对发酵工程的延伸。第五篇讲述的“发酵工厂废物处理和清洁生产技术”是目前我们国家及至全世界都在致力于发展的技术，以应对日趋严重的能源、资源和环境危机。 整本书的主要内容侧重于对发酵工程原理的介绍，大部分内容与“工业微生物学”和“生物化工”相类似，可以说是以往学习的相关知识的综合，在学习过程中也是一种巩固。我认为学习这门课程的目的最重要还是要知道如何去运用它。在本教中关于发酵工程的应用内容不多主要集中在第五篇：关于发酵工厂废物处理和清洁生产技术的介绍。这部分内容我也大略地看过，由于全球环境污染日趋严重，节能减排、防污治污技术必然成为全球的聚集点。对于这方面的内容我也比较感兴趣，我希望能找到一种技术，通过查找一些资料来系统地它认识和了解，同时也希望以此作为一根主线用具体的例子来串连起教材的所有内容，最终我选择了沼气发酵。选择它的理由有三点：1、更贴近于实际生活；2、它能够在节能减排、资源循环利用的条件下有效地改善农村居民的生活；3、该技术已经成熟，相关资料比较多，但亟待大力推广，学习它在将来更有可能用得上。 在介绍沼气发酵这一技术中，我主要引用了：《微生物学教程》（第二版高教出版社周德庆主编）和《发酵工程》（科学出版社韦革宏杨祥主编）和百度关于沼气发酵的内容。 我希望能够通过对“沼气发酵”的全面了解，以后自己可以来建造沼气池。
湖北农业科学2009年（责任编辑郑威） mineral forming elements ［C ］．Amsterdam ：Elsevier ，1979． 253－292．［6］ NEALSON K H．The microbial manganese cycle ［A ］． KRUMBEIN W E．Microbial geochemistry ［C ］．Oxford ：Blackwell Scientific Publications ，1983．191－221．［7］ TEBO B M ，BARGAR J R ，CLEMENT B G ，et al．Bio-genic manganese oxides ：properties and mechanisms of forma-tion ［J ］．Annu．Rev．Eath．Planet Sci ，2004，32：287－328． ［8］田美娟，邵宗泽．深海抗锰细菌的分离鉴定［J ］．厦门大学学报 （自然科学版），2006，45（2）：272－276． ［9］ SOLOMON E I ，SUNDARAM U M ，MACHONKIN T E．Multicopper oxidases and oxygenases ［J ］． Chem Rev ， 1996，96：2563－2605． ［10］ TONER B ，FAKRA S ，VILLALOBOS M ，et al．Spatially Resolved Characterization of Biogenic Manganese Oxide Pro-duction within a Bacterial Biofilm ［J ］．Appl Environ Micro-biol ，2005，71（3）：1300－1310． 第48卷第1期 2009年1月 湖北农业科学 H ubei A gricultural S ciences Vol．48No.1 Jan ．，2009 收稿日期：2008－10－18 基金项目：鲁东大学基金项目（20053305） 作者简介：冯培勇（1977－），男，山东日照人，硕士，主要从事微生物产酶的研究工作，（电话）132********（电子信箱）fengpeiyong2004＠yahoo．com．cn 。 纤维素是广泛存在于自然界中的一种由许多葡萄糖基组成的大分子物质，可被存在于微生物中的纤维素酶所降解。纤维素酶指的是降解纤维素酶生成葡萄糖的一组酶的总称。目前认为，完全降解纤维素至少需要3种功能不同且互补的纤维素酶组分，即内切葡聚糖酶（C1酶或EG ）、外切葡聚糖酶（Cx 酶或CBH ）、β－葡萄糖苷酶（简称βG ）［1］。纤维素酶的应用随着工业的发展而日趋广泛，不仅能用于生产葡萄糖、酿酒、饲料工业、纺织行业、环卫污物的处理、农产品加工及生物工程等方面［2］，而且可用于服装加工行业［3］。由于野生型菌种的纤维素酶 活力不高，因此，利用各种诱变手段选育高产纤维素酶生产菌一直是国内外研究的热点。本研究通过化学诱变剂NTG 、硫酸二乙酯和LiCl 对一株黑曲霉菌株进诱变，获得了纤维素酶活性显著提高且遗传性状稳定的突变株。 1 材料与方法 1．1材料 1．1．1出发菌株黑曲霉（Aspergillus niger F1）， 本实验室分离保存。 1．1．2 培养基 ①斜面培养基（PDA 培养基）：马铃 高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育 冯培勇，宿红艳，张 丽，王艳华 （鲁东大学生命科学学院，山东烟台 264025） 摘要：以1株黑曲霉（Aspergillus niger F1）为出发菌株，经过亚硝基胍、硫酸二乙酯和氯化锂诱变处理，选育出1株纤维素酶高产菌株L1。在适宜条件下，其产CMCase 活力为出发菌株的150．2％。关键词：纤维素酶；化学诱变；黑曲霉中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2009）01－0088-03 Breeding of High-Yield Cellulase Aspergillus niger Mutated by Chemicals FENG Pei－yong ，SU Hong－yan ，ZHANG li ，WANG Yan－hua （College of Life Science ，Ludong University Yantai 264025，Shandong ，China ） Abstract ：A strain ，Aspergillus niger F1，was used as starting strain and mutated by NTG ，DES and LiCl．The strain named L1was bred which could produce high－yield cellulase．Under suitable conditions ，its CMCase activity was 150．2％of the starting strain． Key words ：cellulase ；chemical mutatation ；Aspergillus niger !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
实验 纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法） 一、实验目的 掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力的方法。 二、实验原理 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，故可利用比色法测定其还原物生成量来表示纤维素酶的活力。 三、主要仪器与试剂 (一)实验仪器 1. 25mL 比色管 2. 722型分光光度计 3. 滴管 4.水浴锅 5.移液枪 6.电炉 (二)、试剂 1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10.0 g 3,5-二硝基水杨酸，溶入200mL 蒸馏水中，加入20g 分析纯氢氧化钠，200g 酒石酸钾钠，加水至500mL ，升温溶解后，加入重蒸苯酚 2.0g ，无水亚硫酸钠0.50g 。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000mL 。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2. 0.1mol/L pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。 3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 4. 葡萄糖标准溶液：称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg ，溶解后定容至100mL ， 此溶液含葡萄糖1.00mg/mL 。 5. 纤维素酶液：将0.05g 酶溶解定容至50 mL ，从中取出1.0mL 再定容至100mL ，待检测用。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制） 四、实验步骤 1.标准曲线的绘制：分别吸取0.0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00m L 葡萄糖标准液于6支25mL 比色管中，均用蒸馏水稀释至1mL ，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL ，在沸水浴中煮沸显色10min ，冷却，加蒸馏水21mL ，摇匀。以空白管调零，在550nm 处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖μg 数为横坐标，绘出标准曲线。 序号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标液 0.0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0.0 3,5-二硝基水杨酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 实验操作 沸水浴加热10min ，冷却后，加水定容，摇匀，比色测定 吸光度A 550nm 0.0 2.空白管的测定： 在2支25mL 试管中各加入1.0mL 酶液，沸水浴5min ，冷却后加 3.0mL 0.5%CMC-Na ，与样品管同时放入50℃水浴30min 。其它操作同样品管。 3.样品的测定：在3支25mL 试管中各加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液3.0mL ，酶液1.0mL ，于50℃水浴中糖化30min ，取出，立即于沸水浴中煮沸10min 使酶失活，得糖化液，冷却加入3.0 mL 3,5-二硝基水杨酸显色液，再沸水浴10min ，冷却后加水定容至25mL ，混匀，以空白管调零，在550nm 处测OD 值，查葡萄糖标准曲线得样品的葡萄糖μg 数。 五、结果计算 在上述条件下，1㎎酶每分钟催化纤维素水解生成1微克葡萄糖定为一个活力单位。 1 30) (??g OD N μ值对应的葡萄糖量
1）生物素营养缺陷型 ?作用机制:生物素是脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶,参与 了脂肪酸的合成,进而影响脂肪酸的合成.当磷脂合成量少到正常的1/2左右时,细胞变形,Glu向膜外泄漏. ?控制关键:使用该类突变株必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10 g/L).在发酵 初期(0-8小时),细胞正常生长,当生物素耗尽后,在菌的再次倍增时,开始出现异常形态细胞,即完成了细胞从生长型到积累型转换. 2）油酸营养缺陷型 ?作用机制:油酸营养缺陷型丧失了合成油酸的能力,通过控制油酸使磷脂合成量减少 到正常量的1/2左右. ?控制关键:保证在培养基中油酸亚适量,完成细胞从生长型到生产型的转换. （3）添加表面活性剂 ?添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18),也能造成细胞渗漏,积累谷氨 酸. ?机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用,导致磷脂合成不足,形成不完整的细 胞膜. ?关键:控制好脂肪酸或表面活性剂的时间和浓度,必须在药剂加入后,在这些药剂存在 下进行分裂,形成产酸型细胞. （4）添加青霉素 ?机理:青霉素抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成,细胞膜在失去保护,在渗透压的作 用下受损,向外泄露谷氨酸. ?控制关键:一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加.添加青霉素后倍增的菌体不 能合成完整的细胞壁,完成细胞功能的转换. 谷氨酸发酵强制控制工艺 ?为了稳产,克服培养基原料中某些成分不易控制带来的影响,在谷氨酸发酵时可采取 “强制控制”的方法,如:“高生物素高吐温”或“高生物素高青霉素”的方法. ?控制方法:在发酵培养基中预先配加一定量(过量)的纯生物素,大大地削弱每批原料 中生物素含量变化的影响,高生物素、大接种量能促进菌体迅速增殖.再在菌体倍增的早期加入相对高的吐温或青霉素,形成产酸型细胞.固定其它条件,确保高产稳产。谷氨酸发酵 ? 1.适应期:尿素分解出氨使pH上升.糖不利用.2-4h. 措施:接种量和发酵条件控制使适应期缩短. ? 2.对数生长期:糖耗快,尿素大量分解使pH上升,氨被利用pH又迅速下降.溶氧急剧 下降后维持在一定水平.菌体浓度迅速增大,菌体形态为排列整齐的八字形.不产酸.12h. 措施:及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH,在pH7.5-8.0时流加尿素;维持温度30- 32℃ ? 3.菌体生长停止期:谷氨酸合成. 措施:提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4.大量通**,控制温度34-37 ℃. ? 4.发酵后期:菌体衰老,糖耗慢,残糖低. 措施:营养物耗尽酸浓度不增加时,及时放罐. 发酵周期一般为30h. 二、谷氨酸发酵的生化过程
年产300吨纤维素酶工厂的初步设计 摘要
纤维素是年产量巨大的可再生性资源，地球上每年光合作用生成的上亿吨生物质中，纤维素占了近一半。目前，自然界中纤维素只有一小部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅被白白浪费，而且还会造成环境污染。利用这一年产量巨大的可再生性资源将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料，对于人类社会的可持续性发展具有非常重要的意义。 本设计采用目前认为是最好的产纤维素酶的菌种里氏木霉作为发酵菌种，液体深层发酵过程中采用变温发酵的方法分别控制菌种的生长和产酶，提取过程中采用超滤、层析等，提高产品的收率。最后采用喷雾干燥做成固态的酶制剂。 本设计的主要内容有：工厂总平面布置、全厂工艺流程设计、工艺计算、设备的计算与选型、成本核算；另外，完成设计图纸8张，有工厂总平面布置图、工艺流程图（3张）、发酵罐设计图、种子罐设计图、发酵车间设备布置图（平面图和立面图）。根据全厂工艺设计和计算结果可以看出，该设计能够达到工业生产的要求。 关键词：纤维素酶；液体深层发酵；里氏木霉
ABSTRACT Cellulose is a kind of reproducible resource of great output, it takes about a half of the hundred million biomaterial making by photosynthesis. Presently, only a few cellulose are utilized, most of cellulose are wasted and pollute environment. It is of great importance to transfer these resource to energy ,food, and so on. This design adopt Trichoderma reesei which produce cellulase best. During the liquid submerged fermentation course we chang the temperature in order to control the growth that germ grows and produce cellulase respectively. Ultrafiltration and chromatography are used In the extrace process for improve the yield. In the end we make solid zymin by spray dring . The design mainly include the contents hereinafter: the layout of the whole factory ,the craft argumentation of the whole factory，the calculation of the craft，the calculation and type choosing of main equipments, the calculation of the costs. And design 8 charts , that are the layout of the whole factory, the design of the craft process(3), the design of the fermentation pot, the design of seeding tank, the lay out for equipments of the fermentation workplace(ichnography and space).According to the craft argumentation of the whole factory and the result of the calculation, the design can come up to the request of industrialization. Keywords: Cellulase; liquid submerged fermentation;; Trichoderma reesei
湖南农业大学课程论文 学院：生物科学技术学院班级： 姓名：学号： 课程论文题目：纤维素酶高产菌株的诱变育种 课程名称：工业微生物育种学 评阅成绩： 评阅意见： 成绩评定教师签名： 日期：年月日
纤维素酶高产菌株的诱变育种 ( ) 【摘要】纤维素酶是一种重要的工业酶制剂，是一种复合酶，它将纤维素及类似物水解成葡萄糖。近年来，对产纤维素酶菌株的鉴定、诱变育种、筛选等方面取得了长足的进展。本文对这些研究进展进行了归纳和总结. 【关键词】产纤维素酶菌株；纤维素酶；筛选；诱变育种 Mutation Breeding of Cellulase High-yield Strain TAO Mi-lin (College of Biological Science and Technology, Hunan Agriculture University, Hunan 410128) 【Abstract】Cellulase is a kind of complex enzyme. Due to the ability of hydrolyzing cellulose or the similarity of cellulose into glucose. A great effort has been made until now on the research such as identification, mutation breeding and filter of cellulose-producing strain. This paper focused a brief induction and summary on advancing about these aspects. 【Key words】cellulose-producing strain ; cellulase ; filter ; mutation breeding 随着石化燃料由短缺变枯竭，能源是人类面临的共同问题。寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。纤维素与石化燃料不同，它是一种可再生的资源。地球上每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素，如农业废物( 稻草、稻壳、麦杆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废物(果皮、果渣等)、木材废物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40%~60% 固体废物是垃圾和废纸)等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。纤维素酶的特异性高，反应条件比较温和，可避免化学转化所导致的环境污染等，是将这些纤维素物质转化成简单糖的关键。因此，在再生能源利用方面具有很广阔的应用前景。另外，自然界中细菌、真菌、某些无脊椎动物，直至高等植物中都有纤维素酶的存在，因此，纤维素酶的研究还具有普遍的生态意义。 1、纤维素酶 纤维素酶最早由Seilliere于1906年研究发现，我国约从20世纪70年代开始纤维素酶的研究，且已被正式批准为饲料添加剂在动物生产中应用。 1.1 纤维素酶的结构 不同来源的纤维素酶理化性质不相同，纤维素酶分子一般由球状的催化结构域(CD)、连接桥(Linker)和纤维素结合结构域(CBD)3部分组成。纤维素酶是由葡聚糖内切酶(endo-1,4-β-D-glucanases，EC3.2.1.4，简称EG)、葡聚糖外切酶
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
食品发酵工艺学 第一章绪论 一、食品发酵与酿造的历史 1.列文虎克Leeuwenhoek Antoni Van ( 1632-1723 )：成功制造了世界上第一台显微镜，并在人类历史上第一次通过显微镜发现了单细胞生命体-----微生物。 2. 巴斯德（Louis Pasteur,1822~1895）巴斯德的主要贡献：发明了巴斯德灭菌法。1861年，巴斯德实验，结束了绵延100多年的争论，把自然发生论赶出了科学界。1865年，巴斯德受农业部长的重托，解决了法国南部蚕业上遇到的疾病使蚕大量死亡的难题。发明了狂犬病疫苗，他还指出这种病原物是某种可以通过细菌滤器的“过滤性的超微生物”。 3.科赫（Koch, Robert 1843~1910）科赫的主要贡献：1881年后，创用了固体培养基划线分离纯种法。建立了单种微生物的分离和纯培养技术。1882年3月24日科赫在德国柏林生理学会上宣布了结核菌是结核病的病原菌。单种微生物分离和纯培养技术的建立，是食品发酵与酿造技术的第一个转折点。 4. 20世纪40年代，好气性发酵工程技术成为发酵与酿造技术发展的第二个转折点。 5. 人工诱变育种技术和代谢调控发酵工程技术成为发酵与酿造技术发展的第三个转折点。 6．20世纪70年代发展起来的DNA重组技术，又大大推动了发酵与酿造技术的发展。二、食品发酵与酿造的特点以及与现代生物技术的关系 （一）食品发酵与酿造的特点 发酵：泛指利用微生物制造工业原料和工业产品的过程。通常所说的发酵指生物或离体的酶，不彻底地分解代谢有机物，并释放出能量的过程。 酿造：是我国劳动人民对一些特定产品进行发酵生产的一种称谓，通常把成分复杂、风味要求较高，诸如黄酒、白酒、啤酒、葡萄酒等酒类以及酱油、酱、食醋、腐乳、豆豉、酱腌菜等食佐餐调味品的生产称谓酿造。 酿造与发酵的区别：利用生物体或生物体长生的酶进行的化学反应。与化学工业相比，发酵与酿造工业的特点：安全、简单；原料广泛；反应专一；代谢多样；易受污染；菌种选育发酵技术的两个核心：生物催化剂、生物反应系统 第二章菌种选育、保藏与复壮 菌种选育的方法有：自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程。 一、微生物菌种选育的理论基础 微生物的遗传性和变异性的特点：a、微生物由于繁殖速度快、生活周期短；b、微生物由于个体微小，比表面积大，大多以单细胞或极少分化的多细胞存在；c、微生物大多以无性生殖为主，且营养体多数为单倍体。 诱变育种：人为地将对象生物置于诱变因子中，使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。 （一）突变：微生物的遗传物质存在于变动着得的环境中，染色体上的遗传信息以及染色体组受到环境的作用而改变，这种改变或多或少是永久性的，从生物表型上说是突然发生可遗传的变换，这种变化就称为突变。自发突变：在自然状况下发生的突变，也称自然突变。诱发突变：人为地利用物理或化学因素诱发的突变。（二）诱变的基本原理 1.诱变剂：用来处理微生物并能提高生物体突变频率的这些物理或化学因素成为诱变因素，又称诱变剂。诱变剂有物理诱变因子（紫外线、Ｘ射线）、化学诱变因子（亚硝基胍、亚硝酸、亚硝基甲基胍）生物诱变因子（噬菌体） 2. 诱变剂作用机理物理诱变因子诱变机理：快中子、γ射线、β射线产生电离辐射，而紫外线是不形成离子的非电离辐射。以紫外线为例，紫外线照射后引起的ＤＮＡ结构改变，Ｄ