间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多
牙髓干细胞 1牙髓干细胞概念 牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年Gronthos[1]等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)。现在普遍认为牙髓组织中具有形成细胞克隆能力和较强增殖能力的未分化间充质细胞即DPSCs[2]。 2牙源性干细胞 至今，已从人类牙齿相关组织中分离和鉴定出7种干细胞: (1)牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)[1]，来自恒牙牙髓；张巍巍等[3]以人牙髓干细胞为种子细胞与PLGA支架材料在体外进行复合培养，表明PLGA 有利于于牙髓干细胞的粘附与增值。Lindroos等[4]得到DPSC与其他间充质源性干细胞具有相似的表面标志物和骨相关性的标志物的结论，支持DPSC在硬组织再生方面的可能性。从成人第三磨牙牙髓中分离的DPSC在适宜的条件下可诱导分化为有功能活性的神经细胞，并在基因和蛋白水平表达神经组织专有的标志物[5]，为治疗神经系统方面的疾病提供了新的途径。DPSCs不表达成牙本质细胞特征性蛋白DSP、DMP，则表明DP-SCs尚处于未分化状态[6]。我国学者通过对根髓和冠髓进行比较时发现：DPSCs 存在于全部牙髓之中,在根髓中的密度更高[7]。 (2)人类脱落乳牙牙髓干细胞(stem cell from the pulp of human exfoliated deciduous teeth, SHED),来自儿童脱落乳牙的牙髓;Miura等[8]研究发现，正常脱落的乳牙牙髓中的细胞经培养会表现出成纤维细胞样生长，其增殖率和群体倍增数均比骨髓基质干细胞(BMMSC)、DPSCs高，于是首次提出了SHED的概念。Shen YY等[9]发现SHED在体外培养过程中可以表达成骨细胞的标志，如RUNX-2、OCN、BSP，表明SHED在体外可以分化为成骨细胞;将SHED与人类牙齿切片复合后，在体外培养或是植入免疫缺陷小鼠皮下，均表达成牙本质细胞分化的标志( DSPP，DMP-1，MEPE)[10]。一系列实验表明SHED在体内只能诱导宿主细胞分化为成骨细胞[11]，而其自身无法分化为成骨细胞，但在体外培养过程中却可以分化为成骨细胞。SHED 可能还具有参与机体的免疫调节等功能[12]。李丽文[13]等用不同密度接种培养DPSCs,计算细胞产量、倍增次数, 观察细胞形态、检查克隆形成率和钙结节形成能力的方法得到，1.5～3cells/cm2低密度接种培养DPSCs 有利于细胞快速扩增,扩增后的细胞保持较高的增殖和分化潜能。SHED 的增殖能力、克隆形成效率和钙结节形成能力均优于DPSCs。 (3)根尖乳头干细胞(stem cell from the apical papilla,SCAP)[14,15]，来自牙根发育未完成的根尖乳头；Abe等[16]从人年轻第三磨牙根末端分离根尖周牙乳头，并采用酶消化法从中分离出细胞进行研究，结果发现这种细胞在低密度下培养时，
中山大学医学院2003年口腔综合（硕士） 二、名词解释 1、Malassez上皮剩余 2、混合性腺泡 3、缩余釉上皮 三、简答 1、牙本质龋 2、钟状期成釉器 3、牙源性角化囊肿 4、多形性腺瘤 中山大学医学院2004年口腔组织病理学（硕士） 一、名词解释（5分×8） 1、reparative dentin 2、junctional epithelium 3、轮廓乳头 4、棘层松解 5、釉小皮 6、固有牙槽骨 7、分泌管 8、cleft lip 二、简答题（8分×5） 1、试列举釉质有机集中的结构 2、试列举口腔粘膜疱性疾病 3、牙龈纤维分组及功能 三、论述题（70分） 1、试述口腔粘膜白斑的病理特征（15） 2、试列出牙源性肿瘤组织学分类中牙源性上皮及外间充质性（混合性来源）的肿瘤，并详述其中两钟肿瘤的病理学表现（20） 3、口腔癌的组织病理类型及各型的病理特征（20） 4、试述免疫组织化学在涎腺肿瘤诊断中的应用（15） 中山大学医学院2005年口腔组织病理学（硕士） 一、名词解释 1 透明牙本质 2 结合上皮 3 acantholysis 4 intercalated duct 5 固有牙槽骨
二、简答题 1.简述牙胚的组织来源、组成及各部分所形成的结构 2.简述牙本质龋的分层 3.简述成釉细胞瘤的病理分类 4.简述无釉柱釉质的形成 5.简述非角质形成细胞的种类、来源及功能 三、论述题 1.试述慢性盘状红斑狼疮的临床及病理学表现 2.试述粘液表皮样癌的病理学表现及鉴别诊断 3.试述牙周炎的免疫病理 4.试述牙源性钙化囊肿的病理学表现 5.试述颌骨上皮性囊肿的分类 中山大学医学院2006年口腔组织病理学（硕士） 一、名词解释 1.primary epithelial band 2.管周牙本质 3.基底细胞液化变性 4.Gorlin综合征 5.Odontogenic carcinoma（牙源性肿瘤） 二、简答题 1.简述早期釉质龋的分层和改变 2.简述牙本质的增龄性和反应性变化 3.简述口腔黏膜纤维化病理表现的分期 4.简述与釉柱排列方向相关的结构 三、论述题 1.试述活动期牙周炎的主要病理改变 2.试述上皮异常增生的病理改变 3.试述牙源性钙化囊肿的病理学分型和改变 4.试述涎腺肿瘤的组织发生学 5.试述成釉细胞瘤的临床、病理表现及生物学行为 中山大学医学院2007年口腔组织病理学（硕士） 一、简答题 3.简述牙本质的细胞间质 4.简述早期平滑面釉质龋的分层 二、论述题 3.口腔白斑的临床与病理表现 4.试述成釉细胞瘤的病理表现 中山大学医学院2008年口腔组织病理学（硕士） 一、名词解释 3.junctional epithelium（结合上皮）
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液
家兔BMSC分离培养步骤 1.麻醉、备皮、消毒、铺巾：取1只4-5周龄新西兰幼兔，速眠新肌肉注 射(0．1～0．2mL／kg)麻醉。仰卧固定于操作台上，褪毛，备皮，2%碘酒、75%酒精（或碘伏）常规消毒，铺洞巾(洞巾孔洞应控制在lcm左右，以利于减少污染)。 2. 在双侧踝关节处环形剪开皮肤，再纵行剪开皮肤至骶尾部，分离肌肉、 筋膜等软组织至见骨膜，电锯离断踝关节、膝关节及髋关节，获取家兔股骨和胫骨（桡骨）,置于装有PBS液的无菌盒内。（亦可从髂前上棘穿刺抽取骨髓） 3．用PBS液体清洗骨组织3-4遍，去除杂物、血迹后，在超净工作台上，无菌条件下剥离骨周围的肌肉软组织，用眼科剪从股骨和胫骨的干骺端打开骨髓腔，用含有适量肝素( 625 U/mL)的DMEM 液冲洗骨髓腔，收集冲洗液约 6 ～ 8 mL。吸管反复吹打后，1 500 r/min，离心5 min，弃上清。加入 DMEM 培养基重悬，将上述细胞重悬液按照1∶ 1 的比例缓慢滴加到密度为 1. 073 g/mL 的PercoⅡ分离液中，1 500 r / min 离心 20 min。离心后管内容物分为 3 层，收集中间乳白色云雾状的单个核细胞层，加入 DMEM 培养液稀释混匀，1 500 r/min 离心 5 min，洗涤 2 ～ 3 次，去除多余的脂肪细胞及组织液。用含双抗的 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基重悬细胞，以 2. 0 × 10^5个/cm2的细胞密度接种于25cm^2培养瓶中，置于37 ℃，5%、饱和湿度的孵箱中培养。 4. 48小时后首次半量换液，去除浮物及其它非贴壁细胞（如造血干细胞），后每隔3天换液一次。 5. 7-10天后，待细胞融合长满至80%以上时用0.25%胰蛋白酶消化传代。 经过第一次传代后，骨髓间充质干细胞大约能占60%左右，并且呈漩涡状生长；一般经过3次左右传代后，骨髓间充质干细胞大约能占90%左右。
成体人牙髓干细胞的分离与鉴定 杨雪超樊明文 武汉大学口腔医学院(430079) email:yangxuecao@https://www.doczj.com/doc/711213378.html, 摘要：目地从成人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，研究其生物学性状。方法选取年青患者因正畸拔除的完好牙齿，取出牙髓，采用酶消化及过滤的方法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性,矿化结节形成，牙本质唾蛋白表达，Hoechst33342染色，Oil Red-O 染色，PPARr2基因表达等方面进行检测。结果在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP 活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达牙本质唾蛋白，已向成牙本质细胞方向发生了分化。Hoechst33342染色大部分细胞为阴性。成脂肪诱导后，Oil Red-O染色阳性，检测到PPARr2基因表达。结论从成体人牙髓组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，能够进行分化，为进一步的深入研究奠定了基础。 关键词：成体人牙髓干细胞牙本质唾蛋白成牙本质细胞 1．引言 目前普遍认为，干细胞是具有无限或很强自我更新能力细胞，能分化产生至少一种高度分化的后代细胞。干细胞应具有两个基本性质：（1）自我更新能力，能通过分裂维持自身群体的稳定；（2）分化能力，在一定条件下能分化产生具有特定功能的细胞[1]。干细胞又分为胚胎干细胞和成体干细胞两类，后者是目前研究的新热点。研究表明，皮肤[2]，乳腺[3]，肌肉[4]，甚至神经组织[5]等成熟组织器官中都存在成体干细胞（adult stem cell）。最近，国外学者证实成人牙髓组织中也存在干细胞[6]，国内关于此领域的研究尚刚刚起步，本文是系列研究的第一步，旨在探寻一条分离牙髓干细胞的可靠途径，为更深入的研究奠定基础2．材料和方法 2.1 材料 α-MEM培养基，特极胎牛血清（Hyclone, USA）; collagenase type Ⅰ,dispase(Sigma,USA);ALP检测试剂盒（南京建成）；β-甘油磷酸钠（进口分装）；兔抗人DSP抗体（NIDCR LW.Fisher 博士惠赠）；FITC标记二抗（武汉博士德）；Oil Red-O，IBMX, Hoechst33324(Sigma,USA)；One-Step RT-PCR试剂盒（Promage） 2.2 方法 2.2.1细胞培养和克隆 采用临床19-29岁因正畸或阻生需要拔除的健康第三磨牙，依照文献方法无菌条件下取出完整牙髓[7]。将牙髓剪碎，加入50倍体积的0.2% collagenase typeⅠ及0.2% dispase（体积比1︰1），37℃水浴摇床消化1小时，1000rpm/min离心10分钟，去上清。培养液（含20%胎牛血清）重悬沉淀，用100μm钢网过滤重悬液，获得单细胞悬液。细胞计数板计数 - 1 -
牙体组织由釉质、牙本质、牙骨质和牙髓构成。 釉质覆盖在牙冠的表面，牙本质构成牙的主体，牙骨质覆盖在牙根部的表面。 牙中央的腔隙称为髓腔，充满疏松的牙髓组织。 第一节釉质 覆盖于牙冠表面的一层硬组织，颜色为乳白色或淡黄色。 在切牙的切缘处厚约2mm，磨牙牙尖处厚约2.5mm. 一、理化特性 釉质是人体中最硬的组织，其洛氏硬度值（Knoop hardness number）为300KHN. 无机盐占釉质总重量的96~97%，主要由钙、磷离子组成的羟磷灰石晶体[Ca10（P04）6（OH）2]的形式存在。晶体内可含其他元素，F-的存在可使晶体稳定性加强，形成[Ca10（P04）6F2]，具有抗龋性。 有机物不足1%.釉质细胞外基质蛋白主要有釉原蛋白、非釉原蛋白和蛋白酶。 釉原蛋白形成"纳米球"的结构，在釉质晶体的成核及晶体的生长中起作用。在釉质发育时期含量达90%，在成熟釉质中消失。 非釉原蛋白与羟磷灰石亲和力强，能促进晶体成核和影响晶体形态。存在于釉质分泌早期和成熟后的釉丛、柱鞘。 釉基质蛋白酶是基质蛋白，参与前两者的修饰和剪接。 釉质中的水有两种形式：结合水和游离水。 大部分水是以结合水的形式存在，分布在晶体周围。 二、组织学结构 （一）釉柱：是细长的柱状结构，起自釉牙本质界，贯穿釉质全层。在窝沟底部呈放射状，向窝沟底部集中；在牙颈部呈水平状排列。 釉柱在光镜下纵剖面为柱状，横剖面呈鱼鳞状。 （二）施雷格线： 落射光观察牙纵磨片时，在釉质内4/5处出现的明暗带。 是由于釉柱排列方向不同所致。 （三）无釉柱釉质： 在近釉牙本质界和牙表面约30mm厚的釉质内没有釉柱的结构，仅为晶体平行排列而成。 这是由于成釉细胞在分泌早期托姆氏突尚未形成，而在分泌活动停止时托姆氏突腿缩而致。 （四）釉质生长线： 是釉质周期性生长速度改变形成的间隙线。 在乳牙和第一恒磨牙有一条加重的生长线，称为新生线。是由于釉质一部分形成于胎儿期，一部分形成于婴儿出生后。 （五）釉板： 是一薄层的板状结构，垂直于牙面。可深达釉牙本质界。 釉板处有机物含量较高，钙化不全。 釉板的存在为龋病的发生提供了通道。 （六）釉丛： 起自釉牙本质界，呈草丛状，高度为釉质厚度的1/5~1/4. （七）釉梭： 釉牙本质界处的纺锤状结构，为成牙本质细胞突起的末端膨大，穿过釉牙本质界并埋在釉质中。
ES 细胞培养 A.FBS的灭活与分装 1.化冻 将血清（Fetal Bovine Serum，Hyclone）从－20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻过夜；也可室温（或浸于自来水中）化冻，化冻后若不马上灭活，可以放入4℃冰箱暂时保存； 2.灭活 （1）放入室温的水浴锅内开始加热（同时放入一个内装200 ml自来水的血清瓶，插入一根温度计，温度监控以此为准）； （2）当温度计显示56℃时，控制在此温度30分钟±3分钟；若不小心使温度上升超过56℃，则：若仍未超过60℃，且时间很短（比如：不超过5分钟），则仍可使用； 若超过60℃，或者时间较长，则弃去不用，或者尝试用于ME细胞的培养； （2）取出，自然冷却至室温（约需1－3小时），可分装或－20℃继续冻存； 3.分装 （1）转入细胞间，用移液器将血清分装，注意预先要将血清轻轻摇动数周、混匀；吹出血清时要注意：不要吹出气泡（血清很粘稠，很容易产生气泡；如果已产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下）；标好批号和日期； （2）放入－20℃冰箱冻存(分装一次大约可以使用1—2个月)。 B. 配制DMEM血清培养基 1.提前一天将分装好的FBS从—20℃冰箱取出，放于4℃冰箱化冻； 2.在细胞间中将FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸钠、抗生素等），按照比例加入DMEM培养基中，作好标签；放入4℃冰箱保存。 配制比例如下：
C.原代胚胎成纤维细胞（ME）的制备 1. 取1 2.5-1 3.5dpc孕鼠，断颈处死； 2. 将鼠腹面向上放置，70% 酒精润湿、消毒腹部（防止腹毛飞扬，污染内脏及子宫），剪开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去，将子宫取出，转入无菌10cm平皿中； 3. 把平皿转入超净台； 4. 用镊子打开子宫壁，挤出鼠胚，并与胚外组织、胎盘等分离，除去鼠胚的头、四肢及各种内脏（主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等）； 5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿，用PBS洗三次； 6. 弃去PBS，用弯头剪将鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本无色（1－4次）； 7. 加入适量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），体积约等于组织块体积； 8. 用滴管轻轻吹匀，室温下消化1－10分钟（或消化至溶液浑浊变粘），加入与消化液等体积培养基，轻轻吹打混匀（5－10次），静置； 9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出，转入离心管中。 10. 将细胞悬液管离心（1000转5分钟）； 11. 弃去上清，向沉淀中加入适量培养基，轻轻吹打重悬，将其分种至10 cm细胞培养皿，补加适量培养基，作标签（ME－0；注意：若冻存，则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder；若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder，要传到一代以后再用来制作Feeder比较好），转入培养箱培养； 12. 视细胞生长情况换液（一般3天换液一次），若细胞已长满，则冻存，或者1：3-5传代（视细胞疏密而定），放入培养箱继续培养（此后不用再换液）；1－5代的ME细胞均可用来制作Feeder。 饲养层细胞（Feeder）的制备 注：含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基（FBS占10%）（实验室所用MMC为10 mg/mL，Calbiochem） 1.弃去细胞培养皿中的培养液，加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基（DMEM+10% FBS）； 2. 放入培养箱培养3小时（2－4小时）； 3. 用0.1% 明胶处理培养皿（将明胶加入，摇动使明胶覆盖全部皿底，然后吸出明胶弃去即可），室温放置2小时以上，至皿底明胶干燥为止； 4. 弃去含有丝裂霉素C的培养基，加入2－3 mL PBS，轻轻摇动，弃去PBS，如此洗3-5次（必须洗3次以上，以便彻底洗去残存的丝裂霉素，丝裂霉素是有丝分裂抑制剂，因而对ES细胞有毒性）； 24. 加入适量胰酶消化30秒，吸去消化液，静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止，加入培养基，吹打，种至明胶处理过的培养皿中即可（如细胞过稀，可再补加丝裂霉素处理过的细胞），半小时后即可使用（如果急用，则可以用ES细胞培养基终止消化，然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上），可使用6－10天，用前更换培养液（如未用明胶处理培养皿，则需在培养箱中放置2小时以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，这时的Feeder状态最好，最适于ES细胞贴壁生长，而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题，还可以赶紧补做）。 ES细胞培养基 DMEM+15%FBS
牙髓间充质干细胞生产 I．目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程。 II．范围：适用于牙髓间充质干细胞的生产；适用于技术部和各中心技术组的所有技术人员。 III．职责： 1.生产主管负责本制度的执行和监督； 2.技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作； 3.监督员负责全程监督，并即时按要求填写《牙髓间充质干细胞生产记录》和《生产试剂耗材记录表》。 附表1 牙髓/骨髓/脂肪/胎盘/脐带间充质干细胞生产记录 附表2 生产试剂耗材记录表 IV．规程： 一、牙髓间充质干细胞原代操作 消化法： 1.仪器耗材 1）10ml移液管 2）培养皿 3）50ml离心管 4）100μm筛网 5）T75培养瓶 6）15ml离心管 2.试剂 1）生理盐水 2）培养基 3）胶原酶 3. 酶消化法操作流程 3.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min； 3.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，
持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 3.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，转移到50ml离心管中，加入生理盐水至30ml,再加入10ml 0.2%胶原酶； 3.4 置于37℃恒温摇床，180rmp消化30min ； 3.5 用100μm滤网过滤； 3.6 1200 rpm离心10min ，吸取洗涤液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；附表3 样本取样单 3.7 弃剩余上清，调整细胞浓度为107/ml,置于75cm2培养瓶中,放入37℃，CO 2培养箱中进行培养。 4. 组织块法操作流程： 4.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min； 4.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 4.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，将组织块均匀铺到T25培养瓶（用适量FBS润湿瓶底）瓶底； 4.6 倒置培养瓶，并加入5ml培养基，放入培养箱中培养； 4.7 12-24h后，将培养瓶轻轻翻转，将牙髓组织块浸入工作液中。 二、牙髓间充质干细胞换液 1.耗材 1）10ml移液管 2）15ml离心管 2.试剂 培养基 3. 操作流程 3.1 镜下观察状态细胞； 3.2 吸取上清液4ml交给质检，并填写《样本取样单》； 3.3 吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），并补充新的
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第三篇牙髓病和根尖周病 第十二章牙髓及根尖周组织生理学特点 了解：牙髓组织肉眼及显微镜下的形态学特点及结构特点，重点：成牙本质细胞。 熟悉：牙髓的功能，尤其牙本质形成功能。根尖周组织的结构组成特点（牙本质、牙周膜、牙槽骨）及临床意义。 重点：1牙髓的增龄性变化及临床意义。 2牙髓的功能及临床意义。 第一节牙髓形态及组织结构 牙髓是牙组织中唯一的软组织，位于由牙本质围成的牙髓腔内，仅借狭窄的根尖孔与根尖周组织相连。牙髓作为一种疏松结缔组织，所含的细胞、血管和神经对环境变化的反应与其他疏松结缔组织的反应基本相同。 牙髓的自身特点： ①被无让性牙本质包围； ②基质富含有纤维且具有粘性； ③无有效的侧枝血液循环。 牙髓的损伤一般都难以恢复，且疼痛剧烈。 一、形态学特点 肉眼观：为一团红色、具有粘性的软组织。由明胶状基质构成，其内富含胶原纤维和纤维束。显微观，牙髓分四层 ①成牙本质细胞层：位于牙髓的最外层，主要由成牙本质细胞体构成，细胞间含有毛细血管和神经纤维。 ②无细胞层：无髓鞘的神经纤维、毛细血管和成纤维细胞的胞浆突构成。 ③多细胞层：大量的成纤维细胞和储备细胞（未分化的间质细胞）构成。 ④中央区：牙髓疏松组织的核心和主体，含有粗大的神经纤维和血管。 二、结构特点 细胞+ 细胞间质+ 细胞间液 （一）细胞 成牙本质细胞、成纤维细胞、防御细胞和储备细胞
1、成牙本质细胞 成牙本质细胞是一种特殊的牙髓结缔组织细胞，具有形成牙本质的作用，是牙髓牙本质复合体的特征性细胞。 成牙本质细胞在牙髓周边呈并肩的栅栏状排列，在髓角处，由于细胞的过度拥挤，也可呈假复层排列。细胞的大小和形状随所在部位不同而不同，在髓室区呈高柱状，在颈部和根中部呈矮柱状和立方状，而在根尖区呈扁平状。 成牙本质细胞突是牙本质伸入牙本质小管中的原浆突。 2、成纤维细胞 成纤维细胞是牙髓中的主体细胞，又称为牙髓细胞。成纤维细胞可产生明胶状基质和胶原纤维，未成熟的成纤维细胞可分化为成牙本质细胞。成纤维细胞的健康状态可以反映出牙髓的年龄和活力，以及牙髓抵御外来有害刺激的潜能。 3、防御细胞 具有防御作用的细胞有：巨噬细胞(可吞噬细菌、异物或坏死细胞，同时具有抗原提成作用，参与免疫反应)、树突细胞、淋巴细胞、肥大细胞等，可能与牙髓的免疫监视有关。 4、储备细胞 是指原始的、未分化的间质细胞，主要分布在血管附近和多细胞层。它是牙髓细胞的储备库,根据需要可分化成不同类型的细胞，如分化为成纤维细胞或成牙本质细胞。 （二）细胞间成分 牙髓细胞间成分包括胶原纤维、不定形基质和细胞间组织液，它们在维持牙髓结构的完整性和牙髓的生理功能方面具有重要意义。 1、胶原纤维：牙髓中含有丰富的胶原纤维，其交织成松散和不规则的网状，以支持牙髓组织中其他结构成分。牙髓中存在着大小不同的胶原纤维。 2、基质及组织液 基质是细胞间的不定形胶状物质，主要成分是蛋白多糖。基质包绕和支持牙髓中的各种有形成分，并且是血管与细胞之间传递营养物质和废料的重要介质。组织液来源于毛细血管，其成分与血浆相似。 一些实验表明，正常牙髓内组织压大约在0.8~1.3kPa之间，在可复性牙髓炎时，组织压可上升到1.7kPa左右，而在急性牙髓炎时，其组织压可上升到4.6kPa，过高的组织压提示了牙髓炎处于不可复状态。 第二节牙髓的功能 1、成牙本质细胞细胞形成牙本质 2、血管系统向牙髓牙本质复合体提供营养成分 3、感觉神经纤维传导痛觉 4、成牙本质细胞及结缔组织成分对外界刺激的保护性反应 一、形成功能： 牙髓在牙的整个生命过程中有不断形成牙本质的功能。形式： 1、原发性牙本质：初期形成的牙本质。 2、继发性牙本质—功能性牙本质：原发性牙本质形成后所形成的牙本质。在行使咀嚼功能以后所形成的牙本质。 3、刺激性牙本质—修复性牙本质：外界刺激诱发牙髓形成的牙本质。是机体的一种防御反应，避免牙髓受到外界的刺激。 二、营养功能 牙髓因为有丰富的周边毛细血管网，故通过向牙本质细胞和细胞突提供氧、营养物质以及牙本质液来保持牙本质的活力。
一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min 得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 , 反复用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上 , 2 000 r / min 离心 20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加比重为的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM洗涤细胞两次，每次以1000r/min 离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼 , 反复用PBS缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除 Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞 ; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞 , 包括 T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞 ; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞 , 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液 , 加入μL CD45- FITC和10μL CD34- PE 充分混合 , 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定 , 上机检测。 磁性标记 CD34+细胞：在细胞悬液中加入100μL Fc - R阻滞剂 , 再加入100μLCD34 磁珠标记细胞 , 于4℃冰箱中充分混合孵育 30 min。用PBS 缓冲液洗涤细胞，离心10 min , 去上清液后再以500μL PBS缓冲液重新悬浮细胞。 MiniMACS磁性分离、纯化CD34+细胞：将MS分离柱放置在MACS分离器的磁场中，以500μL PBS 缓冲液漂洗。以孔径30μm的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块 , 细胞通过分离柱 , 以500μL PBS
间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。
牙髓间充质干细胞生产 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
牙髓间充质干细胞生产 I．目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程。 II．范围：适用于牙髓间充质干细胞的生产；适用于技术部和各中心技术组的所有技术人员。 III．职责： 1.生产主管负责本制度的执行和监督； 2.技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作； 3.监督员负责全程监督，并即时按要求填写《牙髓间充质干细胞生产记录》和《生产试剂耗材记录表》。 附表1牙髓/骨髓/脂肪/胎盘/脐带间充质干细胞生产记录 附表2生产试剂耗材记录表 IV．规程： 一、牙髓间充质干细胞原代操作 消化法： 1.仪器耗材 1）10ml移液管 2）培养皿 3）50ml离心管 4）100μm筛网 5）T75培养瓶 6）15ml离心管 2.试剂 1）生理盐水 2）培养基 3）胶原酶 3.酶消化法操作流程 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min；
取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，转移到50ml离心管中，加入生理盐水至 30ml,再加入%胶原酶； 置于37℃恒温摇床，180rmp消化30min； 用100μm滤网过滤； 离心10min，吸取洗涤液4ml交给质检，并填写《样本取样单》； 附表3样本取样单 培养弃剩余上清，调整细胞浓度为107/ml,置于75cm2培养瓶中,放入37℃，CO 2 箱中进行培养。 4.组织块法操作流程： 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min； 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，将组织块均匀铺到T25培养瓶（用适量FBS 润湿瓶底）瓶底； 倒置培养瓶，并加入5ml培养基，放入培养箱中培养； 后，将培养瓶轻轻翻转，将牙髓组织块浸入工作液中。 二、牙髓间充质干细胞换液 1.耗材 1）10ml移液管 2）15ml离心管 2.试剂 培养基 3.操作流程 镜下观察状态细胞； 吸取上清液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；
口腔医学主管技师（基础知识）模拟试卷15 (总分：200.00，做题时间：90分钟) 一、 A1/A2型题(总题数：68，分数：136.00) 1.哺乳纲与爬行纲牙齿演化的相同特点是 （分数：2.00） A.形状 B.数目 C.牙根 D.牙列多少 E.附着牙合骨的方式√ 解析：解析：爬行类动物牙齿为单锥体、同形牙、多牙列，并以侧生和槽生等方式逐渐分布于上、下颌骨上；哺乳类动物牙齿为异形牙、双牙列、牙根发达，深埋于颌骨的牙槽窝内。 2.唾液的主要成分中不包括 （分数：2.00） A.黏液 B.白蛋白√ C.唾液淀粉酶、麦芽糖酶 D.黏蛋白、溶菌酶 E.钾、钠、钙、镁 解析：解析：唾液中水分约占99．4％，固体物质约占0．6％(其中有机物约占0．4％，无机物约占0．2％)。有机物主要为黏蛋白、球蛋白、氨基酸、尿酸和唾液淀粉酶、麦芽糖酶、溶菌酶等，无机物主要有钠、钾、钙、氯化物、碳酸氢盐和无机磷酸盐等，其次为镁、硫酸盐、氰酸盐、碘化物和氟化物等。唾液中的黏液主要是黏蛋白，还可混有脱落的上皮细胞、细菌、白细胞和龈沟液。 3.牙的组成部分不包括 （分数：2.00） A.牙釉质 B.牙本质 C.牙骨质 D.牙槽骨√ E.牙髓 解析： 4.斜嵴的构成是 （分数：2.00） A.近中舌尖与远中舌尖三角嵴相连 B.远中颊尖与远中舌尖三角嵴相连 C.近中颊尖与远中舌尖三角嵴相连 D.远中颊尖与近中舌尖三角嵴相连√ E.近中舌尖与远中舌尖三角嵴相连 解析：解析：由远中颊尖三角嵴与近中舌尖三角嵴相连成嵴，称为斜嵴，为上颌第一磨牙的解剖特征。5.前牙牙合运循环的作用是 （分数：2.00） A.切割食物√ B.穿刺食物 C.撕裂食物 D.压碎食物 E.磨细食物 解析：解析：切牙位于口腔前部，主要功能为切断食物。
肿瘤干细胞培养技术 随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。 肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。 无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生
长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。 一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子 (一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming Growth Factor ,TGFβ)和
牙髓干细胞向神经细胞方向的诱导分化实验 贺慧霞;金岩;史俊南;罗玉庆;周艳妮;彭智;许玉和 【期刊名称】《华西口腔医学杂志》 【年(卷),期】2007(025)004 【摘要】目的探讨克隆化培养分离的人牙髓干细胞是否具有向神经细胞方向分化的潜能,并确定其诱导条件.方法克隆化培养的人牙髓干细胞预诱导24 h,然后换含一定浓度二甲基亚砜(DMSO)、丁羟基茴香醚(BHA)、forskolin、β-巯基乙醇(β-ME)和氢化可的松(hydrocortisone)的联合诱导液连续诱导4 d,对诱导细胞进行形态学观察,神经胶质酸性蛋白(GFAP)、非特异性酯酶(NSE)免疫组化染色和GFAP mRNA RT-PCR检测.同时,以未诱导细胞为对照.结果诱导12 h 时细胞形态开始改变,24 h时分化为较为典型的神经细胞样细胞,继续诱导分化细胞数量增多;诱导细胞表达神经元细胞特异性标志NSE和GFAP蛋白;RT-PCR 检测诱导细胞表达GFAP mRNA,而未诱导细胞均无上述改变和表达.结论人牙髓干细胞在一定的诱导条件下可横向分化为神经元样细胞. 【总页数】4页(331-334) 【关键词】牙髓干细胞;诱导;分化 【作者】贺慧霞;金岩;史俊南;罗玉庆;周艳妮;彭智;许玉和 【作者单位】第四军医大学口腔医院病理科,组织工程中心,陕西,西安,710032;武警甘肃总队医院,口腔科,甘肃,兰州,730050;第四军医大学口腔医院病理科,组织工程中心,陕西,西安,710032;第四军医大学口腔医院,牙体牙髓科,陕西,西安,710032;兰州军区临潼疗养院三区,门诊部,陕西,西安,710600;武警甘肃总队医院,口腔科,甘肃,兰州,730050;武警甘肃总队医院,口腔科,甘肃,兰州,730050;武