酵母实验操作方案 一．质粒酶切及线性化 1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。 2）线性化质粒 使用80μl酶切体系 9KSF2质粒70μl 内切酶（SacI，SalI，BglⅡ）2μl 10 x buffer 8μl 3）酶切3－16小时，一般3小时即可； 二．乙醇回收酶切质粒 1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA； 2）－20℃数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清； 3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）； 4）37℃烘干水分和残留乙醇； 5）用20μl ddH2O重溶； 6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量； 三．电转化 1．准备感受态细胞 1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，30℃，摇菌24 hours； 2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，30℃，250rpm，7～8 hours，直到OD600＝1.3～1.5； 3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，4℃离心5 min，弃上清； 4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清； 5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清； 6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，4℃备用，剩下的感受态细胞可以保存在－70℃冰箱大约3周。 2．转化 1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀； 2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴； 3) 电转化，参数设定：电压1500V 电容25μF 电阻200欧姆，放电时间4～5ms 4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯，打匀； 5) 迅速涂板，250μl/块MD板，共3块； 6) 涂好的板放在30℃培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。 注：
．葡萄果表酵母的分离: 葡萄的采集：葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。2. 菌种分离步骤：将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制成菌悬液，吸取50μl 放入YEPD固体培养基，三个重复，以无菌刮铲刮匀，25℃培养24～48h。观察菌落的大小及生长状况。然后将静置后的菌悬液进行梯度稀释（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L 的氯霉素。观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 自然发酵过程中酵母菌的分离: 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。称量约100g 新鲜成熟度好的各品种葡萄，手工破碎，放入无菌的500ml 三角瓶，接着分别按30ug/ml添加链霉素，置于28℃培养，每隔24h 取发酵液1ml，加入9 ml无菌水中，然后进行梯度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取样时期分别为：I，葡萄浆果破碎压榨后（添加SO2）；II，发酵旺盛期，葡萄汁含糖量下降20%时；III，发酵后期，葡萄汁含糖量下降70%时；IV，发酵结束前，残糖10%以下时。取0.1ml 稀释后各菌液放入固体培养基，涂布均匀（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，28℃条件下使其自然发酵24～48h，每个稀释度做三个重复。为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。观察每一个菌落，编号并作详细描述。如：菌落颜色、表面结构、边缘、颜色等，进行分析和初步的归类。 酿酒酵母筛选及其鉴定一筛选 1 酿酒酵母的无性繁殖方式筛选对液体培养基培养48h的酵母菌株，在16×40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株。 2 WL琼脂培养基筛选酿酒酵母WL琼脂培养基(%质量分数)：酵母浸粉0.5，胰蛋白胨0.5，葡萄糖5，琼脂2，磷酸二氢钾0.055，氯化钾0.0425，氯化钙0.0125，氯化铁0.00025，硫酸镁0.0125，硫酸锰0.00025，溴甲酚绿0.0022，pH 6.5，121℃灭菌20 min；将分离出来的酵母菌株，接种液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27℃培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色（浅黄色）至绿色，表面为球形突起，光滑，不透明，奶油状的菌株。 3 赖氨酸培养基筛选赖氨酸培养基成分（L-1）：D-葡萄糖10g，L-组氨酸1mg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg，对－氨基苯甲酸200μg，生物素20μg，叶酸2μg，肌醇10mg，烟酸400μg，泛酸2mg，盐酸吡哆醇400μg，核黄素200μg，盐酸硫胺素400μg，硼酸500μg，结晶氯化铜40μg，碘化钾100μg，结晶氯化铁200μg，结晶硫酸锰400μg，结晶钼酸钠200μg，结晶硫酸锌400μg，磷酸二氢钾850mg，磷酸氢二钾150mg，结
药物筛选细胞模型的种类 目前用于药物筛选的细胞模型可分为三大类：基于靶点的细胞模型、基于表型的细胞模型和抗病毒药物筛选的细胞模型等。 1. 基于靶点的细胞模型建立基于靶点的细胞模型，要明确药物可能作用的靶点，进而建立靶点过表达的细胞，筛选对靶点有明确作用的药物。基于靶点的细胞模型是目前用于药物筛选的细胞模型的主要类型，可以分为四类。 (1)以受体为靶点的细胞模型：如以维甲酸受体为靶点的药物筛选细胞模型。 (2)以通道为靶点的细胞模型：如囊性纤维化相关的氯离子通道CFTR激活剂／抑制剂筛选细胞模型。 (3)以信号通路为靶点的细胞模型：如NF2κB信号通路的抗阿尔茨海默病药物筛选细胞模型。 (4)以报告基因和其他类型联用为靶点的细胞模型：事实上前三种药物筛选细胞模型通常是和报告基因联用来建立的，这样能够比较快速直观地观察到药物作用后细胞的变化。目前常用的报告基因有绿色荧光蛋白(GFP)和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)等。 由人胎盘基因编码的分泌型碱性磷酸酶，能分泌至细胞外，无须裂解细胞就能进行检测，有较强的耐热性，通过热处理就可以排除细胞内源性碱性磷酸酶的干扰。在用碱性磷酸酶做报告基因时，通常是将其与要检测的靶点通过基因重组构建共表达的载体，然后稳定转染到细胞内，在筛选药物时，通过检测SEAP，就可以达到检测药物靶点检测水平的目的。 绿色荧光蛋白的发现，特别是在其基础上通过改造形成的，如黄色荧光蛋白(YFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及其他突变体的产生，极大促进了药物筛选细胞模型的发展。绿色荧光蛋白是一类对离子变化敏感的荧光蛋白分子。将绿色荧光蛋白与目的药靶稳定共转染于细胞模型中，药物作用于药靶后，会引起细胞内环境的变化，从而使荧光强度发生改变。通过荧光测定装置来捕捉用药前后的荧光强度变化，可以快速直观地观察到药物与药靶的作用情况。 2．基于表型的细胞模型基于表型的药物筛选模型通过筛选那些能造成细胞产生期望的生理变化的化合物，将有助于新蛋白、新靶点的发现。如目前在2 型糖尿病药物筛选中应用较多的有胰岛素抵抗细胞模型和葡萄糖消耗运转细胞模型、用于抗 I 型超敏反应药物筛选的肥大细胞模型等。
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
天然药物活性筛选中心筛选模型 抗肿瘤（抗炎）药物活性筛选 体外肿瘤细胞毒筛选模型 活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTS，生成蓝紫色产物，颜色与活细胞数目以及细胞活力成正比。该方法是细胞活性检测的经典方法，广泛应用于检测细胞增殖和抑制、化合物或者精制组分的体外肿瘤细胞毒性、化合物对受试细胞的半数生长抑制浓度IC50值的确定、化合物对受试细胞的抑制效应与剂量相关性以及化合物对肿瘤细胞与非肿瘤细胞的选择性毒性测定等。 该模型可用于评价化合物对体外肿瘤细胞生长及增殖的抑制活性，也可用来指导精制组分中的抗肿瘤活性单体的追踪分离，检测结果准确，重复性好，可高通量进行。 体内抗肿瘤药效评价模型（裸鼠移植瘤） 采用移植人肿瘤的免疫缺陷小鼠为模型，对于体外筛选中获得的具有抗肿瘤活性的药物进行体内活性评价。该模型广泛应用于抗肿瘤药物研发，是抗肿瘤药物研发中的重要环节，结果综合反映药物的体内作用效果，为评价化合物的成药性提供重要的数据。 一氧化氮（NO）生成抑制剂筛选 一氧化氮（nitric oxide, NO）具有广泛而重要生物学调控功能，在炎症、肿瘤及心血管系统等均有重要作用。当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶（induced NO synthase，iNOS），生成NO进行免疫应答，因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。 NO的含量测定间接反映iNOS的表达水平或酶活性水平，而编码iNOS的基因是NF-κB信号通路的直接靶基因，因此该检测结果也是评价化合物激活NF-κB信号通路活性的重要指标。NF-κB信号通路与肿瘤及其他疾病发生密
第35卷第8期东 北 林 业 大 学 学 报Vol.35No.8 2007年8月JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Aug.2007 产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定1) 惠丰立 冯金荣 杨柯金 文祯中 (南阳师范学院,南阳,473061) 摘 要 从番茄果实表面筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐 病菌(Fusarium oxysporum)有较强的抗菌活性并具有较广的抗菌谱。形态及生理生化特征测定结果表明:菌株CY- 6与伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆生伊萨酵母(I.terricola)种的特征基本一致;测定了该菌株的26S r DNA D1/ D2区域序列并根据26S r DNA构建了系统发育树;在系统发育树中,菌株CY-6与陆生伊萨酵母形成一个类群, 序列同源性高达99.6%。因此,将菌株CY-6鉴定为陆生伊萨酵母。 关键词 菌株CY-6;几丁质酶;26S r DNA;系统发育 分类号 S476 Screen i n g and I den ti f i ca ti on of Ch iti n a se2Produc i n g Y ea st/Hui Fengli,Feng J inr ong,Yang Kejin,W en Zhenzhong (College of L ife Science and Technol ogy,Nanyang Nor mal University,Nanyang473061,P.R.China)//Journal of Northeast Forestry University.-2007,35(8).-66～67,70 A chitinase2pr oducing yeast is olate CY26was screened fr o m the surface of t o mat o fruits.The chitinase pr oduced by strain CY26could str ongly inhibit the gr o wth of Fusariu m oxysporu m and exhibited inhibiti on against a wide2range of p lant pathogenic fungi.Mor phol ogical,physi ol ogical and bi oche mical characteristics of strain CY26sho wed that the characteristics of strain CY26 were essentially consistent with those of Issatchenkia terricola.The analysis of26S r DNA D1/D2do main sequence fr o m strain CY26suggested that strain CY26was clustered t ogether with I.terricola in the phyl ogenetic tree,and the sequence identity be2 t w een strain CY26and I.terricola was99.6%.The result indicates that strain CY26bel ongs t o I.terricola. Key words Yeast CY26;Chitinase;26S r DNA;Phyl ogenetic analysis 果蔬采后的病害主要由病原真菌引起[1]。长期以来,使用化学合成杀菌剂一直是控制果蔬采后病害发生的主要手段之一,但是随着人类对食品安全、环境保护和克服有害生物抗性等问题的日益重视,化学杀菌剂的使用正受到越来越严格的限制[2-3]。因此,研究和开发控制果蔬采后病害的新方法,对于降低腐损率、控制农残量、确保食用安全和提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。 几丁质酶(Chitinase,Ec.3.2.14)被普遍认为是一种与重寄生、抗病防卫反应有关的酶类,许多拮抗菌通过产生几丁质酶来降解病原菌细胞壁[4]。因此,几丁质酶产生菌在果蔬采后病害防治方面有巨大的应用潜力。近年来,酵母菌分泌的胞外几丁质酶在果蔬采后病害生物防治中的作用已引起人们的重视。范青等人[5]利用膜毕赤酵母(Pichia m e m branefaciens Hansen)和季也蒙假丝酵母(Candida guillier m ondii)防治桃采后的真菌病害,发现这2种酵母菌产生的几丁质酶对桃软腐病菌(Rhizopus stolonifer(Ehrenb:Fr)Vuill)孢子萌发有明显的抑制作用。本研究从番茄果实表面分离筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)有较强抑制作用,并对其进行了形态、生理生化鉴定及基于26S r DNA序列的系统发育分析。 1 材料与方法 菌株CY-6是从番茄果实表面分离得到;番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)及其供试病原菌由本实验室分离保存。 1)河南省自然科学基金项目(0411032300)。 第一作者简介:惠丰立,男,1965年7月生,南阳师范学院生命科学与技术学院,教授。 收稿日期:2006年10月17日。 责任编辑:潘 华。 固体几丁质培养基:胶状几丁质15.0g、酵母粉5.0g、(NH 4 ) 2 S O41.0g、M gS O4?5H2O0.3g、KH2P O41.36g、H2O 1L,pH为4.5;液体几丁质培养基:固体几丁质培养基不加琼 脂;P DA培养基:马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂13g、H 2 O1mL。 菌株的分离筛选:从市场上购买新鲜的苹果、梨、桃、番茄等水果样品,分别取果皮组织5g,加入45mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in振荡培养48h。取0.1mL稀释一定倍数的稀释液均匀涂于固体几丁质平板上,28℃培养6d后,挑取具有明显透明圈的菌株纯化,置于4℃保存。将初筛菌株接种于50mL液体几丁质培养基中,28℃180r/m in摇瓶发酵72h后,测定发酵液几丁质酶活力。 几丁质酶活性测定:参照Ant oni o和Masarus方法[6-7]。1mL胶体几丁质与稀释的1mL酶液放于50℃水浴保温1h,上清液中的还原糖按DNS法测定。一个酶活力单位定义为每小时释放相当于100μg N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。 酶抗菌活性测定:采用打孔法[8]。将供试病原菌接种于直径为9.0cm的P DA平板上,28℃培养2～4d,在菌苔周围1.0cm处打3个孔(d=0.5cm),孔中加入50μL质量浓度分别为100、200mg/L的几丁质酶,对照以等量的无菌水代替,继续培养2～3d,观察抑菌情况。 形态和培养特征:参照微生物学实验手册[9]对菌株CY-6进行形态和培养特征观察。 生理生化特征:参照微生物学实验手册和酵母菌的特征与鉴定手册[9-10],对菌株CY-6进行糖发酵、碳源同化、氮源同化、无维生素培养基生长等生理生化鉴定。 26S r DNA序列分析:参照白逢彦等方法[11]提取菌株CY-6基因组DNA,用引物NL1(5’-GCA T AT C AA T AA GCG G AGG AA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAG
基于报告基因的胰岛素受体蛋白酪氨酸激 酶激动剂细胞筛选模型的建立 周家安 09临床乙班 摘要：目的建立用于大规模筛选胰岛素受体蛋白酪氨酸激酶(IRTK激动剂的细胞模型。方法将含有编码胰岛素受体(IR基因、转录激活因子5B(STAT5B基因和STAT5应答元件调控的荧光素酶基因的质粒瞬时共转染仓鼠卵巢(CHO细胞，人肝癌细胞HepG2和小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12，将具有较高的胰岛素诱导表达荧光素酶活性的细胞经G418筛选，获得具有胰岛素诱导表达荧光素酶活性的细胞克隆。RT —PCR 检测外源基因的表达的稳定性。荧光素酶活性分析和MTr 法检测胰岛素处理后荧光素酶诱导表达的量效关系，以及AG1024和AG490处理后胰岛素诱导荧光素酶表达的特异性。并在96孔板上优化荧光素酶的检测条件。结果共转染的cH0细胞较HepG2和C2C12表现出更高胰岛素诱导的荧光素酶活性，经CA18筛选得到一株具有较高诱导表达率的细胞克隆。RT —PCR 表明，该细胞克隆表达外源胰岛素受体和STAT5B 。该细胞中荧光素酶的诱导表达对于胰岛素具有剂量依赖性。IRTK 抑制剂AG1024能阻断胰岛素诱导荧光素酶的表达。而Jak 激酶抑制剂AG490无此作用。在96孔板上的荧光素酶的优化检测条件为：接种量每孔l5×10 个细胞，受试物诱导表达8 h ，Promega 荧光素酶检测试剂按推荐量进行4倍稀释使用。结论在转基因CHO 细胞中，IRTK 的激活能灵敏、特异地诱导荧光素酶的表达。因此，该细胞模型可用于IRTK 激动剂的高通量筛选。 关键词：受体，胰岛素；基因，报告；药物筛选；细胞．培养的 目前，在糖尿病的治疗中，所有胰岛素依赖型糖尿病患者和口服糖尿病药物不能控制血糖水平的非胰岛素依赖型糖尿病患者需要采用胰岛素治疗。但是，由于胰岛素是一个多肽分子，口服会被消化而丧失活性，而依赖注射治疗，且长期使用胰岛素可能导致严重的胰岛素抵抗等不良反应。因此，寻找可以口服的非肽小分子
酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法研究进展 张海枝，刘鹏，李川，刘长鹰 天津药物研究院天津市新药设计与发现重点实验室，天津 300193 摘 要：酶抑制剂类抗糖尿病药物是目前药物研究的热点，而药物筛选技术是制约此类抗糖尿病新药研发速度的关键步骤。主要从分子水平总结近年来报道的与糖尿病相关的酶抑制剂类候选药物的筛选方法，包括传统方法和前沿方法，着重介绍极具潜力的毛细管电泳法、质谱法、生物传感法和微通道筛选方法等。 关键词：抗糖尿病药物；酶抑制剂；分子水平；药物筛选方法 中图分类号：R977.3 文献标志码：A 文章编号：1674 - 5515(2014)08 - 0947 - 06 DOI: 10.7501/j.issn.1674-5515.2014.08.028 Research progress on drug screening methods at the molecular level for enzyme inhibitors used as anti-diabetic drugs ZHANG Hai-zhi, LIU Peng, LI Chuan, LIU Chang-ying Tianjin Key Laboratory of Molecular Design and Drug Discovery, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China Abstract: Various enzyme inhibitors have been demonstrated to be a hotspot in the research area of anti-diabetic drugs, whose development has been greatly limited by the efficiency of diverse drug screening methods. This paper concerns on different types of drug screening methods in the molecular level for enzyme inhibitors used in diabete treatment, including both traditional and advanced methods. Importantly, several screening methods with great potential have been emphasized here, such as capillary electrophoresis, mass spectrometry, biosensors, screening methods based on microchannel and so on. Key words: anti-diabetic drugs; enzyme inhibitors; molecular level; drug screening methods 糖尿病是全世界发病率最高的疾病之一，是一种与胰岛素产生和作用异常相关、以高血糖为主要特征的代谢性疾病。现有报道证实，体内参与血糖调节的多种酶已经成为抗糖尿病药物作用的关键靶点，可为研制治疗糖尿病的药物提供新途径。以靶标酶为作用对象的酶抑制剂可有效抑制血糖的升高，减缓糖尿病并发症的发生和发展，是抗糖尿病药物研发的希望所在[1-2]。目前报道的可用于治疗糖尿病的酶抑制剂包括α-葡萄糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶（AR）抑制剂、一氧化氮合酶（NOS）抑制剂、血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、基质金属蛋白酶（MMPs）抑制剂、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B （PTP-1B）抑制剂、果糖-1,6-二磷酸酶抑制剂、磷酸二酯酶（PDE）抑制剂、环氧酶-2（COX-2）抑制剂、二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂等[3]。 近年来，组合化学的快速发展已经解决了酶抑制剂类候选药物的大批量合成问题，而如何快速高效准确地筛选出此类抗糖尿病新药是药物研发中的关键难题。现有报道中关于酶抑制剂类候选药物的筛选方法较多，根据所选用的材料和药物作用的对象以及操作特点，可将这些方法大致分为4个水平：整体动物水平、组织器官水平、细胞水平和分子水平。其中，基于分子水平的酶抑制剂类药物筛选方法具有反应体积小、筛选速度快、药物作用机制明确，可实现大规模筛选等优点，在药物筛选方面具有广阔的应用前景。基于此，本文详细综述了酶抑制剂类抗糖尿病药物的分子水平筛选方法，力图为此类药物的高通量筛选提供借鉴和参考，以期提高抗糖尿病新药的研发速度。目前文献中报道的与糖尿病相关的酶抑制剂类药物分子水平筛选方法主要 收稿日期：2014-06-28 作者简介：张海枝（1985—），女，湖北黄冈市人，博士，助理研究员，研究方向为分析化学。Tel: (022)23006859 E-mail: zhanghz@https://www.doczj.com/doc/966975407.html,
酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术； 2.无菌操作技术； 3.工业微生物的分离与纯化技术； 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 ?实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。 （二）、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。
葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法 α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。 α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的原理是：对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。经α-葡萄糖苷酶水解后可以释放出对-硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP浓度成正比关系)。吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大。 设不加样品时，测得的吸光度为c0, 加样品后测的吸光度为c1. 那么酶的抑制率可通过1-c1/c0计算出来。 一实验试剂： α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)、4Nitrphtnylα-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)（PNPG）、Acarbose(阿卡波糖) 均购自Sigma公司，无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等, 均为分析纯。水为超纯水。苦瓜提取物。 二实验器材： Bio Tek酶标仪、电子天平、Eppendorf的移液器、pH计、酶标板、恒温水浴器 三实验方法： （一） 试剂配制 （1）pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液 分别配制0.1 mol/L Na2HPO4和KH2PO4(13.6 g配成1L)，用这两种溶液混匀互调pH 值至6.8即得0.1 mol/L磷酸缓冲液 （2）用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制0.26 U/mlα-Glucosidase （3）底物(PNPG)用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml) （4）反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3。 （5）阳性药的配制：精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml 的浓度。 （二） 实验方法 1. 各浓度药液按每孔50 μL加入酶标板，每浓度设三复孔。另设一药物对照孔、空白反应孔及空白对照孔。然后向药物反应孔和空白反应孔加入50 μL 0.26 U/mL的 -葡萄糖苷酶，其他组加50 μL 磷酸缓冲液，经此步骤后，各孔的组成为： 药物反应孔：50 μL药液+ 50 μL酶 药物对照孔：50 μL药液+ 50 μL磷酸缓冲液 空白反应孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL酶 空白对照孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL磷酸缓冲液 上述反应体系在微型振荡器上震荡30秒，置于恒温37 o C水浴中孵育10min。
酶抑制剂筛选模型研究进展 通过查阅文献，综述目前酶抑制剂筛选的主要模型，包括动物模型、高通量筛选模型及固定化酶反应器。并对其应用原理、应用情况及优缺点进行了阐述。 标签：酶抑制剂；筛选模型；靶点；验证 20世纪60年代，日本科学家梅译滨夫提出了酶抑制剂的概念，从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。随着酶学研究的深入，对酶结构的认识，已能在分子水平上认识酶的作用机制，并根据酶的作用原理来设计各种酶的专一抑制剂作为药物，来调节体内的异常代谢。 酶抑制剂作为药物的治疗基础是通过限制酶催化底物的反应能力，使底物浓度增高或代谢产物浓度降低，以达到改善症状的目的。在一系列酶促反应中，以抑制限速酶或关键酶的效果最好。在目前上市的药物中，以受体为靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。酶抑制剂的开发是新药的重要来源。随着现代生物科学技术的发展，酶抑制剂作为药物越来越受到医药界的重视。 药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性（生物活性、治疗作用）的实验方法，是寻找和发现药物的重要途径之一。在长期寻找药物的实践过程中，建立了大量用于新药筛选的各类模型，在新药发现和研究中发挥了积极的作用。随着生命科学的发展，新的药物筛选模型不断出现，不仅促进了药物的发现，而且对药物筛选的方法、理论、技术都产生了巨大影响[1]。 酶抑制剂的筛选模型主要为动物模型和细胞分子水平筛选模型。动物模型由于规模小、效率低、样品量大、成本高等缺点，不适合作为药物初筛的模型。细胞和分子水平的筛选模型，具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可实现大规模筛选和一药多筛等特点[1]，已成为目前酶抑制剂筛选的主要方法。本文就近几年来酶抑制筛选的主要模型进行综述。 1 高通量筛选模型 高通量筛选是以分子细胞水平的实验方法为基础，以微型板为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，同时对数以万计的样品进行检测。高通量筛选以其高效、快速的优点，已成为酶抑制剂新药发现的主要手段。酶抑制剂的高通量筛选模型，主要为分子水平的筛选模型，也有少量细胞水平的筛选模型。筛选以酶为作用靶点的药物，不仅要观察酶与药物的结合，更要观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点，酶的反应底物和产物都可作为检测指标[2]。以酶为作用靶点的高通量检测方法，绝大多数是直接检测酶的活性，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类[3]。
酵母菌选育、最适培养基筛选及菌种发酵培养 [摘要]在无菌条件下，用紫外线对酵母菌(yeast)进行不同时长的照射诱变处理，选出合适的诱变菌种进行振荡培养。经振荡培养后的诱变菌种运用正交试验设计的方法采用四个因素三个水平选出最适的菌种培养基，进行进一步的发酵培养。在发酵罐中加入最适培养基成分和合适的酵母菌诱变菌种进行发酵扩培，最终获得大量的菌种和发酵产物。 [关键词]酵母菌，紫外线，最适培养基，正交试验设计，发酵培养 面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种单细胞微生物，是酵母菌的一种,它含蛋白质50％左右，氨基酸含量高，富含B族维生素，还有丰富的酶系和多种经济价值很高的生理活性物质。几千年前人类就用面包酵母发酵面包和酒类，在现代食品工业方面，广泛用作人类主食面包、馒头、包子、饼干糕点等食品的优良发酵剂和营养剂。 本实验选用的物理诱变因子为紫外线，DNA能强烈吸收紫外线，尤其是碱基中的胸腺嘧啶，从而在形成二聚体，改变DNA结构，引起基因突变。本实验的面包酵母菌经不同时长的紫外线诱变处理，培养出的适合的诱变菌种进行最适的菌种培养基的筛选和发酵培养。 最适菌种培养基的筛选是通过正交实验设计进行的。正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法,是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。正交表是一整套规则的设计表格，用L为正交表的代号，n为试验的次数，t为水平数，c为列数，也就是可能安排最多的因素个数，本实验采用了四因素三水平进行最适培养基的筛选。 选出合适的诱变菌种和适合诱变的酵母菌生长的培养基后，便可以能过发酵罐进行发酵培养，分时段观察记录发酵过程中的PH，溶氧，菌种数。绘制出面包酵母的生长曲线 １材料与方法 1.1实验材料 菌种： 面包酵母菌 仪器： 高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，光学显微镜，恒温培养摇床，分析天平，小型发酵罐 用品： 枪头及1mL和0.5mL移液器，三角瓶，试管，玻璃涂棒，平皿，血球计数板，酒精灯，棉
药物筛选 维基百科，自由的百科全书 跳转到：导航, 搜索 药物筛选是现代药物开发流程中检验和获取具有特定生理活性化合物的一个步骤，系指通过规范化的实验手段从大量化合物或者新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性的化合物的过程。药物筛选的过程从本质上讲就是对化合物进行药理活性实验的过程，随着药物开发技术的发展，对新化合物的生理活性实验从早期的验证性实验，逐渐转变为筛选性实验，即所谓的药物筛选。作为筛选，需要对不同化合物的生理活性做横向比较，因此药物筛选的实验方案需具有标准化和定量化的特点。随着组合化学和计算化学的发展，人们开始有能力在短时间内大规模合成和分离多种化合物，因而在现代新药开发流程中药物筛选逐渐成为发现先导化合物的主要途径之一。 药物开发流程。繁体字版按此。 目录 ?1筛选模型 ?2高通量筛选 ?3虚拟药物筛选 ?4参见 ?5参考文献 ?6外部链接
[编辑]筛选模型 筛选模型就是在药物筛选实验中所应用的药理实验模型，由于药物筛选要求实验方案有标准化和定量化的特征，因而在传统药理实验中常见的动物实验在药物筛选中较少应用，根据实验模型的不同，药物筛选可以分为生化水平的筛选和细胞水平的筛选。 生化水平的药物筛选用拟开发药物作用的靶点设计实验，一般而言这种作用靶点是具有特定生理功能的蛋白质，如酶和受体等，此外一些编码功能明确的DNA也越来越多地成为药物作用的靶点。候选化合物与靶点混合后，可以通过酶连免疫、荧光显色、核磁共振等方法定量测定化合物与靶点的相互作用，从而成为筛选化合物的依据。 细胞水平的药物筛选是更接近生理条件的一种药物筛选模型，其模型是拟设计药物作用的靶细胞，应用细胞培养技术获取所需细胞，将这些细胞与候选化合物相互作用，通过与生化水平筛选类似的检测技术测定化合物的作用能力，从而对化合物进行筛选。 生化水平的药物筛选操作相对简单，成本较低，但是由于药物在体内的作用并不仅仅取决于其与靶酶的作用程度，吸收、分布、代谢、排泄均会对药物的作用产生极大的影响，仅仅一道薄薄的细胞膜就能够阻挡住许多候选化合物成为药物的道路，因而生化水平的药物筛选不确定因素更多，误筛率更高。细胞水平的药物筛选模型更接近生理条件，筛选的准确率更高，但是需要建立细胞模型，操作更复杂，成本更高，数据之间的平行形较差，另外由于技术的限制，有些靶标还不能进行细胞水平的药物筛选。 [编辑]高通量筛选 高通量筛选最初是伴随组合化学而产生的一种药物筛选方式。1990年代末，组合化学的出现改变了人类获取新化合物的方式，人们可以通过较少的步骤在短时间内同时合成大量化合物，在这样的背景下高通量筛选的技术应运而生。高通量筛选技术可以在短时间内对大量候选化合物完成筛选，经过近十年的发展，已经成为比较成熟的技术，不仅仅应用于对组合化学库的化合物筛选，还更多地应用于对现有化合物库的筛选。目前世界各大药物生产商都建立有自己的化合物库和高通量筛选机构，对有潜力形成药物的化合物进行篦梳式的筛选。 一个高通量药物筛选体系包括微量和半微量的药理实验模型、样品库管理系统、自动化的实验操作系统、高灵敏度检测系统以及数据采集和处理系统，这些系统的运行保证了筛选体系能够并行操作搜索大量候选化合物。高通量筛选技术结合了分子生物学、医学、药学、计算科学以及自动化技术等学科的知识和先进技术，成为当今药物开发的主要方式。完整的高通量筛选体系由于高度的整合和自动化，因而又被称作“药物筛选机器人系统” [编辑]虚拟药物筛选 虚拟药物筛选是药物筛选技术发展的另一个方向，由于实体的药物筛选需要构建大规模的化合物库，提取或培养大量实验必须的靶酶或者靶细胞，并且需要复杂的设备支
第一部分：酵母筛选收集 一．土样中酵母的分离： 1．土壤的采集处理 采用五点取样法从葡萄地土壤中取样。由于土壤中的微生物一般在5-25cm的土层里，所以先用灭菌铲除去土壤的表皮，然后采取土壤200-300g，至于无菌塑料袋内，并标明采取地点、日期。将其运回实验室后至于冰箱中保存，备用。 将采回的样品用四分法获取样品20-30g，将其置于研钵中研磨均匀。 2. 土壤中菌种的分离： 称取1 g土壤，置于液体培养基灭菌葡萄汁，经28 ℃，12 h，180 rpm摇床富集培养。取1 ml富集培养液，分别进行五个梯度稀释（1:1000、1:5000、1:10000、1:50000、1:100000），再用移液枪分别从每一稀释度各取0.1ml稀释液，注入平板上，利用涂布棒将样品均匀的涂在培养基表面（注意不能使培养基表面破裂），将培养皿盖好，再把培养皿倒置，于适宜温度（一般为25℃或28℃）的恒温箱中培养，每个梯度做三个重复。观察培养基，直到菌种形成清晰易辩的菌落为止。 为了在筛选过程中排除细菌的干扰，在培养基中加30ug/ml 的链霉素或者100mg/L的氯霉素。 观察并记录菌落颜色与形态，然后在显微观察记录细胞大小、形态，进行分析和初步的归类。 二．葡萄果表酵母的分离: 1. 葡萄的采集： 葡萄成熟时，在葡萄果皮、果梗上都有大量的酵母菌存在，因此在采收葡萄时，将果梗与葡萄一起采收。由于酵母菌在稍微破裂的葡萄果实中大量存在，采收时可以选取有裂纹的葡萄，但是，将完整无损的葡萄与有裂纹的分开装袋。运回实验室置于冰箱中保存，备用。 2. 菌种分离步骤： 将腐败变质的葡萄及杂质从果实中挑选出来。 随机选取并称量约10g成熟葡萄，放入盛有90ml 无菌水的三角瓶，分别按30ug/ml添加链霉素，然后振荡培养30min后静置，制
164 微量α﹣葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型及抑制类型 的判断方法 朱娟娟，尹忠平，陈继光，上官新晨，彭大勇，蒋艳 （江西农业大学食品科学与工程学院，天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌 330045） 摘要：α-葡萄糖苷酶抑制剂能抑制碳水化合物水解，是高血糖人群降低餐后血糖的常用物质。本文基于α-葡萄糖苷酶-PNPG 体外反应体系，建立了微量、快速的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型，该模型的主要参数如下：酶浓度为0.05 U/mL ；底物浓度范围为0.05~1 mM ；反应温度为37 ℃；反应时间为6 min 。以该模型检测了阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并采用Lineweaver-Burk Plots 、Eadie-Hofstee Plots 、Hanes-Wolff Plots 、Eisenthal-Cornish-Bowden Direct Plots 、Non-linear Regression Analysis 五种方法对该酶促反应的动力学数据进行了详细的分析。通过对数据处理的过程和结果的比较发现，该五种方法各有特点，各法所获得的V max 、K m 和K i 存在一定的差异，Non-linear-Regression Analysis 法更加简便、合理及可靠，是酶动力学数据处理的首选方法。采用Non-linear-Regression Analysis 法计算，该模型中酶促反应的V max 为3.91×10-6 mmol/min ，K m 为0.12 mM ，阿卡波糖的K i 为90 μM 。 关键词：α-葡萄糖苷酶抑制剂；模型；动力学 文章篇号：1673-9078(2016)12-164-170 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.12.026 A Model for Screening Trace Amounts of α-Glucosidase Inhibitors and Methods for Judging Inhibition Type ZHU Juan-juan, YIN Zhong-ping, CHEN Ji-guang, SHANG GUAN Xin-chen, PENG Da-yong, JIANG Y an (Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food, College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, 330045, China) Abstract: Alpha-glucosidase inhibitors can inhibit carbohydrate hydrolysis and are commonly used to decrease postprandial blood glucose in individuals with hyperglycemia. A model for the rapid screening of trace amounts of alpha-glucosidase inhibitors was established based on the alpha-glucosidase-pNPG in vitro reaction system. The optimized parameters of this model were as follows: the enzyme concentration, substrate concentration, reaction temperature, and reaction time were 0.05 U/mL, 0.05~1 mM, 37 ℃, and 6 min, respectively. The inhibitory effect of acarbose was determined using this model, and the enzymatic reaction kinetics data were analyzed using five methods (Lineweaver-Burk plots, Eadie-Hofstee plots, Hanes-Wolff plots, Eisenthal-Cornish-Bowden direct plots, and Non-linear regression analysis). Data processing and comparison of results showed that these five methods had distinct characteristics as the K i , K m , and V max calculated by these five methods differed slightly. Non-linear Regression Analysis was more convenient, reasonable, and reliable, and therefore was the first choice for processing the data of enzyme kinetics. By this model, the V max (×10-6 mmol/min) and K m (mM) of enzymatic reaction were calculated to be 3.91 and 0.12, respectively and the K i (μM) of acarbose was 90. Key words: alpha-glucosidase inhibitor; model; kinetics 据国际糖尿病联盟（IDF ）统计，2013年全世界糖尿病患者约3.82亿[1]。我国约有5000万糖尿病患者， 收稿日期：2015-12-24 基金项目：国家自然科学基金资助项目（31460436，31260368）；江西省自然科学基金项目（20132BAB204004） 作者简介：朱娟娟（1989-），女，硕士研究生，研究方向：天然产物与功能性食品 通讯作者：尹忠平（1971-），男，博士，副教授，研究方向：天然产物与功能性食品 居世界第二位[2]。研究表明，高血糖是糖尿病的主要 特征，也是导致糖尿病并发症的重要原因[2]。糖耐量受损（IGT ）主要表现为餐后血糖升高，因此控制患者餐后血糖水平非常重要。根据IDF 《Ⅱ型糖尿病全球指南》和《中国Ⅱ型糖尿病防治指南》，服用α-糖苷酶抑制剂是Ⅱ型糖尿病治疗的首选方法之一[3,4]。膳食中碳水化合物的消化吸收是影响餐后血糖的关键因素，为了防止餐后高血糖，患者必须控制日常饮食中碳水化合物的摄入量，严重影响了患者的生活质量。