牙髓培养细胞体外诱导矿化能力：冠髓与根髓的比较(一)
【摘要】目的比较人牙髓的根、冠髓培养细胞体外诱导矿化能力，探讨牙髓干细胞在牙髓中的定位。方法用组织块法对人牙的根髓和冠髓细胞进行原代和传代培养，将第五代培养细胞用条件培养液（20％DMEM＋10nmol/L地塞米松＋10mmol/Lβ-甘油酸钠＋50mg/LL-抗坏血酸）诱导矿化，在诱导后第10、20、30天对细胞进行VonKossa钙染色。结果根髓中形成的矿化小结比冠髓中更早、更强烈。结论根髓比冠髓更容易诱导矿化。牙髓干细胞可能存在于根髓和冠髓之中，在根髓中比冠髓中具有更高的密度。【关键词】牙髓干细胞；细胞培养；矿化结节
Theinducedmineralizationabilityincultureddentalpulpcells:thecomparationbetweencoronalandro otpulpcells
【Abstract】ObjectiveTocomparethemineralizationabilitybetweencultureddentalrootandcoronalpulpcells,andt oinvestigatethelocalizationofdentalpulpstemcells(DPSCs)indentalpulps.MethodsThehumandental rootandcoronalpulpcellswereculturedintissue-explantmethod,the5thgenerationofcellsweresubcul turedwithconditioningmedium(20%DMEM+10nmol/L+dexamethasone+50mg/Lascorbicacid)toin ducemineralization.Atthedaysof10,20,30afterinducing,vonKossaforcalciumstainingwasusedtoinve stigatethemineralizationabilityinrootandcoronalpulpcells.ResultsThemineralizationnodulesappear edearlierandstrongerintherootpulpcellsthanthatinthecoronalpulpcellsobservedinphase-contrastm icroscopeandvonKossastaining.ConclusionRootdentalpulpcellscouldbeinducedtomineralizationmo reeasilythanthecoronalpulpcells.DPSCsmayexistinbothrootandcoronalpulp,anditsdensityintheroot pulpishigherthanthatincoronalpulp.
【Keywords】dentalpulpstemcells；cellculture；mineralizationnodules
牙髓干细胞（dentalpulpstemcells，DPSCs）在成体牙髓腔中的定位问题是牙体组织工程学中尚未解决的基本问题。研究表明，体外培养的DPSCs和骨髓干细胞一样，都具有在一定条件下诱导矿化形成矿化小结的能力，矿化小结的形成是DPSCs分化的标记。本文通过对体外培养的人牙髓髓细胞诱导矿化，并对其矿化能力进行比较，以探讨DPSCs在牙髓中的定位。
1材料与方法
1.1主要实验器材及试剂CO2培养箱（Nuaire,America）；超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；相差显微镜（Olympus,Japan）；细胞培养瓶及培养板（Costar,America）；高速离心机（上海医用设备厂）；细胞记数板；高糖DMEM培养基（Gibco,USA）；胎牛血清（Hyclone公司）；地塞米松（Sigma,USA）；L-抗坏血酸（Amesco,USA）；β-甘油磷酸钠（E.Merck,Darmstadt）。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养收集5颗16～25岁健康人因正畸或阻生而拔出的第三磨牙，在无菌条件下分别取其根髓和冠髓，用组织块法进行细胞原代和传代培养〔1〕，培养液为DMEM。
1.2.2细胞染色分别将生长状态良好的冠髓和根髓细胞接种于有盖玻片的6孔板上，当细胞汇合约60%～70%时，改用条件培养液（加入10nmol/L地塞米松＋10mmol/Lβ-甘油酸钠＋50mg/LL-维生素C），连续培养30天。在倒置相差显微镜下观察矿化结节形成情况。分别于10、20、30天时，取出盖玻片，按VonKossa法进行染色。染色方法如下：（1）取出长有细胞的盖片，PBS冲洗3遍，FAA固定液（80%乙醇9ml，冰醋酸0.5ml，中性福尔马林0.5ml）中固定30min。（2）蒸馏水冲洗3次。（3）固定后的细胞加入5%的硝酸银溶液，良好日光下染色1h，蒸馏水冲洗，5%的硫代硫酸钠作用1～2min，再用蒸馏水洗5min，干后封片，或伊红复染，常规脱水后封片。
结果判断：矿化结节被染成深黑色。
1.3对照设计体外培养的牙周韧带细胞具有较强的钙化能力，用作VonKossa钙染色的阳性对照片。
2结果
2.1相差显微镜下观察在矿化培养2天时，根髓细胞出现融合现象，细胞间隔消失，冠髓细胞无明显变化；矿化培养10天时，根髓细胞呈局灶性复层生长，呈网状或束状排列；15天时，根髓复层中央部分细胞进一步密集，形成细胞结节，冠髓细胞开始出现复层生长；矿化培养20天时，根髓细胞结节中央出现黑色高密度物质沉积，并且随着时间延长增多，冠髓细胞结节中央开始出现少量褐色沉积物；矿化30天时，根髓出现明显的黑色矿化结节，冠髓中有小而少的矿化结节出现。
2.2VonKossa法钙盐染色
2.2.1根髓细胞于诱导培养20天时，在细胞结节中央出现被染成黑褐色的小块，表明钙质沉积。诱导培养30天时，黑色小块进一步增大(见图1略)。
2.2.2冠髓细胞20天时，尚无染色阳性矿化结节形成。30天时，少数区域出现矿化结节，体积较小且强度微弱(见图2略)。
2.2.3阳性对照片相同染色条件下体外培养的牙周韧带细胞出现黑色团块（见图3）。（本文图片见封三略）
3讨论
本实验发现体外持续培养的牙髓细胞在诱导剂作用下经历了融合期、复层生长期、细胞结节形成期而最后发生矿化，这与Tsukamoto等〔2〕的观察相一致。研究发现，体外培养的牙髓细胞能复层生长，在一定条件下能分泌形成类牙本质样的矿化结节〔3〕。结节中细胞是处在分化中的成牙本质细胞前期,体外培养单层生长的细胞不具有形成矿化基质的能力而牙髓细胞复层生长可以形成细胞结节，细胞结节所具有的三维结构是形成钙化的先决条件〔4〕。
牙髓干细胞 1牙髓干细胞概念 牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年Gronthos[1]等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)。现在普遍认为牙髓组织中具有形成细胞克隆能力和较强增殖能力的未分化间充质细胞即DPSCs[2]。 2牙源性干细胞 至今，已从人类牙齿相关组织中分离和鉴定出7种干细胞: (1)牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)[1]，来自恒牙牙髓；张巍巍等[3]以人牙髓干细胞为种子细胞与PLGA支架材料在体外进行复合培养，表明PLGA 有利于于牙髓干细胞的粘附与增值。Lindroos等[4]得到DPSC与其他间充质源性干细胞具有相似的表面标志物和骨相关性的标志物的结论，支持DPSC在硬组织再生方面的可能性。从成人第三磨牙牙髓中分离的DPSC在适宜的条件下可诱导分化为有功能活性的神经细胞，并在基因和蛋白水平表达神经组织专有的标志物[5]，为治疗神经系统方面的疾病提供了新的途径。DPSCs不表达成牙本质细胞特征性蛋白DSP、DMP，则表明DP-SCs尚处于未分化状态[6]。我国学者通过对根髓和冠髓进行比较时发现：DPSCs 存在于全部牙髓之中,在根髓中的密度更高[7]。 (2)人类脱落乳牙牙髓干细胞(stem cell from the pulp of human exfoliated deciduous teeth, SHED),来自儿童脱落乳牙的牙髓;Miura等[8]研究发现，正常脱落的乳牙牙髓中的细胞经培养会表现出成纤维细胞样生长，其增殖率和群体倍增数均比骨髓基质干细胞(BMMSC)、DPSCs高，于是首次提出了SHED的概念。Shen YY等[9]发现SHED在体外培养过程中可以表达成骨细胞的标志，如RUNX-2、OCN、BSP，表明SHED在体外可以分化为成骨细胞;将SHED与人类牙齿切片复合后，在体外培养或是植入免疫缺陷小鼠皮下，均表达成牙本质细胞分化的标志( DSPP，DMP-1，MEPE)[10]。一系列实验表明SHED在体内只能诱导宿主细胞分化为成骨细胞[11]，而其自身无法分化为成骨细胞，但在体外培养过程中却可以分化为成骨细胞。SHED 可能还具有参与机体的免疫调节等功能[12]。李丽文[13]等用不同密度接种培养DPSCs,计算细胞产量、倍增次数, 观察细胞形态、检查克隆形成率和钙结节形成能力的方法得到，1.5～3cells/cm2低密度接种培养DPSCs 有利于细胞快速扩增,扩增后的细胞保持较高的增殖和分化潜能。SHED 的增殖能力、克隆形成效率和钙结节形成能力均优于DPSCs。 (3)根尖乳头干细胞(stem cell from the apical papilla,SCAP)[14,15]，来自牙根发育未完成的根尖乳头；Abe等[16]从人年轻第三磨牙根末端分离根尖周牙乳头，并采用酶消化法从中分离出细胞进行研究，结果发现这种细胞在低密度下培养时，
牙髓炎： ⒈急性牙髓炎： 症状：①自发性阵发性痛（化脓时有搏动性跳痛）；②夜间痛；③温度刺激加剧疼痛（牙髓化脓或坏死时表现为热痛冷缓解）；④疼痛不能定位。 检查：①患牙可查及近髓腔的深龋或其他硬组织疾病，牙冠有充填体或深牙周袋；②探诊引起剧痛，可探及微小穿髓孔，可见少许脓血自穿髓孔流出；③温度刺激敏感；④早期叩痛不明显，晚期垂直轻度叩痛。鉴别诊断：①三叉神经痛；②龈乳头炎；③急性上颌窦炎。 应急处理：①开髓引流；②消炎止痛；③针刺镇痛。 ⒉慢性牙髓炎： 病和较长，有长期冷热刺激痛史，咬合不适，轻叩痛，可定位患牙。 慢性闭锁型牙髓炎：①无自发痛，有长期的冷热刺激痛史；②可查及深龋洞，冠部充填体或其他牙硬组织疾患；③洞内探诊迟钝，去腐后无肉眼可见的露髓孔；④温度测验反应迟钝或迟缓；⑤多有轻度叩痛（+）或叩诊不适（±）。 慢性溃疡型牙髓炎：①无自发痛，当食物嵌入洞内出现剧烈疼痛；②冷热刺激剧痛；③查及深龋洞或近髓牙体损害，患牙长期废用，或见大量软垢、牙石堆积，洞内食物嵌塞；④去腐有穿髓孔，浅探不痛，深探剧痛或有暗红色血渗出；⑤温度测验敏感；⑥没有叩痛或轻微不适。 慢性增生性牙髓炎：①无自发痛，有进食痛或进食出血现象，长期不敢用患侧咀嚼食物；②患牙深龋洞中有红色肉芽组织━牙髓息肉，探之无痛易出血，患牙长期废用。 慢性牙髓炎诊断要点：①可定位患牙，有长期冷热刺激痛病史或自发痛史；②患牙有牙体硬组织疾病；③患牙对温度测验异常；④叩诊反应作为重要指标。 慢性牙髓炎鉴别诊断：①深龋；②可复性牙髓炎；③干槽症。 牙龈息肉和牙周膜息肉的鉴别： 牙龈息肉：是患牙邻牙合面出现龋洞时，由于食物长期嵌塞和患牙缺损处粗糙边缘的刺激，牙龈乳头向龋洞增生所形成的息肉样物体。 牙周膜息肉：多根牙的龋损发展过程中，骨腔穿通，髓室底遭到破坏，外界刺激使根分叉处的牙周膜反应性增生，息肉状肉芽组织穿过髓底穿孔进入髓室，外观极像牙髓息肉。 ⒊牙髓坏死： 症状：①无自觉症状；②牙冠变色；③有自发痛史、外伤史、正畸治疗史或充填修复史； 检查：①牙冠可存有深龋洞或其他牙体硬组织疾患或有充填体深牙周袋，也可见完整牙冠者；②牙冠呈暗黄色或灰色，失去光泽；③牙髓无反应；④叩（-）或不适感（±）；⑤无窦道；⑥X线无明显异常。 牙髓坏死的鉴别诊断：慢性根尖周炎。 急慢性根尖周炎： ⒈急性化脓性根尖周炎： ⑴根尖脓肿： 症状：自发性剧烈、持续的跳痛，伸长感加重，咬合痛。 检查：①叩痛(++)～(+++)松动Ⅱ°～Ⅲ°；②根尖部牙龈潮红，无明显肿胀，扪诊轻微疼痛；③相应的颌下淋巴结或颏下淋巴结可有肿大及压痛。 ⑵骨膜下脓肿（又叫牙槽骨骨膜炎或颌骨骨膜炎） 症状：患牙的持续性搏动性跳痛更加剧烈，疼痛达最高峰，患者极度痛苦，疼痛难忍，影响睡眠和进食，可有体温升高，乏力等症状。 检查：①患者面容痛苦，精神疲惫，体温升高38°左右，淋巴结肿大扪痛；②叩痛（+++），松动Ⅲ°，牙龈红肿，移行沟变平，有明显压痛，扪诊深部有波动感；③严重的可使相应面部出现蜂窝组织炎，表现为软组织肿胀，压痛，致使面容改变。 ⑶粘膜下脓肿：
实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品
DC在机体免疫监视机制中起着哨兵作用，它能对肿瘤抗原进行识别、处理和提呈，从而启动机体对肿瘤的特异性免疫应答。目前制备的以DC为基础的肿瘤疫苗就是利用DC这一特性，因此有效地在体外扩增培养DC是制备DC肿瘤疫苗的重要前提。以下我们将就DC前体细胞选择以及DC培养所需细胞因子进行介绍。 一、DC前体细胞的选择 1.直接分离骨髓、脐带血或外周血中DC： DC在组织中含量甚微，在血液中仅占单个核细胞总数的0.5％～1.0％，难以分离、纯化，且呈高度分化状，体外不易长期培养，更难建系。因此该分离方法目前仅用于DC免疫活性，表面标志及DC亚型功能差异的研究； 2.从人骨髓或脐带血的CD34+造血干细胞诱导DC： 我们通常所指的DC均为髓系DC，其来源于人CD34+造血干细胞。CD34+造血干细胞是具有多向分化潜能和大量增生能力的细胞，其可从人骨髓或脐带血中分离，在体外通过联合GM—CSF、SCF、IL—6、IL—3等多种细胞因子培养，诱导扩增生成大量的DC，但其缺点在于取材不方便，不利于广泛使用； 3.分离外周血中CDl4+单核细胞： 此方法为目前最常选用的分离获取DC前体细胞的途径。通过淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，利用免疫磁珠分选出CDl4+单核细胞，采用GM—CSF与IL—4(或IL—13，其与IL—4具有相似性质)联合培养体系，经7～10天即可诱导出大量的典型的DC； 4.由高度纯化的中性粒细胞前体细胞诱导DC： 利用高度纯化乳铁蛋白阳性的中性粒细胞前体细胞，在培养体系中加入6MCSF，IL—4和TNF—d，可得到DC样形态及具有DC相关表面分子的细胞。从功能上比较，这些中性
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
对牙髓炎的保髓治疗一直是牙髓病学领域所研究的重点，其基础研究(动物实验)目前已取得较好进展，但由于人具有主观反映的特异性，如对疼痛感觉，尤其是隐痛的反映，是动物所无法表达的，而牙髓炎对人类最直接、最强烈的反应是疼痛，或由于疼痛而引起的焦虑现象。因此，动物实验的研究结果并不能完全适用于临床。作者在临床工作中发现，许多患急性牙髓炎的患者，在经过开髓引流后即可消除自发痛，如果给予适当地盖髓充填，可以达到治疗的目的。 为了科学地了解适合牙髓保存治疗的适应证和最佳治疗方法，并探讨炎症牙髓保存的可能性，作者进行了急性牙髓炎保髓治疗的临床应用，取得了较好的结果。关于它的动物实验正在进行中。 1 临床资料和方法 1.1 临床资料选择门诊患慢性牙髓炎急性发作、急性牙髓炎(史俊南分类法［2］)的患者30例为实验组作保髓治疗，其中男6例，女24例，年龄10～55岁。发病时间(急性发作或加重)0.5～30d。另选20例作常规直接盖髓术，即作点状开髓后直接盖髓充填，作为对照组。 1.2 方法 1.2.1 药物配制安抚药粉(简称Ⅰ号粉)，其主要成分按重量比为头孢唑啉钠99%、地塞米松1%。盖髓剂(简称Ⅱ号糊剂)，其主要成分的重量比为头孢唑啉钠33%、氢氧化钙 66%、地塞米松10g/L，加1%丁卡因液适量调成糊状。药物配制是依据其药理性质及有关报道［2］筛选配制而成，但上述配制是否为最佳配制将另题研究。 1.2.2 设计治疗方法在局麻下作一约1mm大穿髓点(或扩大穿髓点)，以利于髓腔引流、缓解疼痛，用蘸10g/L丁卡因之棉球放置于髓腔并开放1周。患者无自发痛后于穿髓点放置沾有Ⅰ号粉的干棉球，用丁香油水门汀暂封。1周后若患者无自发痛，则去除原干棉球，于穿髓点处放置Ⅱ号糊剂，用丁香油水门汀暂补。1月后若患者无自发痛及其它不适，进行永久性充填，随诊3～6月。 1.3 疗效评价 1.3.1 主观评价随诊3～6月后观察疗效，评判标准为，好：无自发痛或刺激痛。良：无自发痛但有可忍受之刺激痛。差：无自发痛，有明显的刺激痛。失败：有自发痛。以好、良为有效。 1.3.2 客观评价牙髓电活力测验，仪器为丹麦产牙多功能测试仪(Odontometer instruction)，厂家建议正常值为3～12。本组结果仅在治疗后观察3～6月的疗效，远期疗效尚在继续观察之中。 2 结果(表1，2) 表1 实验组牙别与疗效的关系(个) 牙数好良差失败有效率(%)
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
成体人牙髓干细胞的分离与鉴定 杨雪超樊明文 武汉大学口腔医学院(430079) email:yangxuecao@https://www.doczj.com/doc/d713215339.html, 摘要：目地从成人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，研究其生物学性状。方法选取年青患者因正畸拔除的完好牙齿，取出牙髓，采用酶消化及过滤的方法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性,矿化结节形成，牙本质唾蛋白表达，Hoechst33342染色，Oil Red-O 染色，PPARr2基因表达等方面进行检测。结果在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP 活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达牙本质唾蛋白，已向成牙本质细胞方向发生了分化。Hoechst33342染色大部分细胞为阴性。成脂肪诱导后，Oil Red-O染色阳性，检测到PPARr2基因表达。结论从成体人牙髓组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，能够进行分化，为进一步的深入研究奠定了基础。 关键词：成体人牙髓干细胞牙本质唾蛋白成牙本质细胞 1．引言 目前普遍认为，干细胞是具有无限或很强自我更新能力细胞，能分化产生至少一种高度分化的后代细胞。干细胞应具有两个基本性质：（1）自我更新能力，能通过分裂维持自身群体的稳定；（2）分化能力，在一定条件下能分化产生具有特定功能的细胞[1]。干细胞又分为胚胎干细胞和成体干细胞两类，后者是目前研究的新热点。研究表明，皮肤[2]，乳腺[3]，肌肉[4]，甚至神经组织[5]等成熟组织器官中都存在成体干细胞（adult stem cell）。最近，国外学者证实成人牙髓组织中也存在干细胞[6]，国内关于此领域的研究尚刚刚起步，本文是系列研究的第一步，旨在探寻一条分离牙髓干细胞的可靠途径，为更深入的研究奠定基础2．材料和方法 2.1 材料 α-MEM培养基，特极胎牛血清（Hyclone, USA）; collagenase type Ⅰ,dispase(Sigma,USA);ALP检测试剂盒（南京建成）；β-甘油磷酸钠（进口分装）；兔抗人DSP抗体（NIDCR LW.Fisher 博士惠赠）；FITC标记二抗（武汉博士德）；Oil Red-O，IBMX, Hoechst33324(Sigma,USA)；One-Step RT-PCR试剂盒（Promage） 2.2 方法 2.2.1细胞培养和克隆 采用临床19-29岁因正畸或阻生需要拔除的健康第三磨牙，依照文献方法无菌条件下取出完整牙髓[7]。将牙髓剪碎，加入50倍体积的0.2% collagenase typeⅠ及0.2% dispase（体积比1︰1），37℃水浴摇床消化1小时，1000rpm/min离心10分钟，去上清。培养液（含20%胎牛血清）重悬沉淀，用100μm钢网过滤重悬液，获得单细胞悬液。细胞计数板计数 - 1 -
⒈急性牙髓炎： 症状：①自发性阵发性痛（化脓时有搏动性跳痛）；②夜间痛；③温度刺激加剧疼痛（牙髓化脓或坏死时表现为热痛冷缓解）；④疼痛不能定位。 检查：①患牙可查及近髓腔的深龋或其他硬组织疾病，牙冠有充填体或深牙周袋；②探诊引起剧痛，可探及微小穿髓孔，可见少许脓血自穿髓孔流出；③温度刺激敏感；④早期叩痛不明显，晚期垂直轻度叩痛。 鉴别诊断：①三叉神经痛；②龈乳头炎；③急性上颌窦炎。 应急处理：①开髓引流；②消炎止痛；③针刺镇痛。 ⒉慢性牙髓炎： 病和较长，有长期冷热刺激痛史，咬合不适，轻叩痛，可定位患牙。 慢性闭锁型牙髓炎：①无自发痛，有长期的冷热刺激痛史；②可查及深龋洞，冠部充填体或其他牙硬组织疾患；③洞内探诊迟钝，去腐后无肉眼可见的露髓孔；④温度测验反应迟钝或迟缓；⑤多有轻度叩痛（+）或叩诊不适（±）。 慢性溃疡型牙髓炎：①无自发痛，当食物嵌入洞内出现剧烈疼痛；②冷热刺激剧痛；③查及深龋洞或近髓牙体损害，患牙长期废用，或见大量软垢、牙石堆积，洞内食物嵌塞；④去腐有穿髓孔，浅探不痛，深探剧痛或有暗红色血渗出；⑤温度测验敏感；⑥没有叩痛或轻微不适。 慢性增生性牙髓炎：①无自发痛，有进食痛或进食出血现象，长期不敢用患侧咀嚼食物；②患牙深龋洞中有红色肉芽组织━牙髓息肉，探之无痛易出血，患牙长期废用。 慢性牙髓炎诊断要点：①可定位患牙，有长期冷热刺激痛病史或自发痛史；②患牙有牙体硬组织疾病； ③患牙对温度测验异常；④叩诊反应作为重要指标。 慢性牙髓炎鉴别诊断：①深龋；②可复性牙髓炎；③干槽症。 牙龈息肉和牙周膜息肉的鉴别： 牙龈息肉：是患牙邻牙合面出现龋洞时，由于食物长期嵌塞和患牙缺损处粗糙边缘的刺激，牙龈乳头向龋洞增生所形成的息肉样物体。 牙周膜息肉：多根牙的龋损发展过程中，骨腔穿通，髓室底遭到破坏，外界刺激使根分叉处的牙周膜反应性增生，息肉状肉芽组织穿过髓底穿孔进入髓室，外观极像牙髓息肉。 ⒊牙髓坏死： 症状：①无自觉症状；②牙冠变色；③有自发痛史、外伤史、正畸治疗史或充填修复史； 检查：①牙冠可存有深龋洞或其他牙体硬组织疾患或有充填体深牙周袋，也可见完整牙冠者；②牙冠呈暗黄色或灰色，失去光泽；③牙髓无反应；④叩（-）或不适感（±）；⑤无窦道；⑥X线无明显异常。牙髓坏死的鉴别诊断：慢性根尖周炎。 急慢性根尖周炎： ⒈急性化脓性根尖周炎： ⑴根尖脓肿： 症状：自发性剧烈、持续的跳痛，伸长感加重，咬合痛。 检查：①叩痛(++)～(+++)松动Ⅱ°～Ⅲ°；②根尖部牙龈潮红，无明显肿胀，扪诊轻微疼痛；③相应的颌下淋巴结或颏下淋巴结可有肿大及压痛。 ⑵骨膜下脓肿（又叫牙槽骨骨膜炎或颌骨骨膜炎） 症状：患牙的持续性搏动性跳痛更加剧烈，疼痛达最高峰，患者极度痛苦，疼痛难忍，影响睡眠和进食，可有体温升高，乏力等症状。 检查：①患者面容痛苦，精神疲惫，体温升高38°左右，淋巴结肿大扪痛；②叩痛（+++），松动Ⅲ°，牙龈红肿，移行沟变平，有明显压痛，扪诊深部有波动感；③严重的可使相应面部出现蜂窝组织炎，表现为软组织肿胀，压痛，致使面容改变。 ⑶粘膜下脓肿：
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
牙髓间充质干细胞生产 I．目的：建立牙髓间充质干细胞制品生产规程。 II．范围：适用于牙髓间充质干细胞的生产；适用于技术部和各中心技术组的所有技术人员。 III．职责： 1.生产主管负责本制度的执行和监督； 2.技术组的所有技术人员要严格按照本流程的要求进行操作； 3.监督员负责全程监督，并即时按要求填写《牙髓间充质干细胞生产记录》和《生产试剂耗材记录表》。 附表1 牙髓/骨髓/脂肪/胎盘/脐带间充质干细胞生产记录 附表2 生产试剂耗材记录表 IV．规程： 一、牙髓间充质干细胞原代操作 消化法： 1.仪器耗材 1）10ml移液管 2）培养皿 3）50ml离心管 4）100μm筛网 5）T75培养瓶 6）15ml离心管 2.试剂 1）生理盐水 2）培养基 3）胶原酶 3. 酶消化法操作流程 3.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min； 3.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，
持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 3.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，转移到50ml离心管中，加入生理盐水至30ml,再加入10ml 0.2%胶原酶； 3.4 置于37℃恒温摇床，180rmp消化30min ； 3.5 用100μm滤网过滤； 3.6 1200 rpm离心10min ，吸取洗涤液4ml交给质检，并填写《样本取样单》；附表3 样本取样单 3.7 弃剩余上清，调整细胞浓度为107/ml,置于75cm2培养瓶中,放入37℃，CO 2培养箱中进行培养。 4. 组织块法操作流程： 4.1 将浸在含1%双抗的生理盐水中的牙齿取出，吸取运输液4ml交给质检，并填写《样本取样单》，牙齿置于75%酒精中浸泡30min； 4.2 取出牙齿在含10ml生理盐水的培养皿中清洗2-3遍，用止血钳固定牙冠，持骨钳夹碎牙根部，暴露出牙髓，用镊子取出牙髓并放入含有适量生理盐水的培养皿中； 4.3 用剪刀将牙髓组织块剪碎成1mm3，将组织块均匀铺到T25培养瓶（用适量FBS润湿瓶底）瓶底； 4.6 倒置培养瓶，并加入5ml培养基，放入培养箱中培养； 4.7 12-24h后，将培养瓶轻轻翻转，将牙髓组织块浸入工作液中。 二、牙髓间充质干细胞换液 1.耗材 1）10ml移液管 2）15ml离心管 2.试剂 培养基 3. 操作流程 3.1 镜下观察状态细胞； 3.2 吸取上清液4ml交给质检，并填写《样本取样单》； 3.3 吸取上清液于50ml离心管中留作精华液（原代培养上清不留），并补充新的
急性牙髓炎得病历病历书写: 急性牙髓炎得病历病历书写:姓名:某某性别: 年龄: 职业: 初诊时间(日期)主诉:左上后牙剧烈疼痛4天现病史:患者3天前自觉左上后牙自发性,阵发性剧烈疼痛,遇冷热刺激疼痛加重,并放射到同侧头,面部,昨天夜间疼痛剧烈,不能睡眠,今来就诊既往史:2个月前左上后牙遇冷热刺激疼痛,无其她不适,否认系统疾病史,否认药物过敏史。检查:⊥6远中邻面深龋,探(++),露髓,叩,松动无,冷(+++)。刺激去除后疼痛持续较长时间,牙龈无红肿,X线片根尖周影无明显异常。诊断:⊥6急性牙髓炎治疗计划:⊥6根管治疗处置:1,2%利多卡因上齿槽后神经阻滞麻醉下开髓,拔髓,髓腔内CP棉球开放2,2日复诊。姓名李小性别男年龄30 就诊日期:2006年5 月31 日药物过敏史:无药物过敏史主诉:左下后牙肿痛7天,伴发热3天。现病史:患者于7天前开始感左下后牙疼痛,肿胀,吞咽疼痛。自服药物后无效(具体用药不详),近三天感发热,无畏寒,肿胀加剧,故来我院诊治。即往史:平素身体健康,否认肝炎,结核等传染病史。无外伤手术史检查左下颌角肿胀,扪痛,无波动感,左下颌淋巴结可扪及一约1、5cm大小得淋巴结,质软,可移动,轻度压痛,颞下颌关节无弹响,下颌骨无畸形,各大延腺导管开口无红肿,无结石,舌体活动自如,张口中度受限,38近中阻生,游离端牙龈覆盖,有盲袋,可探及未萌出牙齿,扣+,牙龈红肿,触痛,可见少量脓性分泌物。颊侧可见肿胀,冷热,余牙无龋坏。全身情况::体温38、c 脉搏80次/分呼吸20次/分血压15/11千帕
发育正常,营养中等,神志清楚,急性痛苦面容,自动体位,检查合作。诊断:近中低位阻生并冠周炎治疗设计:1冠周冲洗引流,局部上药2 抗炎及全身对症治疗3炎症消除后拔除考试时间考试级别执业医师/ 执业助理医师考生签名年月日口腔门诊病例书写 上一篇/ 下一篇20070518 18:16:59 查瞧( 49 ) / 评论( 0 ) / 评分( 0 / 0 ) 一、口腔科病历书写要求 (一)病史 病案记录一般要求,已详见一般病历及普通外科病历,但须注意以下各项: 1、儿童时期得营养状及有关不良习惯。 2、口腔卫生情况、疾病史、手术史及治疗经过。 3、家族史询问患者直系亲属中就是否有人患过癌、糖尿病、结核病,先天性畸形等疾病。 (二)体格检查 应详述专科检查,即口腔及颌面部情况,应分述: 1、牙齿
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
急性牙髓炎的临床处理分析 发表时间：2013-02-26T14:57:37.950Z 来源：《医药前沿》2012年第36期供稿作者：周明珠[导读] 温度刺激可加剧疼痛: 冷热刺激可激发患牙的剧烈疼痛，若患牙正处于疼痛发作期内，温度刺激可使疼痛更为加剧。 周明珠 (浙江省桐乡濮院中心卫生院口腔科 314502) 【关键词】牙髓炎夜间痛应急处理开髓引流 【中图分类号】R781.31【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）36-0141-01 牙髓作为一种疏松结缔组织，所含的细胞、血管和神经对环境变化的反应与其他疏松结缔组织的反应基本一样，但牙髓有其自身的特点：(1)被坚硬的牙本质壁包围;(2)基质富含纤维具有粘性;(3)无有效的侧支血液循环。这些特点决定牙髓的感染途径主要为暴露的牙本质小管，牙髓暴露，牙周袋途径和血源感染。龋病是引起牙髓感染最常见的原因[1]。当细菌侵入牙本质距牙髓<1.1mm(包括修复性牙本质)时，牙髓可出现轻度的炎症;距牙髓<0.5mm时牙髓可发生明显的炎症;距牙髓<0.2mm时，牙髓内方可找到细菌。 1 急性牙髓炎的症状和体征 1.1 自发性阵痛: 在未受到外界刺激的情况下，突然发生剧烈的自发性尖锐疼痛，可持续数小时甚至一整天。化脓时，患牙有搏动性跳痛. 1.2 疼痛往往在夜间发作，或夜间疼痛较白天剧烈。 1.3 温度刺激可加剧疼痛: 冷热刺激可激发患牙的剧烈疼痛，若患牙正处于疼痛发作期内，温度刺激可使疼痛更为加剧。如果牙髓已有化脓或部分坏死，则患牙可表现为所谓的“热痛冷缓解”。 1.4 疼痛不能自行定位疼痛发作时，患者大多不能明确指出患牙。疼痛呈放射行或牵涉性，但这种放射痛绝不会放射到患牙的对侧区域。 1.5 患牙可查及极近髓腔的深龋或其他牙体硬组织疾患，或见牙冠有充填体存在或有深牙周袋。 1.6 探诊可引起剧痛，有时可探及微小穿髓孔。 1.7 处于晚期炎症患牙，可出现垂直方向的轻度扣痛。 2 急性牙髓炎发作的应急处理 在急性牙髓炎发作时，夜间不方便到医院就诊的情况下，有以下几种应急处理：(1)白酒中加盐搅匀，用药棉蘸之，用患牙咬住效果显著;(2)花椒一枚，含于龋齿处，可缓解疼痛;(3)用手指按摩合谷穴;(4)用盐水漱口可减轻疼痛;(5)改变体位，站立或坐位可缓解疼痛。 2 急性牙髓炎的治疗原则 (1) 保存活髓：对年轻恒牙的早期牙髓炎，临床上可酌情选用盖髓术或活髓切断术，尽可能保存全髓或根髓。(2)保存患牙：对不宜保存活髓者或保存活髓失败者临床上可酌情选用干髓术、根管治疗术、牙髓塑化术等，以保存患牙。(3)严格遵循无菌、无痛的原则，急性期应先行应急治疗，以缓解症状，减轻疼痛。 (4)尽量保留牙体组织，恢复牙体的形态、美观与功能。 3 急性牙髓炎的应急处理 (1) 迅速有效地解决患者的疼痛是急性牙髓炎治疗的首要原则，开髓引流是应急处理中最有效地方法[2]。对于深龋牙髓即将暴露的牙齿，可用锐利的控匙于最接近髓腔部开髓;对于逆行性或龋坏不深的应在局麻下开髓，目的是引流炎症渗出物和因之而形成的髓腔高压，以缓解疼痛。(2)针刺止痛：针刺以合谷为主，并根据患牙部位配合其他穴位。如上前牙配人中;下前牙配大迎或颊车;下后牙配下关或颊车。 (3)消炎止痛：一般可采用口服或注射的途径给予抗生素药物或止痛药。(4)急性牙髓炎在开髓减压等应急措施可缓解疼痛2～3天后进行正规的牙髓治疗方可治愈。 参考文献 [1]张建华. 急性牙髓炎的应急治疗体会.中国实用医药，2009，4(33)：61-62. [2]陈洁仪，刘娜.急性牙髓炎两种应急处理方法的疗效比较.广东牙病防治，2008，16(6)：269-270.
急性牙髓炎的病历病历书写： 急性牙髓炎的病历病历书写：姓名：某某性别：年龄：职业：初诊时间(日期)主诉：左上后牙剧烈疼痛4天现病史：患者3天前自觉左上后牙自发性，阵发性剧烈疼痛，遇冷热刺激疼痛加重，并放射到同侧头，面部，昨天夜间疼痛剧烈，不能睡眠，今来就诊既往史：2个月前左上后牙遇冷热刺激疼痛，无其他不适，否认系统疾病史，否认药物过敏史。检查：⊥6远中邻面深龋，探(++),露髓，叩(-)，松动无，冷(+++)。刺激去除后疼痛持续较长时间，牙龈无红肿，X线片根尖周影无明显异常。诊断：⊥6急性牙髓炎治疗计划：⊥6根管治疗处置：1，2%利多卡因上齿槽后神经阻滞麻醉下开髓，拔髓，髓腔内CP棉球开放2，2日复诊。姓名李小性别男年龄30 就诊日期：2006年5 月31 日药物过敏史：无药物过敏史主诉：左下后牙肿痛7天，伴发热3天。现病史：患者于7天前开始感左下后牙疼痛，肿胀，吞咽疼痛。自服药物后无效（具体用药不详），近三天感发热，无畏寒，肿胀加剧，故来我院诊治。即往史：平素身体健康，否认肝炎，结核等传染病史。无外伤手术史检查左下颌角肿胀，扪痛，无波动感，左下颌淋巴结可扪及一约1.5cm 大小的淋巴结，质软，可移动，轻度压痛，颞下颌关节无弹响，下颌
骨无畸形，各大延腺导管开口无红肿，无结石，舌体活动自如，张口中度受限，38近中阻生，游离端牙龈覆盖，有盲袋，可探及未萌出牙齿，扣+，牙龈红肿，触痛，可见少量脓性分泌物。颊侧可见肿胀，冷热-，余牙无龋坏。全身情况：：体温38.c 脉搏80次/分呼吸20次/分血压15/11千帕发育正常，营养中等，神志清楚，急性痛苦面容，自动体位，检查合作。诊断：近中低位阻生并冠周炎治疗设计：1冠周冲洗引流，局部上药2 抗炎及全身对症治疗3炎症消除后拔除考试时间考试级别执业医师/ 执业助理医师考生签名年月日口腔门诊病例书写上一篇/ 下一篇2007-05-18 18:16:59 查看( 49 ) / 评论( 0 ) / 评分( 0 / 0 ) 一、口腔科病历书写要求 （一）病史 病案记录一般要求，已详见一般病历及普通外科病历，但须注意以下各项：
1.牙髓炎的临床表现：1.自发性阵发性痛 2.夜间痛 3.温度刺激加剧疼痛 4.疼痛不能自行定位。 2.牙髓炎和急性根尖脓肿的应急处理：1.开髓引流2.切开排脓 3.去除刺激 4.调颌磨改 5.消炎止痛。 3.治疗的的步骤：根管预备、根管消毒和根管充填。 4.预备时要遵循的原则：1.尽量的清创，理论上应全部清除感染根管中细菌进入牙本质小管的厚度层2.适当成形，使根管形成冠根向由小到大、平滑、连续的锥度形态，不要过分扩大3.最大保存，保证根管壁有一定的厚度，使之具有安全的强度。 5.预备的基本原则：1.根尖区预备之前一定要有准备的工作长度2.根管预备要保持根管的湿润3.预备过程中，退出或换用一次器械需用根管冲洗液冲洗根管，防止残屑阻塞4.根管锉不可跳号5对于弯曲根管，根的根尖止点5.根管壁光滑无台阶 6.预备后的根管形态为冠方大根方小的连续锥形、无管锉应预弯 7.于根管充根最填，小扩大为25号，主尖锉一般比初尖锉大2-3号。 6.预备的质控标准1.选择的侧压器能自如地到达距工作长度1-2mm处2.主牙胶尖易于进入到根管的尖部3.尽可能保持根尖狭窄区的原始位置和大小4.根尖狭窄区明显，有明显偏移。 7.溃疡的临床表现一般表现为反复性的圆形或椭圆形溃疡，具有红、黄、O、痛的临床特性。 8.疱疹是由水痘-带状疱疹病毒所引起的，以沿单侧周围神经分布的族集性小水疱为特性，常伴有明显的神经痛。 9.反应是指机体受到某些抗原刺激后，出现生理功能絮乱或者组织细胞损伤的异常适应性免疫应答。 10.是一类严重的、慢性的黏膜-皮肤自身免疫大疱性疾病。 11.藓（OLP）是一种慢性浅表性炎症的皮肤-黏膜角化异常性疾病。 12.（PMD）是指发生在口腔黏膜上的以白色为主要损害，不具有其他可定义的损害。 13.肉芽肿又称毛细血管扩张性肉芽肿，是组织对创伤及感染的一种反应性病变，由毛细血管增生而形成的瘤样增生病变，为口腔黏膜的良性病变。 14.又称地图样舌，是一种浅表性非感染性的舌部炎症。 15.，表现为舌背一条或长或短的中心深沟和多条不规则的副沟。 16.合征是以舌部为主要发病部位，以烧灼样疼痛为主要表现的一组综合征又称舌痛症、。
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞
增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成