纤维素酶固体发酵工艺的改良研究
（生命科学学院，生物技术专业黄泽锦）
（学号：2000302063）
摘要：纤维素酶的固体发酵对发酵培养基的要求是很严格的，如培养基灭菌，无菌操作的等等，都是限制纤维素酶应用于生产的一个重要原因。本实验通过一种对细菌抑制效果强，但对霉菌抑制能力一般的抑制剂对发酵过程进行控制，运用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法）来测定羧甲基纤维素酶活（CMCase）及滤纸糖酶活（FPA,FPase）。探讨是否能够实现在培养基未灭菌或者在有菌操作下实现纤维素酶的固体发酵，简化实验对培养基和操作过程的操作要求，进而为纤维素酶的工业化生产提供一定实验依据。
关键词：纤维素酶，抑菌剂，CMCase，Fpase，酶活力
教师点评：本论文应用了自制的抑菌剂于纤维系酶的固体发酶工艺中，有一定抑制细菌的能力，但又不影响霉菌的产纤维素酶的活性，为简化固体发酵工艺探索了一条新的途径，有一定的实用参考价值。（点评教师：余少文，副教授）
一．前言
纤维素占全球植物总干重的30%—50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物[1]，但是，纤维素分子是由葡萄糖分子通过β-1，4糖苷键连接而成的链状高分子聚合物，每个大分子中含的葡萄糖残基数一般为8000--12000个。天然的纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定形区构成，其结晶度一般在30%—80%之间。在植物细胞壁中，纤维素分子聚集成纤维丝，包埋在半纤维素和木质素里，形成网状结构。纤维素分子本身的致密结构以及由木质素和半纤维素形成的保护层造成纤维素不容易降解而难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55x109t，其中有89%尚未被利用或未被合理利用（如直接焚烧）目前全世界被开发利用的农林纤维副产物不足2%，我国约有50%以上的农林废弃物在田间地头被白白烧掉。全世界每年因农林废弃物焚烧不仅造成直接的经济损失达数十亿元，而且由于焚烧而产生的滚滚浓烟及排放的大量有害气体严重影响了公路、航空的安全，污染了环境，对气候、生态等也造成了严重的影响。而同时在另一方面，世界上还有十多亿人口由于粮食不足而遭受饥饿、营养不良。灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁；随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题；由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略已在世界各国逐步展开。植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。
经过多年的实验研究，虽然取得不上成果，但是实验的成本却总是居高不下，使得实验成果不能很好的应用到生产中，本实验通过研究抑菌剂对霉菌的影响，实现的对实验要求的降低。本测试方法对纤维素工业应用中，对控制生产过程、产品质量及降低成本具有一定的实际指导意义。
1.1. 纤维素酶的概述
1.1.1 纤维素酶的组分：一个完整的纤维素酶系，通常由作用方式不同而能相互协同催化
水解纤维素的三类酶组成，即(1)内切葡萄糖苷酶(endo—1，4—β—D—glucanase，EC3．2．1．4，简称EG、Cx)。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β—1，4—糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。(2)外切葡萄糖苷酶(exo—1，4—β—D—glucanase，EC3．2．1．91，C1)，又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，简称CBH)。这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β—1，4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。 (3) β—葡萄糖苷酶(β—glucosidase，EC3．2．1．21，简称BG)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。
1.1.2 纤维素酶的性质：
纤维素酶是将纤维素水解成葡萄糖的一组霉的总称，它不是单种酶，主要有3个组分组成：1，内切葡聚糖酶，即Cx酶；2，纤维二糖水解酶，即C1酶；3，β－葡萄糖苷酶。在适当的条件下，它们协同作用，将天然纤维素水解成葡萄糖。
一般纤维素霉的分子量在45000－75000之间，最适作用温度在50度左右，最适ph4－5之间，由不同的产生菌种所产的纤维素酶在分子量、含糖量、等电点、最适ph、最适温度等方面又有所不同，有的甚至相差较大，而且纤维素酶的各组分大多数是糖蛋白，含糖的比例很不同，糖和蛋白之间的结合方式也不同，有的是通过共价键连接，有的则是可解离的复合物。
纤维素的来源非常广泛，昆虫，软体动物，原生动物，细菌，放线菌和真菌等都能产生纤维素酶。目前研究较多的是霉菌，其中酶活较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和青霉，特别是里氏木霉、康氏木霉等较为典型，是目前公认的较好的纤维素霉产生菌。细菌中酶活力较强菌种有纤维粘菌属，生孢纤维粘菌属和纤维杆菌属，放线菌中有黑红旋丝放线菌，玫瑰色放线菌，纤维放线菌和白玫瑰放线菌等。
天然纤维素的结构即纤维素酶的作用方式：纤维素从组成上来说和淀粉一样，都是由葡萄糖组成，但它是由β－D-1,4-葡萄糖苷键组成的多糖，所以在性质上与淀粉有显著的区别。天然纤维素以直链式结构存在，链与链之间有一定的晶状结构；许多纤维素分子以定形或无定形方式组合成微原纤维，许多微原纤维集束成微纤维，微纤维穿插于填充性物质――半纤维素和木质素之中。纤维素分子是分子很大的多糖，分子量可达数十万甚至百万，不能为微生物细胞直接利用。
纤维素酶的作用方式：首先由内切葡聚糖酶作用于微纤维的非结晶区，使其露出许多末端供外切型酶作用，纤维二糖水解酶从非还原性末端依次分解，产生纤维二糖，然后，部分降解的纤维素进一步由内切葡聚酶和纤维二糖水解酶协同作用，分解成纤维二糖，三糖等低聚糖，最后由β－葡萄糖苷酶作用分解成葡萄糖。
1.1.3 纤维素酶的测定方法：
纤维素酶是一种复合酶，由内切葡聚糖酶(EG或Cx)、外切葡聚糖纤维二糖水解酶（CBH， EC或C1）和纤维二糖酶(CB，β—葡萄糖苷酶)的协同作用下才能水解成葡萄糖。其中各种酶的活性测定方法，目前尚无国家标准。依照酶反应动力学的原则，酶活力的测定是在底物过量存在的条件下，测定酶促反应的初速度，用以表征酶活力
1.1.3.A.测定原酶液中单一纤维素酶组分活力的方法简介
1.1.3.A1.葡聚糖纤维二糖水解酶（CBH）活力测定：
Desphander等以合成的P—nitrophonyl—β—D-cellobiose(PNPC)为底物用于检测CBH活力，由于β—葡萄苷酶可水解对硝基苯酚环上键合的纤维二糖，需同时加人β—葡萄苷酶抑制剂。刘洁等提出一种简易测定CBH的方法．它是基于CBH,EG和CB三类组分在棉纤维上吸附和脱吸附能力不同而设计的，日本还采用微晶纤维素(Avicel)为底物水解得还原糖量计算酶活力，称Avicelase或指CBH活力。但EG组分对Avicel水解程度高，对原配液而言，它反映的是CB，EG和CBH的协同作用结果，对单一组分来说，它是某些EG组分活力。
1.1.3.A
2.内切葡聚糖酶（EG）活力的测定
以还原糖的生成量来表示EG组分活力可以用磷酸膨胀纤维素、羧甲基纤维素或烃乙基纤维素等无定形纤维素为底物，以还原糖生成量表征EG酶活力。特别是羧甲基纤维素价廉易得，且应用广，俗称CMCase或Cx酶活力。粘度法测EG酶活力利用测定高分子溶液粘度从而导出其聚和度和分子量的方法来表征EG活力，它可测得初速度，因而确切反映EG活力，灵敏度较高。
1.1.3.A3.纤维二糖酶（β-葡萄糖苷酶，CB）活力测定
从纤维素酶解机制上考虑，以纤维二糖为底物酶解后测葡萄糖生成量表征酶活力，由于纤维二糖和葡萄糖都具有还原性，通常定糖方法无法区分，常用人工合成的糖昔化合物，如对硝基酚—β—葡萄糖苷(PNPG)、水杨素等作底物测定产生的对硝基酚或葡萄糖。由于各种β—葡萄糖苷酶组份对糖基和糖苷配基专一性的要求有差别，因此得到的结果通称为β—葡萄糖苷酶活，与纤维二糖酶活有所不同。
1.1.3.B.测定纤维素酶液中的糖化或降解活力方法简介
滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法得到广泛应用，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活(FPA)。
目前酶活力的测定方法大致有粘度法、浊度法、滤纸崩溃法和3，5－二硝基水杨酸（DNS）比色法。前两种方法较为复杂而且精密度较差（偏差为10％左右）。本实验对Cx酶活性的DNS比色测定法和滤纸酶活的DNS比色测定法进行了研究。其原理均系利用纤维素酶催化水解纤维素，从而产生纤维多糖，二糖及葡萄糖等还原性糖，与显色剂发应以分光光度计比色，求出还原糖的浓度，间接求出酶的活力。
作为底物的滤纸其结构较为松散，可及区较多，非还原性末端也较多，容易同时被内切酶和外切酶降解，再由β－葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖，用比色法定量测定还原糖的生成量，可反映纤维素酶的总酶活力，由于外切酶对纤维素链专一性高，而内切酶专一性较低，在降解羧甲基纤维素（CMC）时，主要是反映内切酶的活力。
1.1.4 纤维素酶的应用：
纤维素酶在植物纤维再生利用方面起着重要作用。
1.2 里氏木酶：
里氏木酶是真菌的一种，属于半知菌类、丝孢纲、木酶属。木酶的菌落生长迅速，棉状或致密丛束状。菌丝透明，有隔，分枝茂密。木酶广布于自然界。在腐烂的木材，种子，植物残体，有机肥料，土壤和空气都能分离到。木酶的利用范围很广泛，某些种和菌株含有强的纤维素酶。一般情况下，在木酶生长的第二天起，由于受到诱导物的作用，就会有纤维素酶的出现，而到了第三天，纤维素酶的量就会开始增加、囤积、到了第五、六天，纤维素酶就会出现最大值。之后，随之菌种的死亡，纤维素酶的量也会随之减少。
固体发酵：
1.3
固体发酵流程：菌种平板――摇瓶――种曲――固体发酵
固体发酵条件环境更接近于自然状态下的木酶生长习性，使其产生的酶系更全，有利于降解天然纤维素。
1.4 酶活：
在规定条件下，0.5g固体酶曲1min内由底物产生底葡萄糖微克数。
二．实验材料与方法
1．主要仪器与试剂
1．1 主要仪器
HZS-H水浴振荡器，HZQ-C空气浴振荡器，HZQ-F160全温振荡培养箱，SW-CF-IF洁净工作台，TGL-16G高速台式冷冻离心机，PB203-N电子天平，752N型紫外可见分光光度计，电炉。
1．2 主要试剂
1． DNS试剂（3，5-二硝基水杨酸试剂）
将7.5g的3，5-二硝基水杨酸和14.0g的氢氧化钠充分溶解于1000ml水中，加入216酒石酸钾钠，5.6ml（或5g）预先在50°C水浴中熔化的苯酚，以及6.0g偏重亚硫酸钠，充分溶解后盛于棕色瓶中，放置3~5d后使用。
2．0.1%CMC-Na（羧甲基纤维素钠）水溶液
把称好的CMC-Na慢慢加入温水中同时用力搅拌，溶解后形成均匀胶状液，静置过夜，使用前摇匀。
3．0.1M，pH5.0 HAc-Nac 缓冲液
4．生理盐水（0.9% NaCl 溶液）
5. 抑菌剂
1．3 培养基
1．固体平板培养基
马铃薯20g，葡萄糖10g，琼脂15~20g，H2O1000ml，于121°C灭菌20分钟，冷却后
倒平板。
2．液体种子培养基
Mandels营养盐浓缩液100ml，Mandels微量元素浓缩液1.0ml，葡萄糖10g，蛋白胨1.0g，土温50 1.0~2.0g/l，1M柠檬酸缓冲液50ml，H2O1000ml，混匀后与121°C灭菌20分钟。
其中：
Mandels营养盐浓缩液：（NH4）2SO4 14g，KH2PO4 20g，CaCl2?2H2O 4g，尿素（脲）3g，MgSO4?7 H2O 0.2g ，H2O1000ml
Mandels微量元素浓缩液：FeSO4?7 H2O 5g，MnSO4?H2O 1.6g，ZnSO4?7 H2O 1.4g，CoCl2?6 H2O 3.7g，H2O1000ml
1M柠檬酸缓冲液：柠檬酸（C6H8O7?H2O）210g，H2O750ml，加NaOH78g，冷却后测PH约为4.2，最后加水至1000ml，PH应为4.45
3．固体发酵培养基：
稻草粉70g，麸皮30g，尿素（脲）0.5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4? 7 H2O 0.2g，H2O200ml （固体：液体=1：2），培养基的PH值一般为4.5，将培养基成分充分混匀后于121°C湿热灭菌40~60分钟。
2．材料与方法
2．1 菌种：30mins紫外处理USA菌株
2．2 抑菌剂浓度：0.5%抑菌剂
2．3 实验方法
2.3.1 培养条件
1）抑菌剂浓度的确定：配制浓度为0.05%、0.1%、0.5%、1%、10%抑菌剂浓度于已灭菌土豆PDA平板培养基中，在无菌的条件下和有菌条件分别用接种环挑取菌种，
用适量生理盐水（0.5ml）将菌种稀释，并将菌种（100μl）接入到平板上，在30
°C下恒温培养至少3天，观察发现，高于0.5%浓度抑菌剂的菌种不会生长，而
有菌操作条件下的，0.01%和0.1%浓度抑菌剂的菌种发现有杂菌生长。但发现，
0.5%抑菌剂中菌种生长期延迟2天，故选用0.5%浓度抑菌剂为最佳抑菌剂浓度。
2）孢子的制备：在有菌的条件下用接种环挑取菌种，用适量生理盐水（0.5ml）将菌种稀释，并将菌种（100μl）接入到已灭菌的含0.5%抑菌剂土豆PDA培养平板上，
在30°C下恒温培养至少5天，待孢子成熟后于4°C冰箱中保存备用。
3）接种物的制备：将培养好的孢子接入含0.5%抑菌剂浓度的液体种子培养基中，在30°C好氧条件下培养48h，使菌丝量达6~8g/l，然后按10%（V/W）用量接种。
将其放进4°C冰箱里保存备用。
2.3.2固体发酵：在茄子瓶装入已灭菌的含有0.5%抑菌剂浓度的固体发酵培养基，接种后放
入培养室中，在30°C下培养3--7天，定时取样测定酶活力。
2.3.3纤维素酶酶活力的测定
纤维素酶是由外切β-1，4葡聚糖酶（C1酶）、内切β-1，4葡聚糖酶（C X酶）和β-葡聚糖苷酶组成的一种复合型水解酶。本实验采用了CMC糖化力和滤纸糖化力来表示纤维素酶的酶活力。C X酶在适当PH值和温度下，水解羧甲基纤维素钠（CMC）释放出的还原性葡萄糖与DNS反应，发生颜色变化，显色基团在540nm处的吸光度与释放出的葡萄糖量成正比，即与纤维素酶制剂中的C X酶活性成正比。而滤纸糖化力是指纤维素酶作用于滤纸后也产生还原糖的能力。
①葡萄糖标准曲线的制备：
准备称取于80°C烘干恒重过的无水葡萄糖 1.000g，用水定容至1000ml。准确吸取1mg/ml葡萄糖标准溶液配制成浓度分别为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的一系列标准溶液，取6支25ml具塞试管，分别加入1ml上述标准糖液和3mlDNS试剂，混匀后于沸水中保温10min，冷却后补水至25ml。充分摇匀，在540nm处测定吸光值A，以葡萄糖浓度为纵坐标，A为横坐标，作出标准曲线。
②酶液的制备：称取0.5g固体菌，加25ml蒸馏水，50°C恒温水浴振荡45分钟，使酶蛋
白充分释放，然后在6000r/min、4°C条件下离心10min，取上清液测定酶活力。
③羧甲基纤维素酶活力的测定：
i. 糖化：在试管中加入0.1%CMC-Na 2ml，蒸馏水2ml，pH5.0的HAc-NaAc 2ml，
酶液1ml（总共7ml），于50°C恒温水浴糖化30分钟。
ii. 显色：在试管中取糖化液1ml和3mlDNS，混匀后于沸水中保温10min，冷却后补水至25ml，充分摇匀，在540nm处测定吸光值A（空白对照为已煮沸灭
活的酶液），然后根据标准曲线即可求得相应的还原糖含量C，按下式求得U：
N×C×103
U = ——————[μg/min?ml]
T×V
N：酶液稀释的倍数（25×7）T：酶介所用的时间（30min）
V：酶液的量（1ml）
④滤纸酶活力的测定：
i. 标准曲线的制定：因方法与CMC有别，而重新测定标准曲线：准确吸取1mg/ml
葡萄糖标准溶液配制成浓度分别为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的一系
列标准溶液，取6支具塞试管，分别加入1ml上述标准糖液和3mlDNS试剂，
混匀后于沸水中保温10min，冷却后充分摇匀，在540nm处测定吸光值A，
以葡萄糖浓度为纵坐标，A为横坐标，作出标准曲线。
ii. 糖化与显色：在试管底部预先加入一张重0.05g的滤纸，加入0.1M，pH5.0 HAc-Nac 缓冲液2ml和酶液1ml，混匀后于50°C恒温水浴糖化1小时。在
试管中取糖化液1ml和3mlDNS，混匀后于沸水中保温10min，冷却后充分摇
匀，在540nm处测定吸光值A（空白对照为已煮沸灭活的酶液），然后根据标
准曲线即可求得相应的还原糖含量C，按下式求得U：
N×C×103
U =——————[μg/min?ml]
T×V
N：酶液稀释的倍数（25×3）T：酶介所用的时间（60min）
V：酶液的量（1ml）
2.3.4酶活力定义：
a) CMCase酶活力单位：以CMC为底物，在反应条件（50°C，pH5.0，恒温30min）
下，以水解反应中每分钟催化纤维素水解成1.0μg葡萄糖（以还原糖表示）的酶
量为一个单位U。
b) Fpase酶活力单位：以滤纸为底物，在反应条件（50°C，pH5.0，恒温1h）下，以
水解反应中每分钟催化纤维素水解成1.0μg葡萄糖（以还原糖表示）的酶量为一
个单位U。
三．结果与分析
1 葡萄糖标准曲线：用DNS法测糖，不同的葡萄糖含量在540nm的吸光度不同，测得的结
果如下：
①CMCase的标准曲线：
葡萄糖含量（mg） 0 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 A5400 0.096 0.227 0.340 0.494 0.585
②Fpase的标准曲线：
葡萄糖含量（mg）0 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 A5400
0.440 1.590 2.432 3.410 3.838
2 抑菌剂对菌株生长条件的影响
2.1 加了0.5%抑菌剂的发酵培养基与常规发酵对比
2.1.1 CMCase酶活力
3 4 5 6 7
常规
1814.465 2664.672 2032.201 1441.204 1866.307
ug/(min.ml)
抑菌剂0.5%
1907.781 2954.986 1690.045 1710.782
1783.36
ug/(min.ml)
2.1.2Fpase酶活力
3 4 5 6 7
常规
92.40905 172.2014 84.56621
ug/(min.ml)
抑菌剂0.5%
113.8916 158.2207 -30.6894
ug/(min.ml)
实验结果表明，加入了抑菌剂并没有影响其产酶活性，并且产酶高峰期提前24h,为抑菌
剂的使用提供了前提条件。
2.2 加了0.5%抑菌剂的灭菌发酵培养基无菌操作和有菌操作
2.2.1 CMCase酶活力
3 4 5 6 7
有菌操作
943.522 1721.15 487.3136 1233.836 943.522
ug/(min.ml)
无菌操作
1793.729 2488.41 1088.679 1171.626
891.6801
ug/(min.ml)
2.2.2 Fpase酶活力
3 4 5 6 7
有菌操作
-22.8465 83.54323 52.1719 161.2896 133.3282 ug/(min.ml)
无菌操作
103.3208 127.8723 105.3668 97.18294 17.39063
ug/(min.ml)
实验结果表明，都加入了抑菌剂的有菌操作最高CMCase酶活力1721.15μg/min?ml 比无菌操作最高CMCase酶活力2488.41μg/min?ml会略低，但是有菌操作最高Fpase酶活力161.2896μg/min?ml比无菌操作最高Fpase酶活力127.8723μg/min?ml提高了,且无菌操作的Fpase酶活力延迟了24h.
2.3 没有灭菌但0.5%加抑菌剂的土豆培养基、液体培养基、发酵培养基有菌操作和无菌操作
实验现象：没有灭菌的发酵培养基，即使加了抑菌剂，菌种不会生长。
2.4 加了0.5%抑菌剂的灭菌土豆培养基与常规比较
实验现象：加了0.5%抑菌剂土豆培养基菌种生长缓慢，生长期延迟48h
2.5 加了0.5%抑菌剂的灭菌液体培养基与常规比较
实验现象：加了0.5%抑菌抑的液体培养基产生的菌种体积明显小于常规培养的
2.6 加了0.5%抑菌剂的灭菌土豆培养基、液体培养基的无菌操作和有菌操作比较
实验现象：有菌操作会出现极少量的杂菌。
四. 讨论
1、本实验虽然不能够做到在固体发酵培养基未灭菌下进行实验，但是成功的达到了利用抑
菌剂简化了实验操作要求，降低了实验成本，为以后纤维素酶的工业生产提供了一定实验数据。
2、本实验采用的新工艺与传统工艺对比，主要体现不用其他微量元素，采用与传统工艺相
同的培养基配方，利用适当浓度的抑菌剂成功的脱离了无菌操作繁琐的过程；降低了对工作人员专业技术的要求；同时也降低了对实验器材的无菌要求。虽然本次实验没有达到对固体发酵培养基不灭菌发酵的要求，但是在实验过程中发现，如果不对发酵培养基灭菌，菌种根本不会生长，本次实验的发现，为以后的实验提供了一些借鉴。
3、从实验的结果来看，利用0.5%浓度抑菌剂可以实现实验操作过程的要求，虽然实验过程
有极少量的杂菌出现，而且抑菌剂对菌种的孢子期和液体种子培养期有一定的影响，但是并不会影响其酶活性。相反，在发酵期间的抑菌剂对Fpase酶活力还有一定的促进作用。
4、在以后的实验中，可以通过其他一些简便的方法对培养基进行处理，使得其物理化学成
分可以达到与灭菌后一样，这样，就可以更好的降低成本，为将来的工业化生产奠定基础。
在这次实验里可以得出几个结论：
1. 0.5%浓度的抑菌剂是最佳抑菌剂浓度，过低，会有大量杂菌生长，过高，同时会抑制木
霉的生长；
2. 抑菌剂虽然会对菌种的生长有影响，但是并不会影响其活性；
3. 使用抑菌剂后可以使得实验在有菌环境中操作；
4. 抑菌剂的使用前提是：培养基必须灭菌，不能使用未灭菌培养基，使用未灭菌培养基，菌株在固体发酵培养基中不能生长。在液体发酵培养基中会产生混浊现象，但是没有活性。
参考文献：
[1]. 周德庆.微生物学教程；
[2]. 张树正.酶制剂工业(下册):595-623；
[3]. 刑来君,李明春.普通真菌学:421-422；
[4]. 邱雁临.纤维素酶的研究和应用前景.粮食与饲料工业.2001-8：30-31；
[5]. 张继泉、王瑞明.绿色木霉生产纤维素酶的进展.山东食品发酵.2001-4：12-15；
[6]. 张丽萍.钱磊等.绿色木霉固态发酵产纤维素酶条件及酶性质的研究.河北省科学院学报，2000，5-17（2）：
120-123；
[7] 宋向阳，毛连山.以里氏木霉制备纤维素酶的研究.化工纵横.2000-12：11-13；
[8] 邬敏辰，李江华.里氏木霉固体发酵生产纤维素酶的研究.江苏食品与发酵.1998-2：2-6；
[9] 夏黎明，余世袁.固定化里氏木霉制备纤维素酶的研究.南京林业大学学报.1993，6-17（2）：1-6；
[10] 管斌，谢来苏等.里氏木霉纤维素酶高产菌株发酵特性的测试.中国酿造.2000-5：14-16；
[11] 李冬玲，李敏等.利用固态发酵法生产纤维素酶及其应用的探讨.酿酒.2002，7-29（4）：38-39；
[12] 傅力，丁友肪等.纤维素酶测定方法的研究.新疆农业大学学报.2000，23（2）：45-48；
[13] 张瑞萍.纤维素酶活力测定方法.南通工学远印染.2000-8：38-39；
[14] 王建.利用分光光度法测定纤维素酶中C X酶活性.河南农业科学.200-10：31-32；
[15] 刘妙莲，王洁.影响纤维素酶活力测定的几个因素.食品与发酵工业.2000，26（6）：37-39；
[16] 林开江，陈兵.减少测定纤维素酶误差的研究.浙江农业科学.1995，2：55-57；
（指导老师余少文副教授）
谷氨酸发酵工艺和发展运用 摘要生产味精谷氨酸之类氨基酸的发酵，区别于传统的酿酒和抗菌素发游，是一种改变微生物代谢的代谢控制发酵。本文则就谷氨酸发酵生产过程、谷氨酸发酵机制，说明谷氨酸发酵的发展。关键词：谷氨酸；发酵；工艺；研究；发展 刖言 谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵。谷氨酸的大量积累不是由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及发酵条件的适合【1】。 谷氨酸产生菌主要是棒状类细菌，这类细菌中含质粒较少，而且大多数是隐蔽性质粒，难以直接作为克隆载体，而且此类菌的遗传背景、质粒稳定尚不清楚，在此类细菌这种构建合适的载体困难较多。需要对它们进行改建将棒状类细菌质粒与已知的质粒进行重组，构建成杂合质粒。受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株，特别是选用谷氨酸缺陷型变异株为受体，便于从转化后的杂交克隆中筛选产谷氨酸的个体，用谷氨酸产量高的野生菌或变异菌作为受体效果更好。供体菌株选择短杆菌及棒杆菌属的野生菌或变异株，只要具有产谷氨酸能力都可选用，但选择谷氨酸产量高的菌株作为供体效果最好。这样就可以较容易地在棒状类细菌中开展各项分子生物学研究。有了合适的载体及其转化系统后，就可通过DN林外重组技术【2】进行谷氨酸产生菌的改造。这对以后谷氨酸发酵的低成本、大规模、高质量有较大的发展空间。【3】
1.谷氨酸发酵的工艺流程 菌种的选育，培养基配制，斜面培养，一级种子培养，二级种子培养，发酵（发酵过程参数控制通风量、pH温度、泡沫），发酵液。 1.1菌种棒状杆菌属谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum ）：生物素缺陷型、温度敏感型；北京棒杆菌、钝齿棒杆 菌；短杆菌属：黄色短杆菌、天津短杆菌。 1.2培养基 1.2.1 .保藏斜面培养基： 牛肉膏l %，蛋白胨l %，氯化钠0.5 %，琼脂2%, PH7.0。 1.2..2活化斜面培养基： 葡萄糖0.1 %，牛肉膏l %，蛋白胨l %，氯化钠0.5 %，琼脂2%, pH7.0。 1.2..3一级种子培养基： 葡萄糖2.5 %，玉米浆3.1 %;,尿素0.55 %，磷酸氢二钾0. 12%，硫酸镁 0.06 %, PH7.0。 1.2.4摇瓶初筛发酵培养基： 葡萄糖12%,玉米浆0.8 %，磷酸二氢钾0.2 %,硫酸镁0.04%, PH7.0。 1.2.5摇瓶复筛发酵培养基： 葡萄糖18%，玉米浆0.5 %，甘蔗糖蜜0.15 %，磷酸二氢钾0.2 %, 硫酸镁 0.04 %. PH7.0。 1.3斜面培养斜面菌种：32?33C培养，22h。 1.4 一级种子培养32 —33C培养，往复式摇床，冲程76mm转速100r/min, 9h。 1.5 发酵培养往复式摇床，冲程80mm装量：20ml/500ml三角瓶。接种量：5%。转速：前期100r/min,第一次加尿后125rJmin。 温度：前期32—33C,后期34—350G转速：前期100r/min，后 期125dmin。pH: 40%尿素控制。
主要研究开发与服务：果品加工工艺技术研究与开发；果酒、果醋加工工厂设计。主要开发产品目录：各色水果饮料、果酒、果醋、莲子乳、板栗乳、复合果蔬饮料、浓缩果蔬汁、果酱、果脯、凉果、果干、果蔬脆片、水果泥、水果粉等。（一）果酒生产技术 果酒生产主要包括传统发酵法、浸泡法、发酵与浸泡结合法。 传统发酵方法是指果浆或果汁经自然酵母或人工培养酵母，在一定条件下，直至糖分耗尽，发酵自然终止的方法。一般由于含汁多的水果如：葡萄、苹果、梨、猕猴桃等均可采用此发酵法。这种方法有下面几个特点：(1)发酵法是酿制干型果酒唯一的有效方法，(2)发酵结束之后，残留糖分很低，每升原酒含糖分在4克以下，便于原酒贮藏和管理；(3)原酒成熟快，口味醇和丰满，后味绵长，酒香优美，(4)发酵全过程因时间较长，原酒中无糖分，浸出物比较丰富，(5)果实香气浓郁，工艺比较复杂。 浸泡法是随着酒精工业的发展，而出现的稀释酒精浸泡果实的方法。—般含汁比较少的水果，如：山楂、酸枣、红枣、戈力等比较适宜采用此方法。浸泡法的特点是：(1)操作简便；(2)能够保持水果的新鲜香气；(3)色泽较好，(4)成本低，(5)由于酒度较高，贮存中不易遭受生物侵袭，(6)能够加速部分物质成分的溶解，减少果胶物质的溶解，稳定性较好，但是往往出现滋味欠醇和丰满及酒精刺舌感。 发酵与浸泡结合法一般是是采用发酵工艺制取原酒，同时采取浸泡制取原酒，然后立即将两种原酒合二为一，结合在一起，在室温15~16℃，进行贮存。也可以采取分别贮存一定时间，然后，按照配酒需要临时按比例混合。总之，这种办法兼顾了浸泡法和传统发酵法的优点，又可以避开二者的不足，按照产品特点，可随时调整某种原酒用量。这种结合方法，适合制作果香、酒香二者兼备，成分适中的甜型，半甜型及半干型的果酒。 另外采用果实先浸泡，制取浸泡原酒后，在果渣中兑入糖水，接进人工培养的酵母进行发酵，制取发酵原酒，二种原酒进行合并。这种方法的特点是果香好，发酵安全，平稳，适合于含汁量少的果品加工，可以制作甜型、半甜型果酒。 也可将果实先经发酵，放出原酒之后，将皮渣再用浸泡法制取浸泡原酒，二种原酒进行合并。这种方法的特点是原料利用率高，适合制作含糖或不含糖的果酒。（二）利用水果酿制果醋 水果含糖量较高，营养丰富，风味好，是酿制食醋的理想原料，水果酿醋和粮食酿醋相比有其独特的优越性。 1、节粮 酿造业发展的方向之一是以果代粮，目前生产食醋的主要原料是大米、玉米、高粱、甘薯等，利用水果为原料代替粮食酿制果醋可节约粮食。 2、能充分利用水果资源 果醋酿造对原料要求较粗放，质量好的差的，甚至果加工厂的下脚料果皮、果屑、果心等均可，因此酿制果醋能充分利用水果资源，减少浪费，变废为宝，利国利民。另外果醋生产还可开发野生水果资源，我国很多地区存在着野生果实资源，野生果实大都生长在深山密林中或旷野沙丘上，完全是自然生长没有任何污染，所含维生素特别丰富，如加以采集酿制果醋，不仅能充分利用野生资源，增加农民收入，而且还可生产出绿色保健果醋。 3、果醋的风味好 水果中含有的果酸是不挥发性有机酸，风味优良，果酸进入果醋改变了果醋中不
氨基酸发酵工艺学要点 1味精厂的主要生产车间：糖化车间、发酵车间、提取车间、精制车间 2淀粉生产的流程 原料→清理→浸泡→粗碎→胚的分离→磨碎→分离纤维→分离蛋白质→清洗→离心分离→干燥→淀粉3淀粉的液化及糖化定义。 在工业生产上，将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的“糖化”所制的的糖液称为淀粉水解糖 液化是利用液化酶使淀粉糊化，黏度降低，并水解到糊精和低聚糖的程度 4淀粉液化过程使用淀粉酶，水解位置1，4糖苷键，糖化过程使用糖化酶，水解位置1，4糖苷键和1，6糖苷键。 5液化结束后，为何要进行灭酶处理，如何操作？ 液化结束后反应快速升温灭酶，高温处理时，通过喷射器快速升温至120~145°，快速升温比逐步升温产生的“不溶性淀粉颗粒”少，所得的液化液既透明又易过滤。淀粉出糖率高，同时由于采取快速升温法，缩短了生产周期 6葡萄糖的复合反应。 7淀粉的糊化、老化定义及影响老化的因素。 （1）糊化 若将淀粉乳加热到一定温度，淀粉颗粒开始膨胀，偏光十字消失。温度继续上升，淀粉颗粒继续膨胀，可达原体积几倍到几十倍。由于颗粒的膨胀，晶体结构消失，体积膨胀大，互相接触，变成糊状液体，虽然停止搅拌淀粉也不会再沉淀，这种现象称为糊化。 （2）老化 分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列成为新氢键的过程。 （3）影响老化的因素①淀粉的成分（直链易老化，支链淀粉难老化）②液化程度③酸碱度④温度⑤淀粉糊浓度 8 DE值与DX值的概念. DE值表示淀粉水解程度或糖化程度。也称葡萄糖值 DE=还原糖浓度/（干物质浓度*糖液相对密度）*100％ DX值指糖液中葡萄糖含量占干物质的百分率。 DX=葡萄糖浓度/（干物质浓度*糖液相对密度）*100％ 9淀粉水解糖的质量要求有哪些？ 1糖液透光率＞90%（420nm）。2不含糊精、蛋白质（起泡物质）。3转化率＞90%。DE值（Dextrose equivalent，葡萄糖当量值）4还原糖浓度：18%左右。5糖液不能变质。6pH4.6-4.8 10 说说酸水解法、酸酶法和酶水解法三种不同水解工艺的优劣？ 酸水解法是利用无机酸为催化剂，在高温高压下，将淀粉转化为葡萄糖的方法。该法具有工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快的优点。该水解法要求耐腐蚀，耐高温，耐压的设备。 酸酶法是先将淀粉用酸水解成糊精或低聚糖，然后再用糖化酶将其水解为葡糖糖的工艺。采用酸酶法水解淀粉制糖，酸用量少，产品颜色浅，糖液质量高 酶水解法主要是将淀粉乳先用α-淀粉酶液化，过滤除去杂质后，然后用酸水解成葡萄糖的工艺。该工艺适用于大米或粗淀粉原料 11 固定化酶的定义及制备方法有哪几种？ 固定化酶（immobilized enzyme）：由于水溶性酶的缺点,所以将它与固相载体相连,由固相状态催化反应,称酶的固定化. ①吸附法②偶联法③交联法④包埋法 12生物素对谷氨酸生物合成途径影响。 1.生物素对糖代谢的速率的影响（主要影响糖降解速率）
各种氨基酸的生产工艺 1、谷氨酸 (1)等电离交工艺方法——从发酵液中提取谷氨酸，即将谷氨酸发酵液降温并用硫酸调PH值至谷氨酸等电点(pH3.0- 3.2)，温度降到10 以下沉淀，离心分离谷氨酸，再将上清液用硫酸调pH至1.5上732强酸性阳离子交换树脂，用氨水调上清液pH10进行洗脱，洗脱下来的高流分再用硫酸调pH1.0返回等电车间加入发酵液进行等电提取，离交车间的上柱后的上清液及洗柱水送去环保车间进行废水处理。 该工艺方法的缺点是：废水量大，治理成本高，酸碱用量大。 (2)连续等电工艺——将谷氨酸发酵液适当浓缩后控制40℃左右，连续加入有晶种的等电罐中，同时加入硫酸，控制等电罐中PH值维持在3.2左右，温度40℃进行结晶。 该工艺方法废的优点是：水量相对较少；缺点是：氨酸提取率及产品质量较差。 (3)发酵法生产谷氨酸的谷氨酸提取工艺——谷氨酸发酵液经灭菌后进入超滤膜进行超滤，澄清的谷氨酸发酵液在第一调酸罐中被调整pH值为3.20～3.25，然后进入常温的等电点连续蒸发降温结晶装置进行结晶，分离、洗涤，得到谷氨酸晶体和母液，将一部分母液进入脱盐装置，脱盐后的谷氨酸母液一部分与超滤后澄清的谷氨酸发酵液合并；另一部分在第二调酸罐中被调整pH值至4.5～7，蒸发、浓缩、再在第三调酸罐中调pH值至3.20～3.25后，进入低温的等电点连续蒸发降温结晶装置，使母液中的谷氨酸充分结晶出来，低温的等电点连续蒸发降温结晶装置排出的晶浆被分离、洗涤，得到谷氨酸晶体和二次母液。(4)水解等电点法 发酵液-----浓缩（78.9kPa，0.15MPa蒸汽）----盐酸水解（130 ℃，4h ）----过滤-----滤液脱色-----浓缩-----中和，调pH至3.0-3.2（NaOH或发酵液） -----低温放置，析晶-------谷氨酸晶体 此工艺的优点：设备简单、废水量减少、生产成本低、酸碱用量省 (5)低温等电点法 发酵液-----边冷却边加硫酸调节pH4.0-4.5-----加晶种，育晶2h-----边冷却边加硫酸调至pH3.0-3.2------冷却降温------搅拌16h------4 ℃静置4h------离心分离 --------谷氨酸晶体 此工艺的优点：设备简单、废水量减少、生产成本低、酸碱用量省 (6)直接常温等电点法 发酵液-----加硫酸调节pH4.0-4.5-----育晶2-4h-----加硫酸调至pH3.5-3.8------育晶2h------加硫酸调至pH3.0-3.2------育晶2h------冷却降温------搅拌16-20h------沉淀2-4h-------谷氨酸晶体 此工艺的优点：设备简单、操作容易、生产周期短、酸碱用量省。 2、L-亮氨酸 （1）浓缩段 原料：蒸汽 将一次母液通入浓缩罐内，通入蒸汽，温度120度，气压-0.09Mpa，浓缩时间6h，结晶。终点产物：结晶液（去一次中和段） （2）一次中和段 辅料：硫酸，纯水 结晶液进入一次中和罐，通入硫酸，纯水，温度80，中和时间4h，过滤 终点产物：1，滤液（回收利用）2，滤渣（去氨解段）
生物科学与工程学院—— 果 醋 的 发 酵 及 其 酿 制 生科1202 1212014033 孤独鳏寡
果醋的发酵及其酿制 生科1202 摘要：食醋是人们日常生活中不可缺少的调味品。作为食醋之一，果醋是以果实、果渣或果酒为原料酿造而成的。果醋含醋酸 5%~7% ，与粮食醋相比，具有更好的芳香风味、更丰富的无机盐和维生素，以及更加良好的保健作用。目前，我国用水果酿醋的企业不多、规模不大。果醋在欧美及日本发展很快，如英国苹果醋年产量达 0.1 亿 L、占食醋年总产量的 10%，美国的苹果醋年产量占食醋年总产量的 16.6%。我国水果资源丰富，若用果实、果渣、残次果、果酒脚作为原料酿制果醋，一方面可充分利用果品资源，节约粮食；另一方面在果品产业化生产及综合利用上也具有积极的意义。本文主要从果醋发酵的基本原理和制作的方法以及对果醋的发酵进行阐述。 关键词：苹果醋；酒精发酵；醋酸发酵； Abstract:the vinegar is an indispensable condiment in People's Daily life. As one of the vinegar, fruit vinegar is a fruit or fruit wine, fruit slag as raw material brew. Fruit vinegar contains acetic acid 5% ~ 7%, compared with the food vinegar, better aromatic flavor, more abundant inorganic salt and vitamin, and better health care effect. At present, the use of fruit vinegar enterprises small, small. In Europe and the United States and Japan to develop soon, fruit vinegar, such as the UK apple cider vinegar annual production of 010 million L, 10% of the total in the vinegar production, apple cider vinegar production in the United States accounted for 16.6% of the vinegar annual production. Abundant fruit resources in our country, if use fruit, fruit slag as raw materials, defect fruit, fruit wine foot brewed fruit vinegar, on the one hand, can make full use of fruit resources, saving food; On the other hand on the industrialization of fruit production and comprehensive utilization also has the positive significance. This article mainly from the basic principle of fruit vinegar fermentation and production methods, and elaborates the fermentation of fruit vinegar. Key words: apple cider vinegar; Alcoholic fermentation; Acetic acid fermentation. 苹果醋具有防止动脉硬化和降血压、促进肠胃消化、增强食欲、防止肠胃疾病、消除或减轻疲劳的功效H o，在国内具有良好的开发前景.据统计,我国形形色色的醋!包括传统醋!保健醋和果醋的人均年消费量为0.19kg,而日本为7.88kg,美国为6.51kg,仅相当于日本的
目录1.谷氨酸发酵生产工艺简介 1.1工艺流程 1.2工艺参数 1.3工艺要求 2串级控制系统特点与分析 2.1串级系统特点 2.2串级控制结构框图及分析 3控制方案 3.1总体方案 3.2系统放图 3.3待检测点的控制系统流程图 4仪表的选型 4.1热交换器 4.2仪表清单 5控制算法选择 5.1控制规律 5.2调节器正反作用的选择 6总结 7参考文献 附图
串级控制系统-----两只调节器串联起来工作，其中一个调节器的输出作为另一个调节器的给定值的系统。 例：加热炉出口温度与炉膛温度串级控制系统 1. 基本概念即组成结构
串级控制系统采用两套检测变送器和两个调节器，前一个调节器的输出作为后一个调节器的设定，后一个调节器的输出送往调节阀。 前一个调节器称为主调节器，它所检测和控制的变量称主变量（主被控参数），即工艺控制指标；后一个调节器称为副调节器，它所检测和控制的变量称副变量（副被控参数），是为了稳定主变量而引入的辅助变量。 整个系统包括两个控制回路，主回路和副回路。副回路由副变量检测变送、副调节器、调节阀和副过程构成；主回路由主变量检测变送、主调节器、副调节器、调节阀、副过程和主过程构成。 在该反应中，主要控制的指标是釜温。但由于测量元件的测量滞后，以及由于测量套管插入其内，在套管的外表面有反应发生，很容易造成釜温的假象。因此在升温-恒温控制的过程中需要热水和冷水的交换切换，以便使谷氨酸发酵充分反应，提高产品质量。 主、副变量，主、副控制器（调节器），主、副对象，主、副检测变送器，主、副回路。 作用在主、副对象上的干扰分别为一、二次干扰 系统特点及分析 * 改善了过程的动态特性，提高了系统控制质量。 * 能迅速克服进入副回路的二次扰动。 * 提高了系统的工作频率。 * 对负荷变化的适应性较强 串级控制系统的特点：
果醋的研究与开发 果醋是继食醋之后新一代的调味品，含有丰富人体所必需的钾、锌等微量元素，维生素，多种有机酸以及人体所需的氨基酸，具有调节酸碱平衡、降低血脂和胆固醇、增强免疫力、促进血液循环、抑制血糖升高、开胃消食解酒保肝、抗菌消炎、开发智力、美容护肤延缓衰老、减肥等生理功能。在注重质量、崇尚健康的现代社会，果醋势必为社会所推崇，具有广阔的市场空间。巨大经济利益和社会效益凸显了果醋开发的重要意义。 当前国内围绕果醋的研究，主要集中于果醋的开发工艺，包括选育酵母菌和醋酸菌、优化发酵工艺、澄清剂和澄清方法的研究等，针对不同果醋的工艺优化尤其受到重视。虽然各类果醋品种繁杂，但大多停留于实验室阶段，应用于工业化生产的研究较少。国外果醋开发研究主要是围绕工业化生产模型的建立和应用，果醋成分测定及方法研究，酵母菌和醋酸菌的研究以及仪器分析和数理分析测定抗氧化活性等功能性作用和挥发性物质。 一、果醋工艺研究进展 1、菌种 目前还没有针对果醋的专门酵母菌，国内酒精发酵多选用葡萄酒酵母。但是单一菌种发酵会影响产品的风味，产品质量也不稳定。而多菌共发酵可以有效改善产品风味，提高产品稳定性。国内醋酸发酵采用的醋酸菌大多为食醋菌种，主要是醋酸菌AS1.14 和沪酿1.01，相比于混合菌，其应用于果醋生产，产酸能力欠佳。 为了提高果醋产量，改善产品风味，当前的工作主要集中于从自然界分离培养高效专一菌种和对现有菌种进行诱变选育。 2、发酵工艺 果醋生产主要工序是酒精发酵和醋酸发酵。酒精发酵中，影响酒精产量的因素主要有氮源、糖度、温度、接种量、初始ｐＨ以及发酵时间等。醋酸发酵中，温度、接种量、初始酒度、装液量、通风量、初始ｐＨ对醋酸产量有不同影响。目前，工艺优化的研究主要是选取３～４个变量进行研究，主要是酒精发酵阶段的接种量、糖度、温度和时间以及醋酸发酵阶段的接种量、酒精度、温度和时间。 人们也对菌种固定化发酵的工艺优化进行了研究。在众多果醋发酵工艺优化中，响应面法和正交试验被广泛采用，确定最佳工艺条件。 3、发酵方法 果醋发酵根据发酵状态可分为全固态发酵法、全液态发酵法和前液后固发酵。全固态发酵法作为传统的制醋方法，酿造的果醋风味好，操作简便，但由于卫生条件相对差，劳动强度大，生产周期长，产醋也不高，所以其并不适合于果醋机械化生产，因此围绕全固态发酵的研究并不多。另外，由于要加入辅料与填充物，口感也不佳。 全液态发酵法培养条件易控制、卫生条件好、原料利用率高、质量稳定，易于操作管理，可规模化、标准化生产。目前在果醋的机械化生产中，果醋的酿造方法以全液态发酵法为主。全液态发酵法又分为液态表面静置发酵法、液态深层发酵法、液态浇淋发酵法等方法。 液态表面静置发酵法是在醋酸发酵的过程中静置发酵，该法发酵时间较长，但是果醋酸味柔和，口感优于液态深层发酵法，并且形成了含量较多的包括酯类（如乳酸乙酯）在内的多种风味物质。 表面静态发酵的优点：第一，易操作，能耗低；第二，发酵过程易于控制。第三，后续处理快捷方便，无废水排放。尽管如此，表面静态发酵法也有不足之处：第一，生产过程中在敞口容器中制备醋种，容易受污染，因此不适合于无菌要求严格的制品的生产；第二，所需的资金投入大。表面静态发酵法规模化生产能减少劳动成本，但是较高的设备要求，也推动投资的增大；第三，生产时耗长。研究表明：不同干物质含量的水果均可使用表面静
氨基酸发酵工艺学要点 味精厂的主要生产车间：糖化车间、发酵车间、提取车间、精制车间 淀粉生产的流程。 淀粉的液化及糖化定义。 淀粉液化过程使用淀粉酶，水解位置1，4糖苷键，糖化过程使用糖化酶，水解位置1，4糖苷键和1，6糖苷键。 液化结束后，为何要进行灭酶处理，如何操作？ 葡萄糖的复合反应。 淀粉的糊化、老化定义及影响老化的因素。 DE值与DX值的概念 淀粉水解糖的质量要求有哪些？ 说说酸水解法、酸酶法和酶水解法三种不同水解工艺的优劣？ 固定化酶的定义及制备方法有哪几种？ 生物素对谷氨酸生物合成途径影响。 在谷氨酸发酵中如何控制细胞膜渗透性。 诱变育种概念。 谷氨酸生产菌的育种思路 现有谷氨酸生产菌主要有哪四个菌属。 谷氨酸发酵生产菌的主要生化特点。 日常菌种工作。 菌种扩大培养的概念和任务 谷氨酸发酵一级种子和二级种子的质量要求 影响种子质量的主要因素 氨基酸生产菌菌种的来源有哪些。 工业微生物菌种保藏技术是哪几种？ 冷冻保藏的分类 菌种衰退和复壮的概念 代谢控制发酵的定义 谷氨酸发酵培养基包括哪些主要营养成分。 生长因子的概念 影响发酵产率的因素有哪些。 谷氨酸发酵过程调节pH值的方法 谷氨酸发酵不同阶段对PH的要求：前期pH7.3、中期pH7.2 、后期pH7.0 放罐pH6.8 谷氨酸发酵时,出现泡沫过多,一般是什么原因,该怎样处理? 谷氨酸发酵过程，菌体生长缓慢或不长的原因及解决方法？ 谷氨酸发酵过程，耗糖快,pH偏低, 产酸低原因及解决方法 谷氨酸生产菌最适生长温度为？，发酵谷氨酸最适发酵温度？，最适合生长pH为？。 发酵过程中CO 2迅速下降，说明污染噬菌体， CO 2 连续上升，说明污染杂菌 消泡方法有哪几种？一次高糖发酵工艺 噬菌体侵染的异常现象染菌的分析
1、味精是L-谷氨酸单钠的商品名称，含有一分子的结晶水，其分子式为NaC5H8O4N·H2O 2、国内味精厂所使用的谷氨酸生产菌株主要有北京棒杆菌AS1.299、钝齿杆菌AS1.542 和天津短杆菌T 6-13三类。 3、谷氨酸发酵中，谷氨酸产生菌只有一条生物合成途径中，生成谷氨酸的前体物为α-酮戊二酸。而在赖氨酸发酵中，存在两条不同的生物合成途径，即二氨基庚二酸途径和α-氨基己二酸途径 4、谷氨酸制味精过程中，中和操作时一般应先加谷氨酸后加碱，否则会发生消旋化，生成DL- 谷氨酸钠。 5、在谷氨酸发酵中，溶解氧的大小对发酵过程有明显的影响。若通气不足，会生成乳酸或琥珀 酸，若通气过量，会生成ɑ－酮戊二酸 6、从发酵液中提取赖氨酸，目前一般采用离子交换方法。影响提取得率最大的是菌体和钙离子 7、谷氨酸的晶型分为α-型结晶和β-型结晶两种，等电点提取谷氨酸时，首先必须形成一定数量 的晶核，然后才能进行育晶。谷氨酸起晶有自然起晶和加晶种起晶两种方法。 8在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要酶有谷氨酸脱氢酶（GHD）、转氨酶（AT）和谷氨酸合成酶（GS）三种。 9、L–谷氨酸在水溶液中的等电点是3.22，L–赖氨酸的等电点是6.96 10、在谷氨酸发酵过程中，对生物素的要求是亚适量，而在赖氨酸发酵生产中要求生物素过量。 11、游离的赖氨酸具有很强的呈盐性，因此，一般工业制造产品是以赖氨酸盐酸盐形式存在，其化学性质相当稳定。 二、单项选择题（共10小题，每小题2分，共20分） 得分评卷人 1、下列菌株中，_C_属于赖氨酸产生菌。 A．Hu7251 B．FM84-415 C．AS1.563 D．WTH-1 2、下列哪种氨基酸发酵是在供氧不足的条件下产酸最高？（D ） A．精氨酸B．赖氨酸C．苏氨酸D．亮氨酸 3、谷氨酸发酵产酸期的最适温度一般为（C ）。 A．30℃~32℃B．32℃~34℃C．34℃~37℃D．38℃~40℃ 4、在谷氨酸（AS1.299菌）发酵中后期，为有利于促进谷氨酸合成，pH值维持在___C__范围为好。A．pH6.2~6.4 B．pH6.8~7.0 C．pH7.0~7.2 D．pH7.3~7.6
第一章文献综述 1.1谷氨酸简介 谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占有重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。目前，我国许多工厂采用多种方法来提高谷氨酸产率，如选育高产菌种、改进发酵工艺、搞好发酵控制、引进微机控制、增加控制参数等。这些方法对于提高谷氨酸产率非常有效。 谷氨酸是生产味精的主要原料，随着发酵法生产谷氨酸技术的发展，我国味精生产始于1923年，至今已有80多年历史，随着科学技术的不断进步，味精生产技术也在不断变革，由创建之初的以面筋、豆粕为原料水解法生产工艺，改变为现在以淀粉为原料发酵法生产工艺，发酵法生产工艺从1964年在上海味精厂首次投入生产以来，发酵法生产谷氨酸的生产技术进步较大，尤其是近几年随着菌种的突破以及新技术，新设备的应用进展更快，进入九十年代，尤其九五年后，技术进步较快，目前行业最好水平时（仅少数厂家）制糖收率99%以上，发酵产酸11-12%，转化率59-62%，提取收率96-98%精制收率96%，与80年代比较全行业平均制糖收率提高了10%，发酵产酸率提高了117%，转化率提高了43%，提取收率提高了20%，精制收率提高了8.8%，综合技术指标淀粉消耗下降了166%
1.2谷氨酸的生产工艺流程 1.2.1液化和糖化 因为大米涨价, 目前大多数味精厂都使用淀粉作为原材料。淀粉先要经过液化阶段。然后再与β- 淀粉酶作用进入糖化阶段。首先利用α- 淀粉酶将淀粉浆液化, 降低淀粉粘度并将其水解成糊精和低聚糖, 应为淀粉中蛋白质的含量低于原来的大米, 所以经过液化的混合液可直接加入糖化酶进入糖化阶段, 而不用像以大米为原材料那样液化后需经过板筐压滤机滤去大量蛋白质沉淀。液化过程中除了加淀粉酶还要加氯化钙，整个液化时间约30min。一定温度下液化后的糊精及低聚糖在糖化罐内进一步水解为葡萄糖。淀粉浆液化后, 通过冷却器降温至60℃进入糖化罐, 加入糖化酶进行糖化。糖化温度控制在60℃左右, pH 值4.5, 糖化时间18～32h。糖化结束后, 将糖化罐加热至80～85℃, 灭酶30min。过滤得葡萄糖液, 经过压滤机后进行油水分离( 一冷分离, 二冷分离) , 再经过滤后连续消毒后进入发酵罐。 1.2.2谷氨酸发酵
果醋发酵工艺的概述 丁宁 （中央民族大学北京100081） 摘要：随着社会经济的发展，人们的生活水平有所提高，更加注重于追求健康养生。果醋是新生的一种醋饮料，是以水果为原料酿造而成的。果醋含醋酸5%~7% ，与粮食醋相比，具有更好的芳香风味、更丰富的无机盐和维生素，以及更加良好的保健作用。文章通过文献查阅方式以及课程了解，概述了果醋发酵工艺的原理流程、发酵方式、功能价值以及目前市场上的果醋类型，旨在更进一步地认识果醋发酵工艺，为果醋的研究开发提供一定的参考依据。 关键词：果醋；关键技术；工艺流程；功能效用； The Overview of Fruit Vinegar Fermentation DING NING College of Life and Environment Science to Minzu University of China Beijing 100081 Abstract：With the development of social economy, people's living standards also improved and pay attention to health preservation.Fruit vinegar is a new kind of vinegar drinks, made from a variety of fruits as raw materials .It contains acetic acid 5% ~ 7%,is much better than food vinegar in flavor、inorganic salt 、vitamin and health function . In this paper, through the way of literature review and the course, summed up the principle of fruit vinegar fermentation process, fermentation methods, function value，and fruit vinegar type, aimed to have further understanding of fruit vinegar fermentation technology and provide certain reference for the research and development of fruit vinegar.. Keywords: Fruit V inegar; Key Techniques；Steps；Function V alue； 前言 根据相关资料记载人类生产食用果醋已有7000年的历史,比粮食醋早3800年[1]。17世纪后欧美的食醋则以果醋为主,如美国的苹果醋,法国的红白葡萄醋等[2]。早在我国夏朝时期，由于粮食生产不足，人们就将野生水果堆积在一起自然发酵制成了果酒饮用，但是酒精在空气中极易被醋酸杆菌氧化为醋酸，这就形成了最早的果醋。西方果醋的最早记载是纪元前5000 年的古巴比伦时代，利用蜜枣、葡萄酒或麦酒制作果醋。西元18-19世纪时，欧洲人外出旅游时，随身携带果醋；饮水前必先在水中滴几滴醋，杀菌、消毒以预防传染病。17 世纪以后欧洲各国结合各自的物产和饮食习惯生产出不同品种的果醋，如意大利的香醋（Balsamic vinegar）和传统香醋（Traditional balsamicvinegar）、西班牙的雪利醋（Sherry vinegar）、法国的香槟醋（Champagne vinegar）等。近年来,由于果醋含有丰富的营养成分且具有美容养颜促消化、软化血管降血脂等保健功效,备受推崇,因此对于果醋的开发也日益受到关注。目前，我国用水果酿醋的企业不多、规模不大。发达国家如美国推出苹果醋(Cider vinegar)，法国推出葡萄酒醋（Grape vinegar），英国则推出麦酒醋(Malt vinegar)和啤酒醋，而德国的速酿醋也很有特点。日本人对果醋更是情有独钟，推崇备至；早在上世纪70 年代
果醋研究进展 摘要:果醋是以水果为主要原料,利用现代生物技术酿制而成的一种新型保健饮品,它富含有机酸、氨基酸、维生素、矿质元素等多种营养成分。本文中对果醋的生理功能以及近年的发酵工艺作了概述。 关键词:果醋;生理功能; 发酵工艺 Abstract:Fruit vinegar is a fruit as the main raw material, the use of modern biotechnology, brewing of a new health drink, it is rich in organic acids, amino acids, vitamins, mineral elements and other nutrients. In this paper the physiological functions of fruit vinegar and recent fermentation technics were reviewed. Keywords: fruit vinegar, physiological functions,fermentation technics 引言 果醋是以水果(苹果、山楂、葡萄、柿子、梨、杏、柑橘、称猴桃、西瓜等)为主要原料,利用现代生物技术酿制而成的一种营养丰富、风味优良、兼有水果和食醋的营养保健功能,是集营养、保健、食疗等功能为一体的新型饮品。随着人们对饮料消费的多元化需求，新型果醋饮料应运而生。研究发现，果醋的营养成分丰富，含有多种人体必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素等。具有维持人体的酸碱平衡、调节体内代谢、防癌抗癌、预防“三高”、延缓衰老等功效。近年来，人们的保健意识不断增强，果醋饮料日益为消费者所认识，尤其为妇女和儿童所钟爱，开发各类果醋饮料将有广阔的市场前景[1-3]。 1 果醋功能 随着果醋营养、保健作用的不断挖掘和发现, 消费者逐渐认识并开始接受果醋产品, 现在果醋及果醋饮料是当今世界的热门产品。 1.1促进新陈代谢,调节酸碱平衡,消除疲劳 果醋富含醋酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸等多种有机酸以及人体所需的多种氨基酸、
实验实训十二果醋酿造 果醋是利用水果为原料酿制而成的食醋产品。因水果营养丰富且有丰富的芳香物质，因此酿制的醋不仅有水果的芳香，而且酸味比粮食醋柔和，风味明显优于粮食醋，已被列入保健醋行列。是欧美、日本等国家主要的食醋种类。果醋可选用的原料有：苹果、梨、葡萄、沙棘、红枣、杏、山楂、橘子、草莓、香蕉等。 加工原理 1.利用酵母菌的酒精发酵将原料中可发酵型糖转化为酒精。酒精发酵是厌氧发酵。 2.利用醋酸菌的醋酸发酵将酒精转化为醋酸。醋酸发酵是好氧发酵。 3.利用陈酿改善果醋风味，并起到果醋澄清作用。 4.利用杀菌密封保藏制品。 一、材料与仪器设备 1.主要材料 柑橘，草莓，亚硫酸钠，蔗糖，甲壳素，葡萄酒酵母，醋酸菌种等。 2.仪器与设备 折光仪，发酵罐，台秤，温度计，酒精计，榨汁机，离心机等。 二、工艺流程 1.苹果醋（发酵型） 原料选择→清洗榨汁→澄清、过滤→成分调整→酒精发酵→醋酸发酵→压榨过滤→陈酿→澄清→杀菌→成品 2.草莓醋（调配型） 糯米→浸米→蒸米→淋冷→糖化→酒精发酵→醋酸发酵→过滤→配料→澄清→装配杀菌→成品 草莓→去杂→清洗→榨汁→过滤 三、操作步骤 1.苹果醋 （1）原料选择选择新鲜成熟苹果为原料，要求糖分含量高，香气浓，汁液丰富，无霉烂果。 （2）清洗榨汁将分选洗涤的苹果榨汁、过滤，使皮渣与汁液分离。 （3）粗滤榨汁后的果汁可采用离心机分离，除去果汁中所含的浆渣等不溶性固形物。 （4）澄清可用明胶一单宁澄清法，明胶、单宁用量通过澄清实验确定；或用加热澄清法，将果汁加热到80℃～85℃，保持20～30s，可使果汁内的蛋白质絮凝沉淀。 （5）过滤将果汁中的沉淀物过滤除去。 （6）成分调整澄清后的果汁根据成品所要求达到的酒精度调整糖度，一般可调整到17﹪。 （7）酒精发酵用木桶或不锈钢罐进行，装入果汁量为容器容积的2/3，将经过三级扩大培养的酵母液接种发酵（或用葡萄酒干酵母，接种量为l50mg/kg），一般发酵2～3周，使酒精浓度达到9﹪～10﹪。发酵结束后，将酒榨出，然后放置1个月左右，以促进澄清和改善质量。 （8）醋酸发酵将苹果酒转入木桶、不锈钢桶中。装入量为2/3，接入醋种5﹪～10
生物工艺学课程设计说明书 题 目：100k t /a 谷氨酸钠发酵 车间工艺设计 学生姓名： 学 院： 化工学院 班 级： 指导教师： 2011年 1 月20 日 学校代码： 10128 学 号： 200710513066
第一章设计任务与设计依据1 1.1设计任务1 1.2设计基本依据1 第二章谷氨酸简介2 1.1概述2 1.2理化性质2 1.2.1 物理性质2 1.2.2 谷氨酸的化学性质4 1.3应用5 1.4谷氨酸的生物合成途径7 第三章发酵法生产谷氨酸的工艺流程9 3.1发酵法概述9 3.2原料的预处理及糖化9 3.2.1 原料的种类9 3.2.2 原料处理10 3.3.谷氨酸发酵工艺11 3.3.1 发酵培养基11 3.3.2 培养基灭菌12 3.3.3 发酵控制12 3.4谷氨酸的提取14 3.4.1 原理14 3.4.2 工艺流程14 第四章工艺计算16 4.1生产要求16 4.2工艺计算16 4.2.1总物料平衡的计算16 4.2.2发酵工段物料平衡计算18 第五章总结与体会22 致谢23 参考文献24
谷氨酸是一种酸性氨基酸，是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有重要意义。不论在食品、化妆品还是医药行业，谷氨酸都有很大的用途。 谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。医学上谷氨酸主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育。食品工业上，味精是常用的仪器增鲜剂，其主要成分是谷氨酸钠盐。过去生产味精主要用小麦面筋（谷蛋白）水解法进行，现改用微生物发酵法来进行大规模生产。不论在食品、化妆品还是医药行业，谷氨酸都有很大的用途。 谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。用于食品内，有增香作用。甘氨酸具有甜味，和味精协同作用能显着提高食品的风味。谷氨酸作为风味增强剂可用于增强饮料和食品的味道，不仅能增强食品风味，对动物性食品有保鲜作用。 本次设计为年产10万吨谷氨酸生产的发酵工段，，因此对谷氨酸的发酵介绍较为详细。
发酵调味品实验 实验一果醋发酵 一、实验目的 1.了解和掌握酒精发酵和醋酸发酵过程。 2.了解和掌握用水果生产果醋。 二、实验原理 果醋多选用残次水果,经压榨、酒精发酵、醋酸发酵后加工而成。果醋具有果香浓郁,酸味柔和,香甜自然等特点。 三、实验用品及材料 1.菌种：酵母菌摇瓶种子、醋酸菌摇瓶种子（实验室提供）。 2.水果：葡萄、苹果或香梨等其中一种。 3.设备：三角瓶、杀菌锅、恒温培养箱、糖度计、酸度计、酒精计、电炉、试纸。 四、果醋生产工艺 1.工艺流程 果渣→酒精发酵→酒精 水果→挑选→清洗→榨汁→果汁→加糖→调整成分→澄清→(加麸曲或果胶酶)→ 酒精发酵→醋酸发酵→过滤→调节成分→杀菌→包装→成品 2.操作要点 (1)水果处理将采集或收购的残次水果放入清洗池或缸中,用清水冲洗干净,挖去水果上腐烂变质的部分,清洗干净后沥干水备用。 (2)榨汁水果榨汁可使用压榨机进行处理。压榨前应根据原料的特点,对其进行适当处理。如使用葡萄为原料要先除梗后榨汁;柑橘榨汁前应先剥皮;苹果榨汁前可先切开成几块等。不同的水果榨汁率有很大的差异:番茄榨汁率高达75%以上,苹果榨汁率在70%～75%,葡萄榨汁率为65%～70%,而柑橘榨汁率仅有60%左右。 (3)调整成分果汁中可发酵性糖的含量常常达不到工艺要求;有时为降低生产成本,也需要提高含糖量。加糖可采用两种方法,一是添加淀粉糖化醪,另一种方法是加蔗糖,补加蔗糖时,先将糖溶化配成约20%的蔗糖液,用蒸汽加热至95～98℃充分溶解,而后用冷凝水降温至50℃,再加入到果汁中。 (4)澄清将调配好的果汁送入澄清设备中,加入黑曲霉麸曲2%,或加果胶酶0.01%(以原果汁计),在40～50℃下保温2～3h,使单宁和果胶分解,果汁的澄清度明显提高。 (5)酒精发酵澄清后的果汁冷却至30℃左右,接入l%的酒母进行酒精发酵。发酵期间控制品温在30～34℃为宜,经4～5天的发酵,发酵醪酒精含量为5%～8%,酸度1%～1.5%,表明酒精发酵基本完成。 (6)醋酸发酵果醋的醋酸发酵以液态发酵效果最佳。液态发酵利于保持水果固有的香气,成品醋风格鲜明。固态发酵时,成品醋会有辅料的味道,而使香气变差。液态发酵可采用表面发酵法与深层通风发酵两种工艺。工厂规模小时以前者为宜,规模大 时则应选择后者。 表面发酵法操作过程:在酒精发酵成熟醪中,加入培养好的醋酸菌种子5%～10%,在30℃左右进行发酵,发酵液分数次加入,整个发酵过程约30天。成熟醋酸发酵醪的酸度在5%～5.8%。 (7)后处理醋液经过滤后,调节酸度为3.5%～5%,加热至80℃以上,趁热装入清洁的坛或瓶中,即可得到成品果醋。 五、结果与讨论 1.分别记录酒精发酵和醋酸发结束后醪液中糖度、酒精度和酸度，口感方面等。 2讨论.添加果胶酶的作用是什么？ 3.讨论如果不用水果而仅用酒精可用醋酸菌生产出醋吗，为什么？
氨基酸发酵工艺学试题集 一、名词解释 名词解释： 1. 液化：是利用液化酶使淀粉糊化，粘度降低，并水解得到糊精和低聚糖的程度。 2.糖化：是用糖化酶将液化产物进一步彻底水解成葡萄糖的过程。 3.发酵热：发酵过程中释放出来的净热量称为发酵热，发酵热 = 生物热 + 搅拌热 - 蒸发热 - 辐射热 - 显热。 4. DE值：即葡萄糖值，表示淀粉水解程度及糖化程度。DE值 = 还原糖 / 干物质× 100％ 5. DX值：糖液中葡萄糖含量占干物质的百分率。 6. 代谢控制发酵：就是用遗传学或其它生物化学的方法，人为的改变、控制微生物的代谢，使有用产物大量生成、积累的发酵。 7. 噬菌体效价：每毫升试样中所含有具有侵染性的噬菌体的粒子数。 8. 发酵转换：当发酵条件发生改变时，必然会影响到生物代谢途径分支的关键酶的酶量和酶活性的改变，从而导致发酵方向发生转换，从而产生不同的代谢产物。 9. 淀粉液化：利用α-淀粉酶将淀粉液化，转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加。 10. 临界溶氧浓度：指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。 11. 末端产物阻遏：是指由某代谢途径末端产物的过量累积时而引起的反馈阻遏，是一种较为重要的反馈阻遏。 12.糖酸转化率：产出的谷氨酸与投入的葡萄糖总量的百分比，糖酸转化率 = 产出的谷氨酸 / 投入的葡萄糖量× 100% = （产酸水平×放罐体积） / （种子用糖量 + 发酵培养基用糖量 + 流加糖量）× 100% 。 13. 生物素的“亚适量”：指淀粉糖原料产谷氨酸生产过程中，控制发酵培养基的生物素浓度在5～6μg / L，此浓度即为生物素的“亚适量。生物素是催化乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，从而影响磷脂合成及细胞膜的形成。它的作用主要影响谷氨酸产生菌细胞膜的谷氨酸通透性；同时也影响菌体的代谢途径。因此，为了形成有利于谷氨酸向外渗透的细胞膜，必须使磷脂合成不充分，因而必须要控制生物素“亚适量”。 14. 种子扩大培养：指将处于休眠状态的保藏菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶、种子罐等逐级扩大培养，从而获得一定数量和质量的纯种的过程。 15. 营养缺陷型：对某些必须的营养物质（AA)或生长因子的合成能力出现缺陷的变异菌株或细胞。必须在基本培养基（如由葡萄糖和无机盐组成的培养基）中补加相应的营养成分才能正常生长。 16. 流加发酵：也叫补料分批发酵、半连续发酵、半连续培养。它是以分批培养为基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发酵方法。 17. 糊化：淀粉在热水中能吸收水分而膨胀，最后淀粉粒破裂，淀粉分子溶解于水中形成带有粘性的淀粉糊，此过程称为糊化。 18. 连续等电点法：是指在大量谷氨酸晶体存在的条件下，一边连续等当量添加发酵液（或谷氨酸锌盐溶液）与盐酸（或硫酸）使溶液始终在结晶点PH3.0(或PH2.4)，一边连续从底部打出谷氨酸结晶液，送入育晶罐（池）继续育晶的工艺。