牙髓干细胞
1牙髓干细胞概念
牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年Gronthos[1]等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)。现在普遍认为牙髓组织中具有形成细胞克隆能力和较强增殖能力的未分化间充质细胞即DPSCs[2]。
2牙源性干细胞
至今，已从人类牙齿相关组织中分离和鉴定出7种干细胞:
(1)牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)[1]，来自恒牙牙髓；张巍巍等[3]以人牙髓干细胞为种子细胞与PLGA支架材料在体外进行复合培养，表明PLGA 有利于于牙髓干细胞的粘附与增值。Lindroos等[4]得到DPSC与其他间充质源性干细胞具有相似的表面标志物和骨相关性的标志物的结论，支持DPSC在硬组织再生方面的可能性。从成人第三磨牙牙髓中分离的DPSC在适宜的条件下可诱导分化为有功能活性的神经细胞，并在基因和蛋白水平表达神经组织专有的标志物[5]，为治疗神经系统方面的疾病提供了新的途径。DPSCs不表达成牙本质细胞特征性蛋白DSP、DMP，则表明DP-SCs尚处于未分化状态[6]。我国学者通过对根髓和冠髓进行比较时发现：DPSCs 存在于全部牙髓之中,在根髓中的密度更高[7]。
(2)人类脱落乳牙牙髓干细胞(stem cell from the pulp of human exfoliated deciduous teeth, SHED),来自儿童脱落乳牙的牙髓;Miura等[8]研究发现，正常脱落的乳牙牙髓中的细胞经培养会表现出成纤维细胞样生长，其增殖率和群体倍增数均比骨髓基质干细胞(BMMSC)、DPSCs高，于是首次提出了SHED的概念。Shen YY等[9]发现SHED在体外培养过程中可以表达成骨细胞的标志，如RUNX-2、OCN、BSP，表明SHED在体外可以分化为成骨细胞;将SHED与人类牙齿切片复合后，在体外培养或是植入免疫缺陷小鼠皮下，均表达成牙本质细胞分化的标志( DSPP，DMP-1，MEPE)[10]。一系列实验表明SHED在体内只能诱导宿主细胞分化为成骨细胞[11]，而其自身无法分化为成骨细胞，但在体外培养过程中却可以分化为成骨细胞。SHED 可能还具有参与机体的免疫调节等功能[12]。李丽文[13]等用不同密度接种培养DPSCs,计算细胞产量、倍增次数, 观察细胞形态、检查克隆形成率和钙结节形成能力的方法得到，1.5～3cells/cm2低密度接种培养DPSCs 有利于细胞快速扩增,扩增后的细胞保持较高的增殖和分化潜能。SHED的增殖能力、克隆形成效率和钙结节形成能力均优于DPSCs。
(3)根尖乳头干细胞(stem cell from the apical papilla,SCAP)[14,15]，来自牙根发育未完成的根尖乳头；Abe等[16]从人年轻第三磨牙根末端分离根尖周牙乳头，
并采用酶消化法从中分离出细胞进行研究，结果发现这种细胞在低密度下培养时，能够像其他间充质干细胞一样形成贴壁生长的克隆原细胞聚集，并具有成骨、成牙本质和成脂等多向分化潜能，因而作者将这种细胞命名为SCAP。SCAP是牙根发育时成牙本质细胞的重要来源，在牙根的形成和发育中起着重要的作用，具有强于DPSCs的群体倍增能力以及增殖率、端粒酶活性和细胞迁移率，是一种极具潜力的成体干细胞[17]。
张富强等[18]以第l代猪牙乳头细胞作为干细胞与β-磷酸三钙支架复合后将其接种于裸鼠皮下，结果成功地构建出牙髓牙本质复合体样结构。Ikeda等[19]发现，人牙乳头间充质细胞经过培养、增殖和处理可分化为成骨组织，说明人牙乳头间充质细胞可用于骨组织再生。Shi等[20]还发现根尖牙乳头间充质细胞的牙再生能力强于DPSC，原因是牙乳头中所含的干细胞数量高于成熟的牙髓。
(4)牙周膜干细胞(periodontal ligment stem cell,PDLSC)或牙周膜祖细胞(periodontal ligment progenitor cell,PDLPC)[21]，均来自牙周膜; Byoung-Moo等[22]用酶消化法将健康成年人的牙周膜组织制成单细胞悬液进行体外培养，通过克隆筛选和磁珠分离得到了具有形成细胞克隆能力和高度增殖能力的细胞，从而提出了牙周膜干细胞(PDLSCs)的概念。正常情况下，牙周膜细胞可通过增殖和分化使其本身以及与之相连的牙骨质和牙槽骨处于不断更新和改建的状态。而当受到疾病或外界刺激时，则可通过牙周膜中干细胞的不断增殖和分化使组织再生[23]。关于PDLSCs的细胞表型，免疫组化结果显示PDLSC 表达间充质干细胞的标志物，而这些标记物是鉴定PDLSC的基础[24]。PDLSC和PDLP则偏重牙周组织的重建。在临床上主要是利用干细胞的分化和再生潜力促进组织愈合和再生[25,26]。
(5)人类智齿牙滤泡祖细胞(precusor cell from human dental follicle of wisdom teeth,PC)，或称为牙囊干细胞(dental follicle stemcell,DFSC)[27],来自智齿牙囊；牙囊(dental follicle，DF)是包绕发育牙齿的疏松结缔组织。Honda等[28]从小牛牙根形成阶段的恒切牙牙胚中分离出牛DF细胞，进行了一系列试验，证明DF细胞中含有牙周膜细胞及牙骨质细胞的前体细胞；目前研究发现在口腔的不同组织中均分离出干细胞。
(6)牙槽骨干细胞(alveolar bone proper derived stem cell,ABPSC)[29],来自牙槽骨骨髓。
(7)牙龈/口腔黏膜干细胞(ginginval/oral mucosa stem cell,OMSC)[30,31]，来自牙龈黏膜下结缔组织或来自牙胚的间充质干细胞(mesenchymal stem cell from tooth germ)[32]，其来源属于牙髓干细胞；另外还有根尖牙囊干细胞(periapical follicle stem cell, PAFSC)[33]，属于上述的SCAP。
牙源性干细胞具有间充质干细胞的功能特性和多向分化能力，并表达间充质干细胞的表面标志物如CD44、CD73、CD105，但不表达CD34和CD45[34]。不同来源的牙源干细胞如图1所示。
OMSC:牙龈/口腔黏膜干细胞;ABPSC:牙槽骨干细胞;DPSC:牙髓干细胞;SHED:人类脱落乳牙牙髓干细胞;DFSC:牙囊干细胞;SCAP:根尖乳头干细胞;PDLSC:牙周膜干细胞。
图1 不同牙源干细胞的来源组织部位
3牙髓干细胞的分离培养
3.1仪器和材料
仪器：超净工作台。倒置相差显微镜及照相系统，流式细胞分析仪，细胞筛网，JEM-2000EX透射电镜。平底24孔、96孔塑料培养板。二氧化碳恒温培养箱，细胞培养瓶及培养板，高速离心机，细胞记数板，可见光分光光度计，酶联免疫检测仪。
材料：现在国内实验中采用的普遍的牙髓细胞来源于临床上因阻生而完整拔除的下颌第三磨牙(获得患者许可)，要求牙齿健康，无牙体牙周疾病，患者年龄12~25岁[35]。人源乳牙：6~10岁健康儿童无牙体牙髓疾病的滞留乳牙；鼠源性牙髓细胞：5周龄大鼠，雄性。5周龄裸鼠，雌性；犬源性牙髓细胞：5~6个月龄的比格犬的健康年轻恒牙；4~6月龄小型猪乳下切牙等牙齿。
3.2细胞分离培养
培养牙髓干细胞方法有酶联合消化法、组织块培养法和组织块酶消化法。分离牙髓干细胞方法有三维悬滴法和免疫磁珠分选法。
3.2.1酶联合消化法
以2000年，按Gronthos等[1]的酶联合消化方法,将人乳牙牙髓组织在完全培养液浸润下剪碎，3 g/L collagenase type I、4 g/L dispase按1∶1比例混合，于37 ℃水浴中消化乳牙牙髓组织1 h，离心弃上清液，沉淀用培养液充分混匀，
反复吹打离散细胞团块，经70μm的细胞筛网过滤获得单细胞悬浮液，加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM培养液，置入3.5cm培养皿内37℃恒温培养箱标准条件下培养。
别利克孜·卡德尔[36]等人在2013年对酶联合消化法进行了改良。将人乳牙牙髓组织标本块浸入同样的消化液中，仅在37℃水浴中消化15 min左右，待组织块呈絮状加入完全生长液终止消化，300g离心力离心5 min，弃去上清液，将组织团块均匀铺入3.5 cm的培养皿中，在各组织块处分别滴加50-100 μL完全生长液，置入37℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育，两三天更换完全生长液，待组织周边有较多的细胞爬出后，挑弃组织块，补足完全生长液继续孵育。当大多数克隆的细胞汇合至80%-90%时，吸弃培养液，进行传代扩增培养。
3.2.2组织块培养法
新鲜采集的牙髓，在生物安全柜中用PBS洗3遍，置于6 cm培养皿中，加入少量完全DMEM/F12培养基（其中含20%FBS、1% L-Glutamine、1% NEAA 及1%双抗）浸润牙髓组织，用无菌手术剪将其剪碎，盖玻片将组织块固定在培养皿中，37℃、5﹪CO2培养。48 h换液，此后每3、4d更换1次培养基。培养约10~14d会有细胞从组织块中爬出，细胞达到80﹪~90﹪汇合后，用TrypLE在37 ℃消化，按1:3比例传代[37]。
3.2.3组织块酶消化法
(1)牙拔除后用75%酒精擦拭牙体表面消毒，再用含青霉素、链霉素的PBS 浸洗牙2次备用；
(2)原代细胞培养：无菌条件下劈开牙齿，取出牙髓，切除根尖部约2 mm 牙髓组织，剪成大小约1mm×1mm×1mm的组织块，用4%Ⅰ型胶原酶消化45min，终止消化，1000r/min离心5 min，弃上清，所得组织用含20%胎牛血清的α-MEM 培养液重悬后接种于35 mm培养皿，于37℃、5%CO2恒温孵箱内培养，待细胞长至80%汇合率时，胰酶消化传代．
(3)有限稀释法克隆纯化人牙髓干细胞：取对数生长期的原代细胞，调整细胞密度，把细胞稀释到＜10个/mL，以100μl /孔接种于96孔培养板内，培养24 h后镜检，挑出单个细胞的孔，继续培养；待单克隆面积至孔底50%以上时，取多个克隆培养细胞混合扩大培养[38]。
3.2.4三维培养法
参考并改进Gronthos[1]的方法，从健康人体的第三前磨牙中获取牙髓，用酶消化法和酶解组织块法进行原代DPSCs培养并常规传代。
人DPSCs的三维培养法：将处理好的0.25g Cytodex3微载体与50ml含1×105/ml第四代DPSCs的新鲜DMEM/F12(含15%FBS)混合均匀，载入经高压灭菌的HARV中，此时，培养基充满整个容器，无气泡，调整转速，使微载体不与器壁碰撞，不在中心聚集。整个装置放入37℃，5% CO2的培养箱中。
常规换液[39]。
3.2.5免疫磁珠分选法
原代细胞收集方法：按照Gronthos[1]的方法，在体外进行原代培养，获得细胞放入37℃，5%CO2培养箱中培养3 d后弃去未贴壁细胞，PBS清洗每3d 换液一次。细胞生长达80%融合时1：3传代。
取生长状态良好的第3代乳牙牙髓细胞1×108，以含1%胎牛血清的PBS 重悬，加入STRO-1抗体，4℃孵育60min，每隔10min轻振，防止细胞沉淀。然后用含1%的胎牛血清的PBS清洗3次，去除残留抗体；细胞再次重悬通过30μm的滤网获得单细胞悬液，按说明加入相应剂量的磁珠混匀，4℃孵育15min，加入10ml缓冲液以300g离心力离心10min，完全去除上清;加500μl缓冲液混匀细胞团；将分选柱置磁力架上，用500μl缓冲液预先润湿分选柱，缓冲液快要滴完时将细胞悬液加入到分选柱内不要产生气泡，待细胞悬液将要滴完时加入500μl缓冲液重复3次，收集从分选柱流出的乳牙牙髓细胞；从分选器上取下分选柱加入1ml缓冲液用分选柱配套的推子快速推下，将收集到的SHED再次经过分选柱重复筛选一次。加入含15%的胎牛血清的全培4ml置37℃，5%CO2培养箱中培养[40]。
4牙髓干细胞在口腔科学的用途
4.1牙本质/牙髓组织的修复和再生
Couble等[41]培养发育早期的牙髓，发现可分化形成成牙本质细胞。研究可以得出结论牙髓干细胞在成牙本质细胞遭受损失后，会分化为成牙本质细胞，成牙本质细胞分泌牙本质以维持牙本质的完整。DPSC、SHED和SCAP都具有一定多向分化潜能,其中包括形成牙本质/牙髓样复合体[42]。目前牙本质/牙髓组织修复和再生方法主要有以下几种。
(1)将牙髓干细胞直接植入牙髓腔。
(2)将牙髓干细胞与支架结合植入牙髓腔。
(3)将牙髓干细胞和支架材料先植入动物体内,再取出植入人体牙髓腔。
(4)将牙髓干细胞和支架材料种植在人类牙齿组织块上,再植入动物体内。
4.2牙体牙冠的再生
Yu等[35]将DPSC和成年鼠的根尖牙蕾细胞(apical bud cells)结合,在植入活体后形成典型的牙冠样结构，其中包括成釉细胞层、牙釉质、牙本质、前期牙本质和成牙本质的细胞层，Ikeda等[43]报导从小鼠牙齿发育的杯状期分离出成牙上皮细胞，将其与DPSC结合在胶原凝胶上进行体外培养，形成的牙胚植入小鼠颌骨内，结果发现此生物合成牙与牙槽骨结合良好，并具有天然牙齿的功能。
DPSCs的回植的研究，Zhang等[44]将体外培养的人第三磨牙DPSCs与海绵胶原、多孔陶瓷和纤维钛网3种三维支架复合，并分为2组，第1组在诱导
成骨的培养基中培养4周，第2组植入裸鼠皮下6周。结果表明，在第1组的3种支架材料中均可见丰富的细胞外基质矿化沉积,并有DSPP的表达,第2组均可见DSPP阳性的组织形成,但是此种组织与牙本质不同,更像结缔组织，而且仅在多孔陶瓷材料上有细胞外基质矿化。在口腔医学上，有望填补缺损的牙齿。
4.4颅骨、颌骨及面骨的损伤修复研究
2009年，d’Aquino等[45]用DPSC成功培养出骨组织碎片，将此碎片植入动物可产生有血管供应的板状骨。他们还报道了用DPSC治疗下颌骨缺损的临床研究结果。他们先拔取患者的上颌智齿，分离培养自体DPSC，再将其植入明胶载体产生DPSC复合体。然后拔除双侧下颌智齿，一侧置入DPSC复合体，另侧作对照。结果发现，术后60天，实验侧第二磨牙皮质骨垂直增生至牙釉与本骨质交界。术后3个月，新生骨组织、细胞因子、BMP-2和血管内皮生长因子(VEGF)的表达在实验侧显著高于对侧。术后1年,实验侧完全稳定骨化, 达到第二磨牙骨质再生的目的。
4.5口腔科学其他方面应用的研究
(1)牙髓干细胞与钛合金种植牙结合，Mangano等[46]对DPSC与钛合金表面的结合部位进行基因表达的研究，结果发现，DPSC能很快分化为成骨细胞和内皮细胞沿合金表面形成骨组织，并表达相应的特异蛋白标志物。
(2)牙源干细胞与透明质酸HA涂面的种植牙结合，Yamada等[47]报道，当DPSC或SHED与PRP合用，所形成的骨质能与涂有透明质酸(hyaluronic acid,HA)的种植牙根更好地结合。
5牙髓干细胞在其他疾病中的用途
5.1牙髓干细胞用于脑血管意外损伤的修复研究
Yang等[48]分离培养了人类第三磨牙的DPSC，并诱导其转化为神经干细胞(NSC)。将此NSC细胞移植到大脑中动脉栓塞大鼠模型，结果发现，治疗组的神经性障碍明显改善。Sugiyama等[49]从猪牙髓衍生取得DPSC细胞(CD31–/CD146–)。将Sprague-Dawley大鼠进行大脑中动脉栓塞，24小时后将DPSC细胞(CD31–/CD146–)注入大脑。结果发现,DPSC细胞体内分化为NSC 及神经细胞，表达double cortin的神经细胞数上升2倍；表达NeuN的神经细胞增长8倍；在缺血的脑部VEGF的水平比正常大脑提高28倍。此结果表明，来自牙髓的DPSC细胞(CD31–/CD146–)能够促进移植的和内源性的神经干细胞分化。
5.2牙髓干细胞用于脊髓损伤的修复研究
Nosrat等[50]研究表明，神经元可以从牙髓的干细胞诱导分化产生。随后，许多研究进一步表明，DPSC具有转化为神经元的能力。Huang等[51]成功地将
DPSC移植到小鼠海马区，并在体内分化为神经细胞，为牙源性干细胞修复中枢神经系统疾病提供了证据。Sakai等[52]移植DPSC和SHED到脊髓全断大鼠，结果发现DPSC和SHED的表面标志、基因表达和分泌的细胞因子发生明显改变。移植DPSC和SHED后，脊髓全断大鼠后肢的运动功能明显恢复，神经轴突明显再生。
DPSC可能通过三个方面促进脊髓损伤修复：(1)抑制损伤导致的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的凋亡；(2)直接抑制多种阻碍轴突生长的抑制因子如硫酸软骨素、蛋白聚糖和髓磷脂等相关糖蛋白；(3)分化为成熟的少突胶质细胞促进神经轴索生长[53]。
5.3牙髓干细胞用于帕金森氏病的修复研究
Nesti等[54]将DPSC与中脑神经组织细胞联合培养后移植到体外帕金森氏病(Parkinson’s disease)模型上，发现DPSC能提高大脑神经细胞对MPP＋或鱼藤酮所导致神经毒性的保护作用。Ibarratxe等[55]报道了牙髓干细胞用于帕金森氏病修复治疗具有许多优越性：牙源性干细胞比较容易得到自体细胞，可避免免疫排斥和炎症反应；DPSC本身具有神经细胞及胶质细胞标记物的表达；DPSC 具有类似神经元的电活动如表达神经细胞的受体，并产生动作电位；DPSC可在宿主的神经组织内生长存活。
5.4牙髓干细胞用于心肌梗死、糖尿病和免疫缺陷性疾病的修复研究
Gandia等[56]用冠状动脉结扎法在大鼠裸鼠造成急性心肌梗死的模型,并将DPSC注入心肌内。4周之后显示心肌功能改善,梗死区缩小，新血管形成增加。他们认为，DPSC可以作为急性心肌梗死细胞疗法的干细胞来源。Govindasamy 等[57]报道将DPSC分化为胰岛样细胞聚集体(islet-like cell aggregates,ICA),并发现其表达相应的转录因子如CPP、Pdx1、Pdx4、Pdx6、Ngn和Isl1等,从而起到调节血糖治疗糖尿病的作用。研究表明,MSC对很多自身免疫疾病(系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症等)有一定的疗效，可能是通过免疫调节发挥作用[58,59]。
6牙髓干细胞的研究进展
6.1国外牙髓干细胞研究进展
1999年，Harada等[60]发现在小鼠切牙颈环星网状层中心的上皮细胞层存在干细胞,维持小鼠切牙终生不断萌出。2000年，Gronthos S等[1]人发现人牙髓组织中同样存在成体干细胞，首先牙髓干细胞提出的概念。2002年，Young等[61]分离猪第三磨牙牙胚，制备单细胞悬液，并接种到可降解的聚合物支架上，植入大鼠肠系膜内生长20~30周，可成功地构建出牙齿结构，包括含成熟牙釉质的釉器官、牙本质、成牙本质细胞、髓室、上皮根鞘和成牙骨质细胞，证实在猪第三磨牙有上皮和间充质干细胞的存在。Miura等[7]从人脱落乳牙中分离到干
细胞,其具有较DPSCs和BMSCs更高的增生能力和克隆形成能力，并可以分化成神经细胞、脂肪细胞和成牙本质细胞，回植小鼠体内后可形成骨和牙本质，注射入小鼠脑内生存可超10 d，并可表达神经标记物神经微丝(neurofilament,NFM)。他们把这种干细胞命名为脱落乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)。
2004年，Norsat等[52]发现牙髓细胞能产生多种神经营养因子，并为多巴胺能神经元提供营养支持，与三叉神经元复合培养可刺激轴突生长，而且DPSCs 可以在体外分化为神经元,证明DPSCs具有多相分化潜能。2006年，Iohara K 等[62]发现DPSCs表达STRO-1、CD146、CD34以及c-kit这几种间充质干细胞表面抗原。在成人牙髓组织中，STRO-1主要定位于血管壁和神经束膜，CD146定位于牙髓的微血管，而STRO-1和CD146的共表达仅限于血管外壁，因此推测DPSCs来源于血管周的微环境。2008年，Prosper F等[63]表示应用DPSCs 于各种组织的修复和疾病治疗中已成为可能。
2009年，Monterio等人[64]发现牙髓干细胞向中胚层细胞分化，诱导分化为成牙本质细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞等并在适当条件下具有向内胚层细胞分化的潜力。2010年，Sakai等人[12]发现DPSC和SCAP可生成牙本质-牙髓复合体，而SHED生成矿化组织而非牙本质-牙髓复合体。将SHED 接种到牙片支架上并将其植入免疫缺陷小鼠皮下培养，经四环素染色和显微镜观察发现，SHED生成带小管的牙本质组织。
2011年，研究人员发现牙本质再生需要有活性的牙髓组织，牙髓组织的再生需要有血液的供养[65]。利用干细胞进行组织再生则需要生成有效的血管网络，为移植的细胞提供氧气和营养，保证细胞在参与组织再生时的需要[66]。在血管生成和血管再造的过程中，在明胶微球支架中加入VEGF并将其接种DPSC后将其植入到空的根管内，再将其植入到切除根尖的小鼠牙槽根管中培养4～8周，空的根管内形成了带血管的牙髓组织[67]。2013年，Mead B等[68]人有证据表明牙髓干细胞可能是一个更合适的细胞类型比视网膜治疗骨髓间充质干细胞。雪旺细胞在维持外周神经功能程中发挥重要作用。2014年，Martens等[69]发现损伤后神经再生修复过，人DPSCs经诱导分化，可以分化为雪旺细胞。具有髓鞘形成能力。
6.2国内牙髓干细胞的研究进展
1998年，田卫东等人[70]应用完整的胚胎上皮和分离的牙间充质细胞或其他组织的MSC构建的再生牙有正常的牙冠形态，这一点要优于应用成体牙细胞。2004年，贺慧霞等人[39]透射电镜下，DPSCs的核呈卵圆形，约占胞体体积的80%~90%，核仁大而明显，常染色质居中，异染色质少，分布于核周。胞浆很少，核浆比例大。细胞器较少，核糖体丰富。这些形态特征体现了DPSCs的未分化或低分化状态。
2005年，杨雪超等人[71]成功国内学者也成功的诱导了DPSCs向成牙本质
细胞、肌管样细胞以及脂肪细胞的分化。2007年，刘彩霞等人[72]将其与羟磷灰石-磷酸三钙支架复合并将其植入免疫缺陷小鼠体内，形成了牙骨质和牙周膜样的新生组织。2008年，张富强等人[18]以第l代猪牙乳头细胞作为干细胞与β-磷酸三钙支架复合后将其接种于裸鼠皮下，8周后行组织学、牙本质涎蛋白免疫组化和透射电镜检测，结果成功地构建出牙髓牙本质复合体样结构。
2010年，在成骨诱导分化实验显示:体外矿化诱导DPSCs 40d后，骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)和骨钙素(osteocalcin，OCN)免疫荧光染色阳性，可见骨小梁结构；随后将此骨样组织回植入免疫缺陷小鼠背部皮下，4周后形成发育良好的板状骨，表明DPSCs在特定矿化条件下有成骨能力[2]。目前最常用的培养骨髓间充质干细胞的方法是密度梯度离心法。此方法培养的骨髓间充质干细胞纯度较高，培养周期短，采用此法分离培养骨髓间充质干细胞。牙髓干细胞常用的培养方法是免疫磁珠分选法[73]。
2011年，霍永标的文章看出台湾地区在内的多家牙齿细胞库的建立更是使得牙髓干细胞的研究从实验室研究走向临床应用[74]。2012年，赵珊梅的实验结果证实了[75]报道中经过抗生素处理的炎症牙髓干细胞的原代培养成功率(80%)显著高于未经过抗生素处理组的成功率(30%)。因此，多种防止细菌污染的措施被应用到口内直接拔髓及原代培养操作过程中。在成脂分化中，多采用成脂诱导液进行诱导，观察脂滴的形成情况，也可检测成脂肪向分化相关基因，如：过氧化物酶增殖物激活受体γ2、脂肪酶结合蛋白aP2和脂蛋白脂酶等[76]。
多向分化潜能是DPSCs主要的生物学特性之一，常用的鉴定方法有矿化诱导、成脂分化诱导及成神经分化诱导等．在矿化诱导中，多采用矿化诱导液进行诱导，观察矿化结节的形成情况，同时可进行相关矿化基因的检测，目前常用于鉴定的细胞标记物主要包括:I型胶原、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白等[77]。2015，王娟等人[78]的实验表明低浓度他莫昔芬对牙髓干细胞增殖无明显影响，一定浓度的他莫昔芬对hDPSCs成骨/成牙分化具有促进作用。
7总结
牙髓干细胞自1998年被实验发现，2000年被确认。国内外学者对人源、鼠源和猪源性牙髓干细胞进行了研究实验。发现DPSCs能促进牙髓组织再生和生成牙本质细胞来修复牙本质，为牙体牙髓疾病提供了新的一种治疗途径。现在DPSCs已经被证实具有多向分化能力。DPSCs分化为成骨细胞和血管内皮细胞。特别是DPSCs的成骨能力对以后的临床应用有重要意义。
在口腔医学研究领域，DPSC的分离提取较为方便，常常可以通过分离某些牙源废物的髓质成分获得。因此，该细胞在分离培养方面的便宜性以及本身具有的多向分化潜能、自我更新能力，均在很大程度上决定了该细胞在再生医学中的广泛应用前景。但是，关于DPSC诸多方面的研究尚处于起步阶段，特别是在体内应用性研究方面，仍需进一步探索。所以，只有建立一种高效稳定、安全可靠的DPSC的应用模式，DPSC才能真正走进临床，服务于人类。
摘要
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国内外干细胞的研究进展 摘要：干细胞研究是近年来生物医学领域的热门方向之一，干细胞产业具有巨大的社会效益和市场前景，受到世界各国的高度重视。美国、欧盟、日本、韩国和中国在干细胞领域投入重金支持基础和临床研究，大力推动干细胞产业化发展。本文通过对比世界干细胞研究的热点领域，分析了中国在该学科取得的成绩和存在的差距，进一步提出了针对中国干细胞研究发展的政策建议。 关键词：干细胞，研究现状，前景与展望 Abstract: Stem cell research is one of the hot research fields in biomedicine nowada ys. Many countries attach importance to the stem cell industry because of the great s ocial benefits and market potential. USA,EU,Japan,Korea and China have increased the input of capital dramatically to promote the basic and clinical research of stem cel l as well as stem cell industry. By comparing the situation of stem cell research at ho me and abroad,we found that,in recent years,an obvious progress has been made in stem cell research, however, the gap between China andthe developed countries still exists. And further puts forward the policy suggestions in the development of stem c ell research in China. Key words：stem cells，research status，prospect 1、前言 20世纪90年代以来，随着细胞生物学技术的发展及体外分离、培养人胚胎干细胞的成功，干细胞经适当诱导分化可发育为不同类型的细胞、组织和器官，成为移植供体的新来源，作为“种子细胞”的干细胞可以通过细胞工程的方法在体外发育为各种特异性的细胞供移植和细胞替代所需，并可作为基因疗法的靶细胞用于治疗和研究。由于干细胞有广泛的应用前景，它已成为近年来医学和生物学领域研究的热点。 干细胞（stem cells）是人体及其各种组织细胞的最初来源，是一类具有自我更新、
牙髓干细胞 1牙髓干细胞概念 牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年Gronthos[1]等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)。现在普遍认为牙髓组织中具有形成细胞克隆能力和较强增殖能力的未分化间充质细胞即DPSCs[2]。 2牙源性干细胞 至今，已从人类牙齿相关组织中分离和鉴定出7种干细胞: (1)牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)[1]，来自恒牙牙髓；张巍巍等[3]以人牙髓干细胞为种子细胞与PLGA支架材料在体外进行复合培养，表明PLGA 有利于于牙髓干细胞的粘附与增值。Lindroos等[4]得到DPSC与其他间充质源性干细胞具有相似的表面标志物和骨相关性的标志物的结论，支持DPSC在硬组织再生方面的可能性。从成人第三磨牙牙髓中分离的DPSC在适宜的条件下可诱导分化为有功能活性的神经细胞，并在基因和蛋白水平表达神经组织专有的标志物[5]，为治疗神经系统方面的疾病提供了新的途径。DPSCs不表达成牙本质细胞特征性蛋白DSP、DMP，则表明DP-SCs尚处于未分化状态[6]。我国学者通过对根髓和冠髓进行比较时发现：DPSCs 存在于全部牙髓之中,在根髓中的密度更高[7]。 (2)人类脱落乳牙牙髓干细胞(stem cell from the pulp of human exfoliated deciduous teeth, SHED),来自儿童脱落乳牙的牙髓;Miura等[8]研究发现，正常脱落的乳牙牙髓中的细胞经培养会表现出成纤维细胞样生长，其增殖率和群体倍增数均比骨髓基质干细胞(BMMSC)、DPSCs高，于是首次提出了SHED的概念。Shen YY等[9]发现SHED在体外培养过程中可以表达成骨细胞的标志，如RUNX-2、OCN、BSP，表明SHED在体外可以分化为成骨细胞;将SHED与人类牙齿切片复合后，在体外培养或是植入免疫缺陷小鼠皮下，均表达成牙本质细胞分化的标志( DSPP，DMP-1，MEPE)[10]。一系列实验表明SHED在体内只能诱导宿主细胞分化为成骨细胞[11]，而其自身无法分化为成骨细胞，但在体外培养过程中却可以分化为成骨细胞。SHED 可能还具有参与机体的免疫调节等功能[12]。李丽文[13]等用不同密度接种培养DPSCs,计算细胞产量、倍增次数, 观察细胞形态、检查克隆形成率和钙结节形成能力的方法得到，1.5～3cells/cm2低密度接种培养DPSCs 有利于细胞快速扩增,扩增后的细胞保持较高的增殖和分化潜能。SHED 的增殖能力、克隆形成效率和钙结节形成能力均优于DPSCs。 (3)根尖乳头干细胞(stem cell from the apical papilla,SCAP)[14,15]，来自牙根发育未完成的根尖乳头；Abe等[16]从人年轻第三磨牙根末端分离根尖周牙乳头，并采用酶消化法从中分离出细胞进行研究，结果发现这种细胞在低密度下培养时，
细胞研究进展概述——干细胞技术 20092358 谢芬霏16120901 生物技术 摘要：干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制、高度增殖和多项分化的潜能。干细胞的研究正在向现代生命科学和医学等各个领域交叉渗透，干细胞的研究也成为了生命科学的热点，本篇就几个干细胞的研究方向的进展展开一些介绍。 关键词：干细胞；多能性；神经干细胞；造血干细胞 引言： 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell,TSC)、多能干细胞（pluripotent stem cell）和单能干细胞（unipotent stem cell）。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞的形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。胚胎干细胞(Embrtibuc stem cell)的发育等级较高，是全能干细胞（Totipotent stem cell），而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。据最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。胚胎的分化形成和成体组织的再生是干细胞进一步分化的结果。胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力，而成体组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。 1 胚胎干细胞 1.1 胚胎干细胞的概念和生理学特性 胚胎干细胞（Embryonic Stem cell，ES细胞）。胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。胚胎干细胞的生物学特性有：①全能性，在体外培养的条件下, 胚胎干细胞可以诱导分化为机体的任何组织细胞。全能性的标志是细胞表面有胚胎抗原和Oct4蛋白【1】。②无限增殖性。胚胎干细胞在体外适宜条件下, 能在未分化状态下无限增殖。③胚胎干细胞具有种系传递的功能。④胚胎干细胞易于进行基因改造操作。⑤细胚胎干胞保留了正常二倍体的性质且核型正常。早在1970年Martin Evans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养【2】，而人的胚胎干细胞的体外培养直到最近才获得成功。进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。在98年末，两个研究小组成功的培养出人类ES细胞，保持了ES细胞分化为各种体细胞的全能性。这样就使科学家利用人类ES细胞治疗各种疾病成为可能。然而，人类ES 细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行
简述干细胞的形态特征及其研究进展 干细胞是一类具有自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类各组织器官的原始的多潜能的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。根据它所处的发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。 胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。 干细胞的形态特征： 干细胞具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。 1 胚胎干细胞：胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的 细胞即为胚胎干细胞。具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。进一步说，胚胎干细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 2 成体干细胞：成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具 有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 3 造血干细胞：造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在 于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。 4 神经干细胞:理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经 干细胞功能的紊乱。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应。除此之外，神经干细胞的功能还可延伸到药物检测方面，对判断药物有效性、毒性有一定的作用。 5 肌肉干细胞:可发育分化为成肌细胞，可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。
干细胞研究进展(综述) Advances in the research of stem cells（LR） 【摘要】：干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源,具有高度自我复制、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞技术是生物技术领域最具有发展前景和后劲的前沿技术，其已成为世界高新技术的新亮点，势将导致一场医学和生物学革命。干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透,干细胞技术也从一种实验室概念逐渐转变成能够看得见的现实。干细胞研究作为一门新兴学科已成为生命科学中的热点。本文对近几年来国内外对干细胞的研究现况作一综述。 【关键词】：干细胞因子帕金森病神经干细胞糖尿病 ABSTRACT：Stem cells are the body and cells of various tissues of origin, has high self replication, high proliferation and multilineage differentiation potential. Stem cell technology is the field of biotechnology has the most development prospect and potential of cutting-edge technology, it has become a new bright spot in the world of high-tech, will lead to a revolution in medicine and biology. The research of stem cell is to modern life science and medical fields intersection, stem cell technology from a laboratory concept gradually transformed to be able to see the reality. Stem cell research as a new discipline has become the hotspot of life science. Based on the domestic and abroad in recent years on stem cell research summarizes. Keywords:Stem cell factor Parkinson disease Neural stem cells Diabetes mellitus 干细胞技术最显著的特征就是能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官。由此人们可以用自身或他人的干细胞和干细胞衍生组织、器官替代病变或衰老的组织、器官，并可以广泛涉及用于治疗传统医学方法难以医治的多种顽症。 干细胞研究是一门新兴的学科,干细胞生物学研究与应用几乎涉及所有的生命科学和生物 医学领域。 一、目前干细胞的主要研究热点
马子洋，男，1995年生， 北京市人，汉族，首都医科大学13级七年制口腔医学专业在读。 通讯作者：郭晓霞，博士，副教授，首都医科大学基础医学实验教学中心，北京市 100069 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2016)19-02872-07 稿件接受：2016-03-20 牙髓干细胞在再生医学中的应用研究与进展 马子洋1，郭晓霞2(1首都医科大学附属北京口腔医院，北京市 100050；2首都医科大学基础医学实验教学中心，北京市 100069) 引用本文：马子洋，郭晓霞. 牙髓干细胞在再生医学中的应用研究与进展[J].中国组织工程研究，2016，20(19):2872-2878. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.19.020 ORCID: 0000-0001-6676-4095(郭晓霞) 文章快速阅读： 文题释义： 牙髓干细胞：来源于牙髓腔内的软组织，可自我更新，有着较强的克隆形成能力，与骨髓间充质干细胞 有极其相似的免疫表型(CD105+/CD73+/CD34-/CD45-)。牙髓干细胞具有多向分化的潜能，在特定条件下能够分化为骨、软骨、神经样细胞、肌细胞等类型。 牙髓干细胞的转化医学研究意义：牙髓干细胞具有来源丰富、采集方便、免疫原性低、无伦理争议等优点，因此，牙髓干细胞在再生医学和组织工程修复中有着广泛的应用前景。牙髓干细胞在骨组织修复领域已进入临床研究阶段，而向其他组织分化的研究尚处于起步阶段或基础研究阶段，其调控机制存在着诸多问题，有着巨大的研究潜力。 摘要 背景：牙髓干细胞是具有良好分化与增殖能力的干细胞，因其取材方便，具有多向分化潜能等特征正逐渐为再生医学研究领域重视。 目的：通过分析整理国内外牙髓干细胞的研究进展，对其目前在再生医学领域的应用研究加以总结，为进一步研究提供线索和方向。 方法：以“dental pulp stem cell, regenerative medicine, tissue engineering ”为英文检索词，以“牙髓干细胞，再生医学，组织工程” 为中文检索词，由第一作者检索Medline ，PubMed ，万方，维普，中国知网数据库2000至2015年牙髓干细胞及再生医学相关文献，经过筛选最终获得46篇文献进行综述。 结果与结论：牙髓干细胞具有自我更新与多向分化潜能，获取方法简便，在再生医学领域拥有巨大发展潜能。牙髓干细胞在骨组织修复领域已进入临床研究阶段，在向其他组织分化方向的研究，尚处于起步阶段或基础研究阶段，有待进一步研究拓展。 关键词： 干细胞；分化；牙髓干细胞；再生医学；分离；储存；成骨分化；成神经分化；血管生成；心肌细胞形成 主题词： 干细胞；牙髓；再生医学；组织工程 牙髓干细胞与组织再生
脐带间充质干细胞的研究进展 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC S ）是来源于发育早期中胚层 的一类多能干细胞[1-5]，MSC S 由于它的自我更新和多项分化潜能，而具有巨大的 治疗价值 ,日益受到关注。MSC S 有以下特点：(1)多向分化潜能，在适当的诱导条件下可分化为肌细胞[2]、成骨细胞[3、4]、脂肪细胞、神经细胞[9]、肝细胞[6]、心肌细胞[10]和表皮细胞[11, 12]；(2)通过分泌可溶性因子和转分化促进创面愈合；(3) 免疫调控功能，骨髓源（bone marrow ）MSC S 表达MHC-I类分子，不表达MHC-II 类分子，不表达CD80、CD86、CD40等协同刺激分子，体外抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受[11, 15]，在预防和治疗移植物抗宿主病、诱导器官移植免疫耐受等领域有较好的应用前景；(4)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程和细胞替代治疗。1974年Friedenstein [16] 首先证明了骨髓中存在MSC S ，以后的研究证明MSC S 不仅存在于骨髓中，也存在 于其他一些组织与器官的间质中：如外周血[17]，脐血[5]，松质骨[1, 18]，脂肪组织[1]，滑膜[18]和脐带。在所有这些来源中，脐血(umbilical cord blood)和脐带(umbilical cord)是MSC S 最理想的来源，因为它们可以通过非侵入性手段容易获 得，并且病毒污染的风险低，还可冷冻保存后行自体移植。然而，脐血MSC的培养成功率不高[19, 23-24]，Shetty 的研究认为只有6%，而脐带MSC的培养成功率可 达100%[25]。另外从脐血中分离MSC S ，就浪费了其中的造血干/祖细胞(hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells,HSCs/HPCs) [26, 27]，因此，脐带MSC S (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC S )就成 为重要来源。 一．概述 人脐带约40 g, 它的长度约60–65 cm, 足月脐带的平均直径约1.5 cm[28, 29]。脐带被覆着鳞状上皮，叫脐带上皮，是单层或复层结构，这层上皮由羊膜延续过来[30, 31]。脐带的内部是两根动脉和一根静脉，血管之间是粘液样的结缔组织，叫做沃顿胶质，充当血管外膜的功能。脐带中无毛细血管和淋巴系统。沃顿胶质的网状系统是糖蛋白微纤维和胶原纤维。沃顿胶质中最多的葡萄糖胺聚糖是透明质酸，它是包绕在成纤维样细胞和胶原纤维周围的并维持脐带形状的水合凝胶，使脐带免受挤压。沃顿胶质的基质细胞是成纤维样细胞[32]，这种中间丝蛋白表达于间充质来源的细胞如成纤维细胞的，而不表达于平滑肌细胞。共表达波形蛋白和索蛋白提示这些细胞本质上肌纤维母细胞。 脐带基质细胞也是一种具有多能干细胞特点的细胞，具有多项分化潜能，其 形态和生物学特点与骨髓源性MSC S 相似[5, 20, 21, 38, 46]，但脐带MSC S 更原始，是介 于成体干细胞和胚胎干细胞之间的一种干细胞，表达Oct-4, Sox-2和Nanog等多
全科口腔医学电子杂志Electronic Journal Of General Stomatology 2019 年5月第6卷/第14期V ol.6, No.14 May. 2019 98 112例显微镜下牙髓血运重建术四手操作护理配合体会 钟莎莎1，金婷婷2* （南京医科大学附属口腔医院（江苏省口腔医院），1.儿童口腔预防科；2.门诊办，江苏南京 210029）【摘要】总结112例年轻恒牙显微镜下牙髓血运重建术四手操作护理配合，四手操作重点包括：四手护士术前准备用物齐全，术中严格执行无菌操作，熟练使用橡皮障，掌握显微镜下四手配合，掌握牙髓血运重建术操作流程，正确平稳传递传递操作器械，精准调拌口腔材料MTA(矿物三氧化物凝聚体)、iRoot BP等与操作医生形成默契，快速准确进行积极有效的护理配合。 【关键词】血运重建术；年轻恒牙；四手操作 【中图分类号】R473.78 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-8803.2019.14.98.02 牙髓血运重建术是近些年来新开展的一项新技术，是指当年轻恒牙发生牙髓根尖周病变时，利用诱导根尖出血，借助MTA、iRoot BP等生物支架来诱导牙根继续发育和组织再生[1]。主要选择牙髓感染或坏死的、根尖孔未闭合的年轻恒牙，可伴随或不伴随根尖周炎症和屡道。X线片上可见明显的根尖周骨质破坏和对牙髓活力测试无反应的牙也可以进行该操作[2-3]。根据有关牙髓血运重建术的临床研究及病例报告，其适应证选择越来越广[4]。现将我科2016- 2018年112例显微镜下牙髓血运重建术四手操作护理配合体会做如下汇报。 1 治疗方法 根据患儿病情、医生诊断行牙髓血运重建术，术前告知患儿家长血运重建术与根尖诱导术区别，利弊，签署术前知情同意书，向家长介绍手术流程，费用，复诊次术，并要求按预约时间准时复诊，术前拍摄X光牙片以及CT，测量根管长度，进行记录。 2 准备工作 2.1 环境准备 术前保持诊室清洁干燥，空气流通，有条件的情况下进行半小时空气消毒，同时保证安全良好的就诊环境[5]。 2.2 物品准备 四手护士根据预约本，以及电子病历，了解本次治疗患儿年龄、既往史，牙位，操作项目、目的，准备好治疗盘、橡皮障、合适的橡皮障夹、弓，并根据牙位打好孔，根据治疗目的准备好高速涡轮机、低速涡轮机、车针、扩大针、冲洗器、冲洗液、生理盐水、局麻药、封药材料，垫底材料，粘接剂，小毛刷、树脂、光固化灯、充填器、无菌棉球、酒精棉球、显微镜、显微口镜。 2.3 家长准备 安抚患儿，要求患儿积极配合并且给予患儿鼓励，术日带好就诊病历，X片、CT片准时复诊。 3 护理配合 协助操作医生上橡皮障，患牙开髓后橡皮障下暴露髓腔，四手护士正确平稳传递1%次氯酸钠冲洗液，20 ml/根，浸泡冲洗10min，缓慢冲洗，不可加压冲洗，后传递生理盐水10ml冲洗5ml，避开患儿颜面部传递，防止误伤。准备好消毒小棉球、纸尖，使用镊子进行传递，干燥根管。若前行牙血运重建术，需传递蘸有自酸蚀剂小毛刷给操作医生涂布于牙本质进行光固化，牙冠变色是牙髓血运重建术后的常见问题，米诺四环素和三氧化矿物聚合体（mineral trioxide ag—gregates，MTA）都会导致牙齿内染色。Reynolds等[6]在使用三联抗菌糊剂前用牙本质粘接剂和复合树脂隔绝米诺环素与牙齿的接触以减少内染色。美国牙髓病学会的操作指南也提示操作者需要关注牙冠变色的问题[7].干燥根管后，四手护士准确取量三联糊剂于调拌纸上，将三联抗生素糊剂（环丙沙星、甲硝唑和米诺四环素按照１∶１∶１的比例混合）用盐水调拌成糊状，并使用螺旋输送器将糊剂导入根管，准备好无菌小棉球、暂封封闭窝洞（氧化锌+GIC），嘱患儿术后2小时内不可进食，预约术后两周复诊。 复诊时，若患牙仍有扣痛，牙龈红肿，扪痛或瘘管，重复上次治疗步骤，症状消失后。症状消失后，进行下一步治疗，四手护士准备好利多卡因，协助操作医生进行局部麻醉，不可使用含有肾上腺素麻药。等待麻药起效后，熟练协助操作医生上橡皮障，橡皮障下再次打开髓腔，四手护士传递17%-21%EDTA溶液冲洗根管，冲洗20 ml/根，浸泡冲洗，后四手护士打开显微镜，传递显微口镜给操作医生，通过口镜显微镜下生理盐水冲洗10 ml/根，四手护士做好及时吸唾，保持操作视野清晰，显微治疗技术中要求护士不但要有专业理论知识和娴熟的专业技术，还要有丰富的临床经验，同时还要与医生形成一种默契[8]。冲洗完毕，四手护士准备好消毒小棉球、纸尖正确传递，干燥根管。准备好28 mm，40号根管扩大针，工作尖向下，传递给操作医生，协助医生轻柔穿刺牙髓及根尖周组织进行引血，出血量达到有牙骨质界下4 mm，出血形成血凝块作为蛋白组织支架是目前牙髓血运重建中的主要方法，四手护士通过显微镜显示屏观察引血效果，及时传递胶质银给操作医生置于根管内同时起支架作用，做好支架，四手护士根据牙位精准取量MTA于调拌纸上，使用无菌注射用水进行MTA调拌，MTA需现用现配，放置易干，水多易稀，护士要掌握调拌技巧，少量多次调拌，防止贵重材料浪费，调拌成粘土状使用锌汀充填器传递给操作医生，放入MTA 覆盖在釉牙骨质界下方1～2 mm处，前牙操作时应选择不 通讯作者：金婷婷
第26卷第3期2012年6月 白城师范学院学报 Journal of Baicheng Normal University Vol．26,No．3June ,2012 干细胞特性及最新研究进展 刘 惠 (白城医学高等专科学校,吉林白城137000 摘要:干细胞是人体的种子细胞,是构成人体各种组织细胞的最初来源,在一定条件 下, 它能分化演变成多种可利用的功能细胞．干细胞是一种具有自我更新,高度繁殖和多向分化潜能的细胞群体．近年来干细胞研究已经渗透到现代生命科学及医学的多个方向,该技术也实现了由实验室向临床应用的转化．干细胞疗法逐渐成为治疗多种疾病的新途径,具有重要的理论研究意义和临床应用价值．本文阐述了干细胞的特性及其在临床上的发展及应用． 关键词:干细胞;干细胞疗法;临床应用 中图分类号:Q813文献标识码:A 文章编号:1673-3118(201203-0032-03收稿日期:2011－12－14 作者简介:刘惠(1970———,女,白城医学高等专科学校讲师,研究方向:组织胚胎学．
干细胞从被发现至今,各国的科学家对其研究 的热情丝毫未减．从早期的干细胞调节机制研究到如何获取这类“全能”细胞,再到近些年对其临床应用的各项探索,相关研究推进了干细胞技术的不断进步,也为医疗应用带来了曙光． 1干细胞的分类 干细胞(stem cells ,SC 是人体的种子细胞,是 构成人体各种组织细胞的最初来源, 是一类具有自我复制能力的多潜能细胞群体,在一定条件下,它 可以分化成多种功能细胞．对于哺乳动物来说,根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embry-onic stem cell ,ES 细胞和成体干细胞(somatic stem cell ．1．1 胚胎干细胞 胚胎干细胞(embryonic stem cell ,ES 细胞,亦作胚性干细胞,取自囊胚里的内细胞团,是从胚泡(早期胚胎阶段未分化的内部细胞团中得到的干细胞．它们是万能的,可以发育成为身体内200多种细胞类型中的任何一种． 开发和利用ES 细胞是目前生物工程领域主要研究的核心问题之一,并在诸多方面取得了良好的成绩．例如:德国和美国某医学研究小组, 在2010年成功的向试验小鼠体内移植了神经胶质 细胞,该细胞是由小鼠的胚胎干细胞培养的．此实验之后,密苏里的研究者通过实验小鼠的胚细胞移植技术,成功恢复了一只瘫痪的猫的部分肢体活动能力．随着胚胎干细胞的研究进展的日益深入,生命科学领域的研究人员对人体胚胎干细胞的了解与应用进入到一个崭新的水平．1998年,人类的胚胎干细胞就已经成功的培养
摘要：多细胞有机体是由各种不同类型的细胞组成的，而这些细胞通常是一个受精卵细胞经增殖分裂和细胞分化衍生而来的后裔。细胞分化是多细胞生物发育的基础和核心。细胞分化的关键在于特异性蛋白质的合成，合成特异性蛋白质实质在于组织特异性基因在时间和空间上的差异性表达，而差异性表达的机制由于基因表达的组合调控。在个体正常发育过程中，通过有控制的细胞分裂而增加细胞数目，通过有序的细胞分化而增加细胞类型，进而由不同类型的细胞构成生物体的组织与器官，执行不同的功能，显然，细胞分化为生命向更高层次的发展与进化奠定了基础。细胞分化对于生物体的发展进化如此的重要，因此对它的研究发展也是如此的重要，国内外对细胞分化的研究进展也是极其迅速。 关键词：细胞分化、特点、影响因素、实例、研究进展、干细胞、干细胞学术会议 一、细胞分化的基本概念 细胞分化（cell differentiation）就是在个体发育中，由一种相同的细胞类型经过细胞分裂后逐渐在形态上、结构上和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程称为细胞分化。现代分子生物学的研究证明，细胞分化是由于细胞选择性的表达各自特有的专一性蛋白质，从而导致细胞在形态、结构和功能上的差异。比如说鸡的输卵管细胞合成卵清蛋白，成体红细胞合成β—珠蛋白，胰岛细胞合成胰岛素，这些细胞都是在个体发育中逐渐产生的，而且细胞分化是通过严格而精密调控的基因表达实现的。但是细胞分化并不是多细胞有机体所独有的特征，单细胞甚至原核生物也存在细胞分化的问题，比如枯草芽孢杆菌芽孢的形成，啤酒酵母单倍体包子的形成及萌芽形成的α和a两种交配型。虽然如此，但是与多细胞有机体细胞分化也有着不同之处，单细胞生物细胞分化多是为了适应不同的生活环境，然而多细胞有机体通过细胞分化构建执行不同功能的组织和器官，因此，多细胞有机体在其分化程序与调节机制方面显得更为复杂。 二、细胞分化的特点 细胞分化是同一来源的细胞逐渐发生各自特有的形态结构、生理功能和生化特征的过程。其结果是在空间上细胞之间出现差异，在时间上同一细胞和它以前的状态有所不同。细胞分化是从化学分化到形态、功能分化的过程。从分子水平看，细胞分化意味着各种细胞内合成了不同的专一蛋白质（如水晶体细胞合成晶体蛋白，红细胞合成血红蛋白，肌细胞合成肌动蛋白和肌球蛋白等），而专一蛋白质的合成是通过细胞内一定基因在一定的时期的选择性表达实现的。 细胞分化可以概括为以下3个特征： ①持久性:细胞分化贯穿于生物体整个生命进程中,在胚胎时期达到最大程度。胚胎细胞在显示特有的形态结构、生理功能和生化特征之前，需要经历一个称作决定的阶段。在这一阶段中，细胞虽然还没有显示出特定的形态特征，但是内部已经发生了向这一方向分化的特定变化。细胞在整个生命进程中,在胚胎期分化达到最大限度。 ②稳定性和不可逆性:一般来说,分化了的细胞将一直保持分化后的状态,直到死亡。正常情况下，细胞分化是稳定、不可逆的。一旦细胞受到某种刺激发生变化，开始向某一方向分化后，即使引起变化的刺激不再存在，分化仍能进行，并可通过细胞分裂不断继续下去。 ③普遍性:生物界普遍存在,是生物个体发育的基础。
牙髓血运重建术 适应症 是牙髓感染或坏死的根尖孔未闭合的年轻恒牙，可伴随或不伴随根尖周炎症和瘘道。 操作步骤 橡皮障局麻下暴露髓腔，建立通畅的根管通路，去除坏死牙髓。使用大量的NaOCl 溶液、氯已定溶液和（或EDTA液）、无菌生理盐水（20ml以上）彻底冲洗根管后，在根管内将抗生素糊剂轻轻盖在残存牙髓上2周。 复诊时打开根管，若无脓性渗出或仅有少量出血时，取出糊剂，充分冲洗根管，再用无菌生理盐水漂洗，使用光滑髓针或扩大针轻柔刺穿牙髓及根尖周组织引起根管内出血，用蘸有无菌生理盐水的小棉球使出血止于釉质牙骨质界下2～3 mm，并在根管内形成血凝块（可以放置明胶海绵）；将MTA 覆盖其上以封闭根管口，使用玻璃离子黏固剂垫底，光固化复合树脂修复牙体。 定期随访术后每3-6个月复查，随访18-24个月。 临床检查项目：患者主诉疼痛情况。叩诊、松动度、粘膜肿胀及有无窦道、脓肿形成、牙髓温度测试。 影像学评估：根据X线片评价根尖周组织愈合情况，根尖周病变是否缩小或者消失；观察牙根是否继续延长，根管腔是否缩窄，以及根尖孔闭合情况。 抗生素糊剂 将甲硝唑、米诺环素（可能会导致牙体内染色）和环丙沙星等比例混合制成的三联抗生素糊剂导入根管并轻轻覆盖在残存的牙髓上，可以达到彻底的根管消毒。 操作注意事项 在操作中要尽可能少或者不探测根管，以保存牙髓干细胞和牙乳头中间充质干细胞的活力。不建议进行传统的机械预备，而是采用更加温和的根管冲洗以及根管内放置抗菌药物的方式进行根管消毒。 如果在几次根管内冲洗和封药后，临床症状没有好转的迹象，瘘道始终存在，或出现肿胀和疼痛等情况时，应该考虑进行根尖诱导成形术。
干细胞研究进展消息 干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源, 具有高度自我复制、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透, 干细胞技术也从一种实验室概念逐渐转变成能够看得见的现实。干细胞研究已成为生命科学中的热点。介于此, 本刊将就干细胞的最新研究进展情况设立专栏, 为广大读者提供了解干细胞研究的平台。 干细胞专题近期国外干细胞研究进展 Geron抗癌药GRN163L选择性瞄准癌症干细胞据美国BussinessWire 1月10日报道称, 杰隆(Ge-ron)发表临床前研究数据显示, 其端粒酶抑制剂药物imetelstat (GRN163L)在小儿科神经肿瘤当中可选择性瞄准癌症干细胞, 这一发现为儿童肿瘤的临床试验提供了支持。该研究发表于2011年1月1日的Clinical Cancer Research杂志上。近年来有关端粒酶抑制的研究日益增多, 成为癌症治疗的一个热点方向, GRN163L是此类药物开发中最前沿的一个候选药物。2002年3月, Geron从Lynx Therapcutics获得了用GRN163和GRN163L两种化合物的核心专利。早期研究显示, GRN163对十四种不同癌症细胞均表现出有意义的端粒酶活性抑制作用, 它可以抑制黑色素瘤等细胞的生长。因脂质修饰物GRN163L更易进入细胞发挥端粒酶抑制作用, 后续临床前及临床试验均为GRN163L。2005年, FDA同意GRN163L在患慢性淋巴细胞白血病患者的临床实验。2007年, Geron公司开始GRN163L单独治疗多发性骨髓瘤的I期临床试验。2008年开始了GRN163L治疗乳腺癌的I期临床试验。同年12月, Geron发布了有关GRN163L治疗再发的和难治的多发性骨髓瘤的暂时性临床试验数据。2009年, Geron发布了Geron163L对抗癌症干细胞的实验活动, 包括非小型细胞肺癌、乳癌、胰脏炎、前列腺癌、小儿科神经肿瘤。公司发表Geron163L治疗乳癌的假定癌症干细胞与胰脏炎症系数据。数据显示, 在以Geron163L治疗后, 人类乳癌细胞MCF7的假定干细 胞数量与自我再生的能力大幅减弱。目前Geron163L正处于临床II期试验中。(来源: 生物谷2011-01-11)Cell Stem Cell: iPS细胞具更高基因畸变频率加州大学圣地亚哥分校医学院及斯克里普斯研究所的干细胞科学家领导的跨国研究团队, 记录了在人类胚胎干细胞(hESC)和诱导功能干细胞(iPSC)系中特殊的基因畸变, 研究结果在1月7日的Cell Stem Cell上发表。该公布的发现强调了需要对多能干细胞进行频繁的基因检测以保证其稳定性和临床安全性。该研究的第一作者, 加州大学圣地亚哥分校再生医学系的路易斯·劳伦特博士认为, 人类多能干细胞(hESC和iPSC)比其他类型细胞有更高的基因畸变频率。最令人吃惊的是, 与其他非多能干细胞样本相比较, 观察到hESC的基因扩增和iPSC的缺失方面出现的频率更高。人类多能干细胞在人体内具有发展成其他类型细胞的能力, 可成为细胞替换治疗的潜在来源。斯克里普斯研究员再生医学中心主任珍妮·罗伦教授谈到, 由于基因畸变常常与癌症相关联, 免受癌症相关的基因突变对于临床使用的细胞系来说至关重要。研究团队确认了在多能干细胞系中可能发生突变的基因区域。对于hESC而言, 可观察到的畸变大多是靠近多潜能相关基因区域的基因扩增; 对于iPSC而言, 扩增主要涉及细胞增殖基因及与肿瘤 抑制基因相关的缺失。传统的显微技术, 如染色体组型分析可能无法检测到这些变化。研究组使用一种高分辨率的分子技术, 称为“单核苷酸多态性(SNP)”, 能观察到人类基因组里一百多万个位点里的基因变化。 劳伦特说, 我们惊喜地发现在较短时间培养中的基因变化, 例如在体细胞重编程为多能干细胞的343过程以及在培养中细胞的分化过程。我们不知道这会有怎样的影响, 如果有的话, 这些基因畸变都会对基础研究或者临床应用的结果产生影响, 对此应当深究。劳伦特总结到, 该研究结果解释了有必要对多能干细胞培养进行经常性的基因监控, SNP分析仍不失为人类胚胎干细胞和多能干细胞日常监控的一部分, 但是这一结果提醒我们应当予以重视。(来源: 中国干细胞网2011-01-12)美用胚胎干细胞制造出血小板美国先进细胞技术公司的实验证明, 使用人类胚胎干细胞研制出的血小板可修复实验鼠的受损组织, 人类未来有望源源不断地
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 细胞分化及干细胞的研究进展 细胞分化及干细胞的研究进展摘要： 分化为多种类型的细胞, 但干细胞的增殖、分化行为高度依赖于其所处的生长小生态环境。 以及对脂肪干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞。 在特定的条件下, 干细胞可以增殖并细胞的分化过程, 脂肪细胞分化的调节及其机理进行了综述, 以期对脂肪细胞分化及其调控进行全面总结[1]。 体细胞胚胎发生是体细胞在人工无菌培养条件下分化产生体细胞胚胎的过程, 体细胞胚胎发生途径是细胞全能性表达的一种方式, 重演了合子胚形态发生的过程。 关键词： 肿瘤干细胞;干细胞; 脂肪细胞; 分化; 调控细胞的分化是一个非常复杂的过程，也是当今生物学研究的热点之一[2]。 近来研究提出的肿瘤学新概念肿瘤干细胞成为当前肿瘤研究的热点。 肿瘤干细胞具有自我更新能力和[3]。 由一个受精卵发育而成的生物体的的各种细分化潜能, 是肿瘤生长、增殖和转移的根源胞在形态，结构和功能上会有明显的差异和细胞的分化有关。 1 / 10
细胞的分化是指分裂后的细胞，在形态，结构和功能上向着不同方向变化的过程。 那些形态的相似，结构相同，具有一定功能的细胞群叫做组织。 正常情况下，细胞分化是稳定、不可逆的[2]。 胚胎细胞在显示特有的形态结构、生理功能和生化特征之前，需要经历一个称作决定的阶段。 在这一阶段中，细胞虽然还没有显示出特定的形态特征，但是内部已经发生了向这一方向分化的特[1]。 例如，在两栖类，把神经胚早期的体节从正常部位移植到同一胚胎的腹部还可定变化改变分化的方向，不形成肌肉而形成肾管及红细胞等。 但是到神经胚晚期移植体节，就不[3]。 目前已经证明脂肪细胞分化与糖及脂肪代谢、与机体能量平衡、能改变体节分化的方向与肥胖症、糖尿病、与脂肪肝和高脂血症及乳腺癌等有非常密切的关系。 在动物科学领域,研究动物脂肪细胞的分化与增殖机理, 可达到对脂肪沉积的调控[5]。 1 干细胞及细胞分化理论 1. 1 肿瘤干细胞学说及其发展1855 年科学家通过对肿瘤及胚胎的相似的组织学特点提出了肿瘤源自胚胎细胞的假说, 随后他人认为肿瘤源自残留的胚胎组织。 并提出肿瘤代表着干细胞的成熟停滞, 这些研究都局限于肿瘤细胞的体外扩增能力。
牙髓血运重建术用于根尖孔宽大的年轻恒牙1例 ［关键词］ 血运重建；根管显微镜；年轻恒牙 牙髓血运重建术( dental pulp revascularization )是在根管显微镜的引导下，结合三氧化物聚合体( mineral trioxide aggregate ，MTA ) 的冠部严密封闭作用，作为针对根尖孔宽大的年轻恒牙牙髓病变或根尖周炎症，在控制炎症的同时，诱导患牙牙根再发育的一种新的治疗方法，可达到患牙保存的目的。本文报告根管显微镜辅助治疗下，根尖孔宽大的年轻恒牙的血运重建术1例。 1.病例报告 患者男，9岁，2018年3月因右下后牙疼痛3日来我院就诊。现病史：患儿约3日前右下后牙自发性疼痛，自行口服消炎药疼痛未缓解，外院治疗史不详，今日来我院就诊。既往史：否认系统性疾病史、传染病史及药物过敏史。检查：45畸形中央尖折断，可探及露髓孔，探（-），叩(++)，冷诊无反应，无明显松动，牙龈、粘膜无异常。X 线片示：45牙根短小，根管粗大，根尖部呈“喇叭口”形，根尖周无明显异常，见图1a 。诊断：45死髓牙伴牙根发育不全。治疗计划：45牙髓血运重建术+树脂修复。治疗：45橡皮障隔湿，常规开髓、揭髓顶，根管显微镜下观察牙髓坏死的范围，清除感染坏死的牙髓（图1b ），尽可能保留残存的生活牙髓及根尖牙乳头。3%次氯酸钠溶液和0.7%生理盐水冲洗根管，化学预备后，消毒纸尖干燥根管，螺旋输送器根管内导入三联抗菌糊剂（由甲硝唑、环丙沙星、头孢克洛按1:1:1的比例蒸馏水调配而成），见图1c ，玻璃离子严密封闭冠方。嘱2周后无不适复诊。 术后2周复诊，患儿自诉患牙无不适，检查：45暂封完好，叩（-）。4%阿替卡因（不含肾上腺素）45局部浸润麻醉，橡皮障隔湿，去除暂封物，见根管内无炎性渗出。再次使用3%次氯酸钠溶液和0.7%生理盐水轻柔冲洗根管内三联抗生素糊剂，用显微根管锉在根管微管显镜下去净封药，0.7%生理盐水进一步冲洗，干燥根管，用10号无菌扩大针在根管显微镜引导下刺破根尖部健康牙髓及根尖周组织，至根管内血液充盈达釉牙骨质界下约2mm ，静置15min 后形成血凝块，表面覆盖小块无菌胶原膜，约3mm 厚的MTA 严密封闭根管冠部，见图2a ，微湿生理盐水棉球覆盖，暂封，嘱1周后复诊。 术后1周复诊，45无不适。去除45暂封及棉球， 探查MTA 确保凝固后， 图1b 清除坏死牙髓 图1a 术前X 线片 图1c 根管内导入三联抗生素