成体人牙髓干细胞的分离与鉴定
杨雪超樊明文
武汉大学口腔医学院(430079)
email:yangxuecao@https://www.doczj.com/doc/6d8416966.html,
摘要：目地从成人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，研究其生物学性状。方法选取年青患者因正畸拔除的完好牙齿，取出牙髓，采用酶消化及过滤的方法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性,矿化结节形成，牙本质唾蛋白表达，Hoechst33342染色，Oil Red-O 染色，PPARr2基因表达等方面进行检测。结果在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP 活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达牙本质唾蛋白，已向成牙本质细胞方向发生了分化。Hoechst33342染色大部分细胞为阴性。成脂肪诱导后，Oil Red-O染色阳性，检测到PPARr2基因表达。结论从成体人牙髓组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，能够进行分化，为进一步的深入研究奠定了基础。
关键词：成体人牙髓干细胞牙本质唾蛋白成牙本质细胞
1．引言
目前普遍认为，干细胞是具有无限或很强自我更新能力细胞，能分化产生至少一种高度分化的后代细胞。干细胞应具有两个基本性质：（1）自我更新能力，能通过分裂维持自身群体的稳定；（2）分化能力，在一定条件下能分化产生具有特定功能的细胞[1]。干细胞又分为胚胎干细胞和成体干细胞两类，后者是目前研究的新热点。研究表明，皮肤[2]，乳腺[3]，肌肉[4]，甚至神经组织[5]等成熟组织器官中都存在成体干细胞（adult stem cell）。最近，国外学者证实成人牙髓组织中也存在干细胞[6]，国内关于此领域的研究尚刚刚起步，本文是系列研究的第一步，旨在探寻一条分离牙髓干细胞的可靠途径，为更深入的研究奠定基础2．材料和方法
2.1 材料
α-MEM培养基，特极胎牛血清（Hyclone, USA）; collagenase type Ⅰ,dispase(Sigma,USA);ALP检测试剂盒（南京建成）；β-甘油磷酸钠（进口分装）；兔抗人DSP抗体（NIDCR LW.Fisher 博士惠赠）；FITC标记二抗（武汉博士德）；Oil Red-O，IBMX, Hoechst33324(Sigma,USA)；One-Step RT-PCR试剂盒（Promage）
2.2 方法
2.2.1细胞培养和克隆
采用临床19-29岁因正畸或阻生需要拔除的健康第三磨牙，依照文献方法无菌条件下取出完整牙髓[7]。将牙髓剪碎，加入50倍体积的0.2% collagenase typeⅠ及0.2% dispase（体积比1︰1），37℃水浴摇床消化1小时，1000rpm/min离心10分钟，去上清。培养液（含20%胎牛血清）重悬沉淀，用100μm钢网过滤重悬液，获得单细胞悬液。细胞计数板计数
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细胞浓度，调整后以1－2个细胞／孔的浓度接种于96孔板，常规培养7-14天，至出现细胞克隆（细胞数≥50为判定标准），扩大培养。
2.2.2 Hoechst33342染色
成功扩大培养的细胞克隆，取其第四代接种于6孔板，常规培养24小时，更换培养液（无血清的α-MEM，含0.12μg/ml Hoechst33342），37℃暗处孵育30分钟后1.5％冷福尔马林固定15分钟，冷PBS充分漂洗。倒置荧光显微镜下340nm波长光激发后观察荧光表达情况，以正常牙髓成纤维细胞作为对照。
2.2.3 细胞的定向诱导分化
成功扩大培养的细胞克隆，待生长至90%汇集，0.15%胰酶消化后，以5x103/cm2接种于6孔板和24孔板。传代后第二天改为诱导液培养（矿化液为含10%胎牛血清，50μg/ml α-抗坏血酸，10mMβ-甘油磷酸钠的α-MEM；脂肪分化体系为含10%胎牛血清，10－6M 地塞米松，0.5mM IBMX，0.1mMα-抗坏血酸的α-MEM）。
2.2.4 碱性磷酸酶（ALP）活性
细胞接种于24孔板，矿化液连续培养14天，弃去矿化液，0.01M冷PBS冲洗三遍，每孔加入细胞裂解液200μL，室温振荡10分钟，收集上清液。按照试剂盒说明检测细胞的ALP活性。
2.2.5 矿化结节
细胞接种于6孔板，矿化液连续培养14天，中止培养，0.01M冷PBS冲洗三遍，4%中性福尔马林固定后进行Von Kossa染色，具体方法参见文献[8]。
2.2.6 牙本质唾蛋白（DSP）的检测
细胞接种于6孔板，每个克隆有5个复孔，一部分细胞加矿化液连续培养；对应复孔细胞则用常规培养液培养。14天行DSP免疫荧光染色。具体操作步骤为：冷PBS洗去细胞表面培养液，以4%中性福尔马林固定15分钟后，-20℃甲醇继续处理10分钟；正常山羊血清封闭20分钟，兔人DSP特异性抗体4℃孵育过夜，PBS洗3次；FITC标记二抗37℃作用30分钟，PBS洗3次；水性封片剂封片，荧光显微镜下观察。
取矿化诱导前后细胞蛋白样品20μg经5－12％ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维素膜。用1％BSA室温孵育1h，以封闭非特异性结合位点，加入兔人DSP特异性抗体4℃过夜。根据相应的二抗及三抗，DAB显色5～10分钟，观察Western blot结果。
2.2.7 Oil Red-O 染色
经脂肪分化体系诱导培养21天后，部分细胞4％中性福尔马林固定10分钟，Oil Red-O 染液常温孵育1小时，充分漂洗后镜检，以正常牙髓成纤维细胞作为对照。。
2.2.8 PPARr2基因的表达
提取培养细胞总RNA，参考Genebank检索数据设计PPARr2特异性引物，上游：5' CTCCTATTGACCCAGAAAGC 3'，下游：5' GTAGAGCTGAGTCTTCTCAG 3'。RT-PCR检测PPARr2基因的表达。反应条件：50℃ 30min逆转录，94℃2min逆转录失活，然后94℃45s，56℃ 45s，72℃ 60s，35个循环，72℃延伸7min。PCR产物以2％琼脂糖凝胶电泳分析，并纯化后测序。以正常人脂肪细胞细胞作为阳性对照。
3. 结果
3.1 细胞生长和形态
通过消化和滤网过滤，细胞皆以单细胞方式贴壁生长，24小时内呈类圆形或不规则形，伸展不完全；24小时后少数单个细胞开始分裂增殖[图一]，7天后少数细胞增殖能力旺盛形成克隆[图二]，细胞克隆呈三角形，多角形等多种形态，但都有一共同特点——从中心向四周放散生长。消化分散后，多数细胞能够形成克隆[图三]。
3.2 Hoechst33342染色
体外培养的第四代克隆来源细胞经Hoechst33342染色后，大部分细胞荧光表达阴性或弱
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阳性[图四]；而对照组绝大多数细胞为阳性表达。
3.3 ALP活性与矿化结节
克隆来源细胞用矿化液连续培养14天，肉眼观可见白色点状物，倒置显微镜下细胞呈复层生长，局部形成白色的矿化结节，Von Kossa染色显示其中央区为紅黑色，周围逐渐变浅[图五]。对照组细胞虽然也可以形成细胞结节，但Von Kossa染色阴性，证实无矿化形成。
细胞经14天矿化液诱导培养后，其ALP活性与矿化结节的形成能力存在正相关。t检验结果表明[表一]克隆来源细胞细胞的ALP活性皆明显高于对照组细胞（P<0.05）。
表1 细胞ALP活性比较（X±S）
细胞n ALP活性（U/gpro）
克隆来源对照组 24
24
42.37±1.98
22.34±2.09 *
*P<0.05
3.4 DSP的表达
荧光显微镜下观察，克隆来源细胞经矿化液诱导培养14天后，DSP染色强阳性，细胞呈明亮绿色[图六]；未用矿化液诱导的复孔细胞及对照组细胞染色很弱，呈现模糊的暗暗绿色背景。
Western blot检测显示，矿化诱导后克隆来源细胞可见95KD处有DSP条带出现，诱导前则无[图七]。结果表明，克隆来源细胞经矿化液诱导培养后，有体外合成分泌DSP的能力，而DSP是目前衡量向成牙本质细胞分化成熟的一个最重要指标，从而证明细胞具有向成牙本质细胞分化的能力。
3.5 成脂肪分化检测
克隆来源细胞经成脂肪分化体系诱导培养21天后，光镜下可见细胞胞体明显肥大，折光度增加，富含脂滴并形成特殊的“鸡尾样”结构[图八]，Oil Red-O 染色阳性[图九]，而对照组细胞为阴性。
RT-PCR产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析，结果在340bp处有一特异性扩增条带（图十），与阳性对照条带相同，经测序后发现产物为PPARr2基因序列，说明诱导后有PPARr2基因的表达。
4.讨论
成体干细胞是近年来干细胞研究领域的新热点，一方面这是对传统发育生物学观点的革新[9]；另一方面由于利用胚胎干细胞面临复杂的伦理学问题和实际操作中的困难，因而对成体干细胞的研究及应用就更具有深远的意义。
目前已经证明，在机体许多成熟组织器官中存在成体干细胞，关于牙髓干细胞的研究是在口腔医学领域刚刚开始的一个热点。Gronthos等人[6，10]最早对人牙髓干细胞进行了研究，从成体牙髓组织中分离出的克隆形成细胞具有向成牙本质细胞分化的能力，首次证明了成体牙髓干细胞的存在。本研究在此基础上对此克隆形成细胞体外诱导分化，通过ALP活性，矿化结节形成和DSP的表达三个方面检测向成牙本质细胞方向分化的能力；通过Oil Red-O 染色和PPARr2基因表达检测向脂肪细胞横向分化的能力。
成牙本质细胞的主要功能是形成牙本质，ALP是参与骨等矿化组织代谢和再生的一种功能性标志酶，也参与牙本质的形成。研究表明，牙乳头外胚间充质细胞向成牙本质细胞分化的过程中分泌矿化前基质，在ALP等矿化因子作用下最终形成牙本质[11]，成牙本质细胞具有较高水平的ALP活性。本研究中，在矿化液诱导条件下，克隆来源细胞ALP活性水平显著高于对照组细胞，同时能够复层生长形成矿化结节，这初步证实这五组克隆具有形成牙本
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质的能力。
牙本质唾磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）基因编码表达牙本质唾蛋白(DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein,DPP),皆是唯一由成牙本质细胞合成和分泌的，只在牙本质中存在的蛋白，属于牙本质特异性基质非胶原蛋白，目前认为其是成牙本质细胞的特异性标志物[12]。过去由于缺乏特异性抗体来检测DSP的表达，多采用RT-PCR方法在mRNA 水平进行检测，但蛋白质水平检测始终是衡量分化成熟的金标准。本研究中使用NIDCR提供的兔抗人DSP抗体，采用免疫荧光法在蛋白水平检测DSP的表达，克隆来源细胞诱导后呈阳性着色，能够表达DSP；诱导前则着色阴性，不能够表达DSP，这一转变正是一个分化的过程。对照组细胞着色阴性，不表达DSP，没有向成牙本质细胞方向分化的能力。Western blot检测也得到相同结果。
本研究中克隆来源细胞具有高度增殖能力，而且能够向成牙本质细胞分化，符合干细胞的两个基本定义，可以认为就是成体人牙髓干细胞。由于体外培养的局限，未能呈现典型的成牙本质细胞形态，这将会在进一步研究中通过三维培养模式得到完善。
Hoechst33342是一种能和DNA特异性结合的荧光染料，常用于细胞核标记。近来发现干细胞能够将其主动排除胞外，表现出与成熟细胞不一样的特性[13]。本研究中探索性的使用Hoechst33342对传代后的克隆来源细胞活体染色，大部分细胞荧光表达阴性或弱阳性，这与正常牙髓细胞的阳性染色形成鲜明对比，表明Hoechst33342也能够作为牙髓干细胞的一个检测指标。弱阳性染色的事实，推测可能由于体外传代培养条件下，部分细胞发生自发分化的结果。
此外，目前发现某些组织中的成体干细胞具有多向分化的能力，具有高度的可塑性（Plasticity）,不仅能分化为来源组织的成熟细胞，而且还能横向分化（trans-differentiation）成不同胚层起源组织的细胞[9]。本研究对分离出的牙髓干细胞成脂肪分化诱导，光镜﹑组织化学检测到大量脂滴的形成；出现脂肪细胞特异性标记物PPARr2基因[14]的表达。证明牙髓干细胞有向脂肪细胞横向分化的能力。这进一步阐明了牙髓干细胞的分化潜能，也为其干细胞的身份提供又一可靠依据。
本研究结果证实了牙髓干细胞的存在，初步研究了其分化潜能，从而为今后进一步研究其生理生化特性，以及寻找特异性标记奠定基础。更重要的是，可以为的牙组织工程的应用奠定了实验室基础，提供良好的种子细胞来源。
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Identification and Isolation of human dental pulp stem cells
Yang- Xuecao ,Fan-Mingwen
Shool of stomatology, Wuhan University
Hubei Wuhan 430079
Abstract
Objective To isolate and cultivate human dental pulp stem cells(DPSCs). Methods Pulp tissue was removed from healthy young human teeth extracted for orthodontic purposes. The pulp was digested by Type Ⅰcollagenase and dispase.Then single-cell suspensions were obtained by filter and cultivated. Under the conditions of inducement, clones were identified by Hoechst33342 dyeing, activity of alkaline phosphatase(ALP),formation of mineralized nodule and expression of dentin sialoprotein, and by Oil Red-O dyeing and expressing of PP ARr2. Results The clones took on dramatically high activity of ALP when stimulated to differentiation. These cells had the ability of mineralization and expressed specific marker(DSP) of odontoblast.These cells also had ability to trans-differentiate into adipocytes. Conclusion There are stem cells in human dental pulp tissues ,which can be isolated and cultivated.
Keywords:human dental pulp stem cells; sialoprotein; odontoblast
杨雪超：男。1976年生。博士研究生。主要研究方向是牙髓病学。
本课题得到教育部博士点基金资助（基金编号20020486032）
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图一培养24小时，单细胞贴壁情况（40×）图二培养第7天，形成细胞克隆（20×）
图三克隆细胞传代培养（10×）图四 Hoechst33342荧光染色（10×）
图五矿化结节（Von Kossa染色，20×）图六 DSP阳性表达细胞（FITC荧光染色，40×）
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图七 DSP Western blot检测
1 诱导后克隆细胞的DSP 表达 2诱导前克隆细胞的DSP 表达
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图八成脂肪诱导21天后，细胞中有大量脂滴（10×）图九 Oil Red-O 脂滴染色阳性（10×）
Marker 1 2 Marker
图十 PT-PCR检测PPARr2基因的表达
1 成脂肪诱导后克隆来源细胞PT-PCR结果
2 人脂肪细胞细胞作为阳性对照PT-PCR结果
Marker 为DL2000(TAKARA, Japan)
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牙体牙髓病学练习题 一、A1 1、对固位钉的描述不正确的是 A、固位钉的钉道应大于钉的直径 B、固位钉的数目应根据牙体缺损情况而定 C、摩擦固位钉的钉道大于钉的直径 D、自攻螺纹钉遇到一定阻力即于颈部折断 E、黏固钉的固位力相对不强 2、下列哪种材料对牙髓刺激小并可促进牙本质形成 A、磷酸锌水门汀 B、聚羧酸水门汀 C、玻璃离子水门汀 D、氢氧化钙糊剂 E、银汞合金 3、玻璃离子充填时，洞形要求错误的是 A、洞有一定的深度 B、洞缘去除无基釉 C、洞缘可做洞斜面 D、可降低固位形要求 E、洞底可呈弧形 4、制备倒凹是为了 A、获得良好的抗力形 B、便于垫底 C、便于充填 D、获得良好的固位形 E、便于放置盖髓剂 5、大面积龋损修复时，固位钉在修复体与牙本质中长度一般应为 A、小于2mm B、大于2mm C、1.5~2mm D、1~1.5mm E、1mm 6、增强窝洞抗力的方法不包括 A、去除无基釉 B、去除薄壁弱尖 C、保留承力区的薄壁弱尖 D、洞缘线设计为圆钝曲线 E、洞形成箱状 7、下列不属于复合树脂嵌体的特点的是 A、固化不受光照的影响
B、可减少微渗漏 C、较树脂充填修复抗压能力强，且耐磨 D、主要适用于Ⅱ、Ⅲ类洞 E、解剖外形恢复较好 8、过小牙常见于 A、上颌切牙 B、下颌切牙 C、上颌侧切牙 D、下颌侧切牙 E、上颌尖牙 9、牙体形态异常不包括 A、融合牙 B、釉质发育不全 C、牙中牙 D、过小牙 E、畸形中央尖 10、牙齿发育异常不包括 A、结构异常 B、牙列异常 C、形态异常 D、数目异常 E、萌出异常 11、Hutchinson牙是指 A、遗传性乳光牙本质 B、结合牙 C、先天性梅毒的半月形切牙 D、畸形舌侧沟 E、牙本质过敏 12、有关先天性梅毒牙描述正确的是 A、多见于恒牙，乳牙少见 B、一般是在胚胎早期遭受受梅毒严重侵犯导致 C、梅毒螺旋体可通过胎盘作用于胎儿 D、患者可表现为半月形的磨牙 E、桑葚状磨牙与间质性角膜炎以及神经性耳聋称为哈钦森三征 13、先天性梅毒牙常见牙位为 A、11、12、16、21、22、26、31、32、36、41、42、46 B、11、16、21、26、31、32、36、41、42、46 C、11、16、21、26、31、35、36、41、45、46 D、11、12、16、21、22、26 E、31、32、36、41、42、46
大肠埃希氏杆菌噬菌体的分离与纯化 【实验目的】 1.培养自主查阅资料，自行设计、整理实验方案，自己安排实验的能力。 2.通过综合性大实验进一步掌握微生物实验的基本原理和技术、培养无菌意识。 3.培养互助协作的团队精神和分析解决问题的能力。 4.掌握从污水中分离和纯化大肠埃希氏菌噬菌体的原理。 5.掌握噬菌体的分离与纯化以及用双层琼脂平板法培养噬菌体的方法。 【实验原理】 1.凡有寄主细胞存在的地方，一般都能找到其相应的噬菌体。粪便和阴沟污水等往往是各种肠道细菌尤其是大肠杆菌的栖居地，故常能从其中分离到各肠杆菌噬菌菌株的相应噬菌体。 2.从自然界分离某一噬菌体的一般方法是： （1）培养寄主细胞（大肠杆菌）； （2）采集含有相应寄主细胞的噬菌体（阴沟污水）； （3）将样品内的细胞进行富集培养； （4）制备噬菌体裂解液； （5）检测噬菌体是否存在； （6）噬菌体的纯化及效价测定。 3.培养基的配制（配方）与灭菌 （1）3×牛肉膏蛋白胨培养液： 牛肉膏9克，蛋白胨30克，NaCl 15克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4. （2）牛肉膏蛋白胨培养液： 牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4. （3）牛肉膏蛋白胨固体培养基： 牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条20克，自来水1000 ml，Ph 7.2-7.4。 （4）牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基： 牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，琼脂条7克，自来水1000ml,Ph 7.2-7.4。 封好做好标记于121℃灭菌20min备用 【实验材料及器皿】 1.菌种：大肠埃希氏菌。 2.噬菌体样品：矛坡的阴沟污水 3.培养基：3×牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨培养液，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂半固体培养基。 4.仪器：离心机，恒温水浴锅，冰箱，恒温培养箱，高压灭菌锅，酒精灯，量筒，微量移液器及枪头，火柴，接种针，标记笔，无菌涂布棒，培养皿，试管，三角瓶，电热炉，玻璃棒，牛皮纸，纱布，PH试纸，橡皮筋。 【实验方法步骤】 第一周：实验方案的讨论与完善 第二周：培养基的配制及相关实验器材的灭菌 牛肉膏蛋白胨固体培养基100ml，并取三个试管各加入3—4ml以搁斜面保留菌种 3X牛肉膏蛋白胨培养液50ml，装小三角瓶内 牛肉膏蛋白胨培养液100ml分装到5个大试管中，每管9ml，并依次标记10-5—10-1，剩余的装试管做好标记 离心管12个（包好） 无菌水2管（3—4ml每管）
分子生物学实验报告 题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定 姓名：学号：班级：时间： 一、实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 2.凝胶电泳进行DNA分离纯化： 电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可
牙髓干细胞 1牙髓干细胞概念 牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年Gronthos[1]等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)。现在普遍认为牙髓组织中具有形成细胞克隆能力和较强增殖能力的未分化间充质细胞即DPSCs[2]。 2牙源性干细胞 至今，已从人类牙齿相关组织中分离和鉴定出7种干细胞: (1)牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC)[1]，来自恒牙牙髓；张巍巍等[3]以人牙髓干细胞为种子细胞与PLGA支架材料在体外进行复合培养，表明PLGA 有利于于牙髓干细胞的粘附与增值。Lindroos等[4]得到DPSC与其他间充质源性干细胞具有相似的表面标志物和骨相关性的标志物的结论，支持DPSC在硬组织再生方面的可能性。从成人第三磨牙牙髓中分离的DPSC在适宜的条件下可诱导分化为有功能活性的神经细胞，并在基因和蛋白水平表达神经组织专有的标志物[5]，为治疗神经系统方面的疾病提供了新的途径。DPSCs不表达成牙本质细胞特征性蛋白DSP、DMP，则表明DP-SCs尚处于未分化状态[6]。我国学者通过对根髓和冠髓进行比较时发现：DPSCs 存在于全部牙髓之中,在根髓中的密度更高[7]。 (2)人类脱落乳牙牙髓干细胞(stem cell from the pulp of human exfoliated deciduous teeth, SHED),来自儿童脱落乳牙的牙髓;Miura等[8]研究发现，正常脱落的乳牙牙髓中的细胞经培养会表现出成纤维细胞样生长，其增殖率和群体倍增数均比骨髓基质干细胞(BMMSC)、DPSCs高，于是首次提出了SHED的概念。Shen YY等[9]发现SHED在体外培养过程中可以表达成骨细胞的标志，如RUNX-2、OCN、BSP，表明SHED在体外可以分化为成骨细胞;将SHED与人类牙齿切片复合后，在体外培养或是植入免疫缺陷小鼠皮下，均表达成牙本质细胞分化的标志( DSPP，DMP-1，MEPE)[10]。一系列实验表明SHED在体内只能诱导宿主细胞分化为成骨细胞[11]，而其自身无法分化为成骨细胞，但在体外培养过程中却可以分化为成骨细胞。SHED 可能还具有参与机体的免疫调节等功能[12]。李丽文[13]等用不同密度接种培养DPSCs,计算细胞产量、倍增次数, 观察细胞形态、检查克隆形成率和钙结节形成能力的方法得到，1.5～3cells/cm2低密度接种培养DPSCs 有利于细胞快速扩增,扩增后的细胞保持较高的增殖和分化潜能。SHED 的增殖能力、克隆形成效率和钙结节形成能力均优于DPSCs。 (3)根尖乳头干细胞(stem cell from the apical papilla,SCAP)[14,15]，来自牙根发育未完成的根尖乳头；Abe等[16]从人年轻第三磨牙根末端分离根尖周牙乳头，并采用酶消化法从中分离出细胞进行研究，结果发现这种细胞在低密度下培养时，
牙体牙髓病试题一,单选题(每题 2 分,共 50 分) 1.下列哪项不是急性龋的特点 A,多见于儿童及青年人 B,病变组织颜色浅 C,病变进展快 D,质地软而湿 E,去腐时必须用钻取出 2.龋病导致的牙体硬组织缺损,可由以下那种方法治疗 A,药物治疗 B,自行修复 C,充填治疗 D,再矿化疗法 E,以上方法均可以 3.下列龋病类型哪种是按损害程度分类的 A,急性龋 B,慢性龋 C,中龋 D,静止龋 E,窝沟龋 4.静止龋主要是在下列何种情况下产生的 A,机体抵抗力增加 B,牙齿再矿化能力增加 C,牙面产生龋的环境消失 D,口内致龋病菌减少 E,牙齿的抗酸力增加 5.恒牙龋病的最好发部位是 A,磨牙合面窝沟 B,后牙邻面 C,后牙颈部 D,后牙颊面 E,前牙邻面 6.恒牙龋病的最好发牙位为 A,下颌第一,二磨牙 B,上颌第一,二磨牙 C,前磨牙 D,上前牙 E,以上牙位依次好发 7.下列各项中,哪一项不是深龋的临床表现
A,冷热刺激痛 B,食酸甜食物敏感 C,自发痛 D,食物嵌塞痛 E,牙髓活力测试正常 8.深龋备洞时,下列哪项措施是错误的 A,洞底平,侧壁平直,两者相垂直 B,去尽腐质 C,保护牙髓 D,洞缘线圆钝 E,尽量保留健康牙体组织 9.复合树脂充填时,不宜用氧化锌丁香油糊剂垫底是因为 A,可致树脂性质改变 B,影响树脂聚合 C,影响树脂与牙粘接 D,抗压强度不足 E,使树脂色泽改变 10.下列哪个时期生活在高氟区,可造成氟牙症发生 A,0～7 岁 B,8～15 岁 C,16～22 岁 D,23～30 岁 E,31 岁以后 11.为防止四环素牙的发生,哪些人不宜使用四环素类药物 A,妊娠期和哺乳期妇女 B,3 岁以下小儿 C,妊娠期,哺乳期妇女和 8 岁以下儿童 D,8 岁以上儿童 E,所有人 12.牙隐裂检查时最有帮助的检查是A,视诊 B,探诊 C,X 线 D,涂碘染色 E,温度测验 13.Black 窝洞分类的是根据 A.窝洞所在的部位 B.牙的解剖形态 C.龋洞发生的部位 D.不同牙位功能 E.充填材料性质 14.患者 18 岁,右下大牙不适就诊.查:右下第二前磨牙颊侧根部瘘管,合面 ,X 中央尖出现圆形黑环,叩诊(+) 线片示其根尖孔未形成,根尖暗影.牙髓感染途径为 A,深龋 B,畸形中央尖 C,血源性感染 D,逆行性感染 E,创伤 15.患者,女,右侧后牙咀嚼酸痛 3 个月余.查:右下第一磨牙合面近中釉质磨 .该牙最佳治疗损明显,探酸,叩诊(-) A,调合 B,牙髓治疗 C,全冠修复 D,脱敏治疗 E,充填治疗 16.引起牙髓病的病因的主要因素为A,细菌感染 B,物理因素 C,化学因素D,免疫因素 E,特种因素 17.引起牙髓感染的主要途径为 A,暴露的牙本质小管 B,牙髓暴露 C,牙周袋途径 D,血源感染 E,以上都是 18.温度刺激出现疼痛,但刺激去除后疼痛即可消失,可能为 A,牙髓正常 B,牙髓坏死 C,可复性牙髓炎 D,牙髓钙化 E,慢性牙髓炎 19.若诊断为逆行性牙髓炎,检查最重要的是 A,牙龈出血 B,龈下牙石 C,牙周溢脓 D,深牙周袋 E,深的龋洞
牙体牙髓病学大纲.txt11生命是盛开的花朵，它绽放得美丽，舒展，绚丽多资；生命是精美的小诗，清新流畅，意蕴悠长；生命是优美的乐曲，音律和谐，宛转悠扬；生命是流淌的江河，奔流不息，滚滚向前牙体牙髓病学绪论 了解：牙体牙髓病学的主要内容、特点及发展简史。 第一篇龋病 第一章概述 第一节龋病的概念 掌握：龋病的定义；龋病的特征。 了解：龋病的直接危害和间接危害；龋病的历史，龋病学的研究内容。 第二节龋病流行病学 掌握：龋病的好发部位。 熟悉：龋病流行病学的评价方法。 了解：目前龋病的流行情况，龋病的流行趋势。 本章思考题： 1、龋病的概念、临床特征？ 2、龋病的好发部位？ 第二章龋病病因及发病过程 第一节牙菌斑 掌握：牙菌斑的三层结构特点；获得性膜的概念及其功能，微生物致龋的证据，三大主要的致龋微生物菌属；牙菌斑与龋病的关系。 了解：不同牙面菌斑的组成，牙菌斑的形成和发育，细菌的附着和聚积，菌斑微生物学，牙菌斑的物质代谢，糖的分解代谢和合成代谢。 第二节饮食因素 掌握：蔗糖与龋病的关系及其机制，氟的抗龋机理。
了解：蔗糖和其他碳水化合物，了解蛋白质、脂肪和其他物质与龋病的关系。 第三节宿主 掌握：牙对龋病敏感性的差异及其原因，唾液与龋病的关系。 了解：唾液的基本组成，唾液的几种主要蛋白质的功能，龋病与免疫的关系。 第四节影响龋病发生发展的其他因素 了解：龋病与年龄、种族、性别和遗传的关系。 第五节病因学说 掌握：龋病病因的四联因素理论。 熟悉：内源性理论、外源性学说、蛋白溶解学说、蛋白溶解－鳌合学说，Miller化学细菌学说（先进性与局限性）。 本章思考题： 1、牙菌班的形成过程？ 2、影响龋病发生和发展的其他因素？ 3、龋病病因四联因素理论？ 第三章龋病临床特征和诊断 第一节龋病的临床病理过程 熟悉：釉质龋、牙本质龋、牙骨质龋的临床病理学特征。 了解：脱矿和再矿化。 第二节龋病的临床表现及分类 掌握：龋病的好发部位及其规律，好发牙，好发牙面，牙面好发部位，常用的临床检查方法，浅、中、深龋的临床表现和诊断、鉴别诊断。 熟悉：龋病的临床分类，龋病的检查方法，早期龋的检查方法。 本章思考题：
牙体牙髓病学试题库及答案 1. 在深龋中，细菌可以通过暴露的牙本质小管感染牙髓，下列说法正确的是 A. 牙本质厚度 <2mm, 牙髓内可找到细菌 B. 牙本质厚度 <1.1mm, 牙髓内可找到细菌 C. 牙本质厚度 <0.5mm, 牙髓内可找到细菌 D. 牙本质厚度 <0.2mm ，牙髓内可找到细菌 ( 正确答案 ) E. 牙本质厚度 <1.5mm ，牙髓内可找到细菌 答案解析：【答案】 D 【解析】在深龋中，细菌可经牙本质小管进入牙髓而使牙髓感染。牙本质厚度 <0.3mm ，牙髓可发生明显的炎症，牙本质厚度 <0.2mm, 牙髓内可找到细菌。故本题选 D 。若小于 0.2mm, 即使未穿通髓腔，牙髓也可能感染。 2. 银汞合金的成球多是因为 A. 研磨时间过短 B. 研磨时间过长 C. 银的含量过多 D. 钢的含量过多 E. 汞的含量过多 ( 正确答案 ) 答案解析：【答案】 E
【解析】汞是液态金属，少量成球状，所以银汞合金混合时汞的含量过多，则多余的汞就形成球状，所以银汞合金的成球多是因为汞的含量过多，所以 E 正确， C 、 D 错误。研磨时间的长短，会影响银汞合金的特性，但是不会成球状，所以 A 、 B 错误。故此题选 E 。 3. 以英文字母 DLa 记录的窝洞是 A. 远中唇面洞 ( 正确答案 ) B. 颊 ( 牙合 ) 面洞 C. 远中（牙合）面洞 D. 近中唇面洞 E. 舌（牙合）面洞 答案解析：【答案】 A 【解析】临床记录规定以各牙面的英文名称的第一个字母表示( 大写），远中面 ( 英文 distal) 以 D 表示，唇面 ( 英文为labial) 以 La 表示，所以以英文字母 DLa 记录的窝洞是远中唇面洞，所以 A 正确 ,B 、 C 、 D 、 E 都不正确，故此题应选 A 。 4. 下列临床表现可诊断为冠龋的是 A. 探针可伸入底部坚硬的窝沟 B. 着色的不平坦区 C. 中度氟牙症的釉质凹陷 D. 底部发软的窝沟 ( 正确答案 ) E. 釉质上的白斑
《牙体牙髓病学》考试样题 本卷满分 100 分考试时间为 90 分钟 一、单选题(四选一),以下各题，每题有四个选项，其中有且只有一个选项是正确的，请选择正确答案填入括号中。 (本大题共7小题,7分) 1. 深龋的主要症状是（） A．激发痛 B．自发痛 C．放散性痛 D．三者皆有 【答案】A 2. 猛性龋是（） A．多数或全口牙发生急性龋 B．龋坏进展较快 C．龋坏发生的牙面广泛 D．以上全是 【答案】D 3. 全酸蚀粘接时，涂布酸蚀剂的最佳顺序为（） A.釉质本质一起涂 B.先釉质，后牙本质 C.先牙本质，后釉质 D.先后都一样 【答案】B 4. 下列哪项不属于根尖手术适应症（） A．广泛的根尖周骨质破坏，牙周支持组织过少 B．根折并伴有移位 C．根管钙化，弯曲严重或已做桩冠而未进行根管治疗者 D．根管治疗反复失败者 【答案】A 5. 根管倒充填材料不包括（） A．磷酸锌水门汀 B．玻璃离子水门汀 C．复合树脂 D．银汞合金 【答案】A 6. 根管钉进入根管的深度应（） A.越深越好 B.根管上段1/3 C.根管长度的1/2-2/3 D.全部都是 【答案】C 7. 使用自身攻纹型牙本质钉所需牙本质厚度是（） A．钉径内外各1mm
B．钉径内外各0.75mm C．钉径内外各0.5mm D．全部都是 【答案】B 二、单选题(五选一) (本大题共14小题,14分) 1. 有症状不可复性牙髓炎剧痛时最佳处理办法是（） A．开髓引流 B．开髓后同时拔除牙髓 C．安抚治疗 D．封失活剂 E．止痛剂放在牙周袋内可不开髓 【答案】A 2. 男性，44岁。右上后牙自发性跳痛3天。显间歇性发作，坐立不安。半年前，右上后牙进食冷热饮食时有酸痛，有时有慢性钝痛。近1周进食冷热饮食时疼痛明显增加，且疼痛持续时间较长。3天前出现自发性剧烈跳痛，呈间歇性发作并放射到颞部。夜间跳痛更甚。患者无法确定患牙部位。口腔检查：视诊右侧后牙未见明显龋洞，右上第二双尖牙叩诊疼痛(+)，牙周探诊(-)。应急处理后3天复诊，已无自发痛，叩诊疼痛(-)，应采用的进一步治疗方法是（） A．直接盖髓术 B．根管治疗术 C．牙髓切断术 D．干髓术 E．牙周龈下刮治术 【答案】B 3. 患者女，35岁，左上后牙2周前因冷热痛、自发痛在外院治疗，未见好转。2天前，疼痛明显加重来就诊。检查：左上7远中邻合面龋洞已开放，内有棉球，远中破坏达龈下2mm，叩(±)，探诊无感觉；颊侧龈根尖处见有瘘管口。左上8远中邻合面深龋，探疼，叩(±)，冷热测引起持续疼，冠破坏大，颊向错位，左上6咬合面近中向有隐裂继发龋损，叩(±)，侧方咬合有早接触，隐裂处冷测稍敏感，不持续。左下8缺失。对主诉牙的处理应为主诉牙应为（） A．拔除 B．塑化治疗 C．调牙合、充填、全冠 D．调牙合、塑化治疗 E．根管治疗+全冠修复 【答案】A 4. 患者女，19岁，诉进食时右下后牙疼痛，偶有出血。检查见：右下6髓腔内充满肉芽组织。则进一步的处理应为（） A．封砷 B．探针查息肉来源 C．X线片观察根尖孔情况 D．去除冠髓封FC E．局麻下行干髓术治疗 【答案】B 5. 下列哪类牙齿疾病不易患龋（） A.四环素牙
口腔内科学习题及答案（A1型题12） 一、A1型题：每一道考试题下面有A、B、C、D、E五个备选答案。请从中选择一个最佳答案，并在答题卡上将相应题号的相应字母所属的方框涂黑。 1．牙隐裂好发于 A．下颌第一磨牙 B．上颌第一磨牙 C．下颌第二磨牙 D．上颌第二磨牙 E．上颌前磨牙 正确答案：B 2．牙面窝沟5种分类中占比例最高的是 A．V型 B．U型 C．I型 D．IK型 E．其他类型 正确答案：A
3．后牙鸠尾峡的宽度一般为颊舌牙尖间距的A．1／4到1／3 B．1／3到1／2 C．1／5到1／4 D．1／2到2／3 E．2／3到3／4 正确答案：B 4．与口腔黏膜感染有关的疱疹病毒包括A．单纯性疱疹病毒 B．水痘-带状疱疹病毒 C．巨细胞病毒 D．EB病毒 E．以上均是 正确答案：E来源：考试大 5．目前最多采用的牙龈翻瓣术切口是 A．内斜切口 B．外斜切口
C．垂直切口 D．保留龈乳头切口 E．弧形切口 正确答案：A 6．成人牙周炎治疗的目的是 A．彻底消除病原刺激物 B．消除牙龈炎症 C．使牙周袋变浅 D．改善附着水平 E．以上均是 正确答案：E 7．关于年轻恒牙龋蚀修复时注意点哪项是错误的 A．为避免不必要的露髓，去除深部软化牙本质时，可选用挖匙挖 B．混合牙列期恢复恒牙牙体时要强调牙齿间的接触点，以保持牙列整齐C．穿通髓腔时做间接盖髓 D．因很难确定洞形的边缘，用复合树脂充填的同时加用窝沟封闭剂
E．若龋洞部分被牙龈覆盖，亦应按洞形制备原则扩展达龈下正确答案：B 8．以下情况哪项不是导致口腔念珠菌病多发因素 A．长期使用广谱抗生素 B．长期精神抑郁、紧张 C．长期使用免疫抑制剂 D．患有慢性消耗性疾病 E．白色念珠菌毒力增强 正确答案：B 9．急性溃疡性坏死性龈炎的主要致病菌为 A．溶血性链球菌 B．白色念珠菌 C．变形形链珠菌 D．金黄色葡萄球菌 E．棱形菌及螺旋体 正确答案：E 10．口腔正常菌群对宿主有益之处不包括
噬菌体的分离与纯化实验用具及材料 1.菌种：大肠杆菌 2.试剂：氯仿 3.培养基： 1）液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6g， NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌； 2）3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g， NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭 菌； 3）固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入 1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌； 4）半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入 0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌 4.仪器及其他用品：灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌细菌 过滤器（孔径0.22um），培养皿，蓝盖试剂瓶，恒温水浴 锅，离心机等 实验步骤 1.噬菌体的分离 （1）制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1）的试管中，混合均匀后置 37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下 菌苔，制成菌悬液。
（2）增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2）大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL，混 合后置37℃振荡培养12～24h。 （3）制备裂解液：将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一 无菌离心管中。 （4）确证试验所得裂解液经37℃培养过夜，经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在；还可加入几滴氯 仿，稍作混合，备用。 （5）噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL（1滴）大肠杆菌菌液，用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在培养 基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上， 置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明 或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。 2.噬菌体的纯化 （1）取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液，混合均匀； （2）取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃（可预先溶化后置45～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的 混合物，混匀后快速倒入底层培养基上，铺匀，置37℃培 养12~24h； （3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。此过程制备的裂解液中往往 有多种噬菌体，需进一步纯化； （4）纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培
精品文档 一、名词解释 1 继发龋：龋病治疗后，由于充填物边缘或窝洞周围牙体组织破裂，形成菌斑滞留区，或修复材料与牙体组织不密合，留有小的缝隙，这些都可能成为致病条件，产生龋病，成继发龋。 2 根管治疗术：是治疗牙髓病及根尖周病首选的方法，它是彻底清理根管内炎症牙髓和坏死物质、扩大成形根管，并对根管进行适当消毒、最后严密充填根管，以去除根管内感染性内容物对根尖周组织的不良刺激，防止根尖周病的发生或促进根尖病变愈合。 3. 残髓炎：属于慢性牙髓炎，临床特点常表现为自发性钝痛、放散性痛、温度刺激痛。发生在经牙髓治疗后的患牙，由于残留了少量炎症根髓或多根牙遗漏了未作处理的根管。 5．retrograde pulpitis 逆行性牙髓炎：逆行性牙髓炎的感染来源于患牙牙周病所致的深牙周袋。袋内的细菌及毒素通过根尖孔或侧、副根管逆行进入牙髓，引起根部牙髓的慢性炎症，也可由局限的慢性牙髓炎急性发作。此型牙髓炎的感染走向与通常由冠部牙髓开始，逐渐向根部牙髓进展的牙髓炎方向相反，故名为逆行性牙髓炎。 4. 窝沟封闭：是窝沟龋的有效预防方法。封闭剂作为一屏障，使窝沟与口腔环境隔绝，阻止细菌、食物残渣及其酸性产物等致龋因子进入窝沟。含氟封闭剂有屏障和持续释放氟，促进再矿化的双重作用。 5. 牙本质过敏症：又称过敏性牙本质，是牙在受到外界刺激，如温度、化学物质以及机械作用等所引起的酸痛症状。其特点为发作迅速、疼痛尖锐、时间短暂。牙本质过敏不是一种独立的疾病，而是各种牙体疾病共有的症状，发病的高峰年龄在40 岁左右。 6 根尖诱导成形术：牙根尚未发育完成期间，牙髓已经感染、坏死、分解或已有根尖周病变，则牙根停止发育，采取促使根尖的形成或封闭的治疗方法。 7 再矿化治疗：用人工的方法使已经脱矿、变软的釉质发生再矿化，恢复硬度，使早期釉质龋终止或消除的方法。 8 牙髓切断术：是指切除炎症牙髓组织，以盖髓剂覆盖于牙髓断面，保留正常牙髓组织的治疗方法。 9 逐步后退法：选用能深入根管达牙本质牙骨质界的初尖锉，确定工作长度，由初尖锉逐步扩大到主尖锉（比初尖锉大三号），由预备根管尖段，到 预备根管中段及冠段，最后通畅整个根管的预备方法称逐步后退法。适用于直根管和轻中度弯曲根管。 10鸠尾固位：固位形的外形似斑鸠的尾部，由鸠尾峡和膨大的尾部组成，借助于峡部的扣锁作用防治充填体从洞底呈水平方向脱位，一般鸠尾峡后牙为颊舌径的1/4—1/3，前牙为邻面洞舌方宽度的1/3—1/2 。 11 获得性膜acquired pellicle ：唾液中的糖蛋白以及其他成分黏附在牙齿表面形成的一层均质无细胞的生物膜。磨牙症：睡眠时有习惯性磨牙或白昼也有无意识磨牙习惯者。 楔状缺损wedge-shaped defect ：是牙齿唇颊侧颈部硬组织发生缓慢消耗所致的缺损，常呈楔形。 釉质发育不全enamel hypoplasia: 在牙发育期间,由于全身疾患,营养障碍或严重的乳牙根尖周感染导致的釉质结构异常. 分釉质发育不全 和釉质矿化不全两种类型. 二、简答题 获得性膜的作用： 1）、修复或保护釉质表面2）、为釉质提供有选择的渗透性 3）、影响特异性口腔微生物对牙面的附着4）、作为菌斑微生物的底物和营养。 简述龋病的诊断方法 ①视诊：观察牙齿的色泽改变②探诊：探察有无缺损、龋洞，受损组织质地软硬程度③温度诊检查 ④X线照相检查：咬翼片和根尖片，以确定不易探察到的龋损，如邻面龋和隐匿龋充填后疼痛的原因及处理原则？（ 5 分） 1、牙髓性疼痛 ①激发痛冷热痛：钻磨过程产热或酸蚀剂刺激致牙髓充血的表现。咬合痛：可能与过高充填、金属电流作用有关。 ②自发痛原因同上或诊断有误。 处理牙髓充血者，应去除充填体，进行安抚治疗，待症状消失后再行充填；由电流作用引起者，去除银汞合金充填体，更换非金属材料充填；如对颌牙修复体不良，则更换对颌牙修复体。患牙出现自发痛，应进行牙髓治疗，但治疗前应排除同侧有无其他牙髓炎的患牙。 2、牙周性疼痛 ①咀嚼痛：原因：充填物过高、粘结修复时酸蚀液刺激牙颈部。处理：磨除高点，颈部用氟化钠糊剂脱敏，用塞治剂保护。 ②持续性自发钝痛：原因：充填物悬突压迫牙间乳头，邻面接触区恢复的凸度不理想。处理：去除悬突、修整邻面或重新充填。 充填物折裂、松脱 1. 原因（1）窝洞预备：没有足够的抗力形固位形， （2）充填材料调制不当：充填修复材料调制各组分的比例不当，材料被污染、调制时间过长 （3）填充方法不当：未严格隔湿，充填压力不够 （4）过早承担合力：材料未固化完全，过早受力，易折断。 2. 处理：去除充填物修整洞形，重新按照正规操作完成洞的修复。牙隐裂的治疗方法： 1调牙合,排除牙合干扰,减低牙尖斜度以减小劈裂力量 2 均衡全口牙合力负担, 治疗和（或）拔除全口其他患牙,修复缺失牙 3 隐裂牙的处理：隐裂仅达釉牙本质界,着色浅,无继发龋者,酸蚀,釉质粘接剂光固化处理. 有继发龋或裂纹着色深,已达牙本质浅层,中层者,沿裂纹备洞,氢氧化钙糊剂盖髓,氧化锌丁香油粘固剂暂封,2- 4 周后无症状则换光固化复合树脂.已有牙髓病变者,牙髓治疗,调牙合加冠修复. 精品文档 龋病治疗中的常见问题和处理 （一）意外穿髓原因 1.对患牙髓腔解剖知识掌握不足。 2. 操作不仔细。 3.髓角变异。 （二）疼痛1、牙髓性疼痛 ①激发痛冷热痛：钻磨过程产热或酸蚀剂刺激致牙髓充血的表现。咬合痛：可能与过高充填、金属电流作用有关。
牙体牙髓病学练习题及答案 来源：本站原创更新日期：2013年05月17日 1.意外穿髓，穿髓孔直径<0.5mm的恒牙最好选用的治疗方法 A 间接盖髓 B直接盖髓. C安抚治疗 D双层垫底E牙髓失活术 2.温度刺激出现迟缓且不严重的疼痛，表明可能是 A牙髓正常 B.牙髓坏死 C 可复性牙髓炎 D急性牙髓炎 E慢性牙髓炎 3.关于牙本质过敏症不正确的是 A 是一种临床常见症状 B 龋病的常见症状C磨耗的常见症状 D牙折的常见症状 E独立的常见疾病 4.急性牙髓炎最有效的应急处理是 A 局部麻醉 B 开髓引流 C服用止疼药 D消炎止疼药 E针灸镇痛 5.急性不可复性牙髓的疼痛性质中，最具诊断特点的是 A 自发性痛，阵发性加重B冷刺激引起疼痛C热刺激引起疼痛 D疼痛向颌面部放射E持续性胀痛 6.慢性闭锁性牙髓炎的临床表现为，除外 A不定时的自发痛 B热测引起迟缓性疼痛 C 洞内探及穿髓孔 D可有自发性疼痛史 E 叩诊多有不适感 7.意外穿髓临床上常用的盖髓剂是 A氢氧化钙 B抗生素+激素 C玻璃离子黏固粉 D聚羧酸锌黏固剂 E氧化锌丁香油糊剂 8.随着年龄的增大，后牙咬牙合面有磨耗，根尖部牙骨质沉积使牙根增长，若做根管治疗其根管工作长度 A 变长. B 变短 C 没变化 D 因人而异. E 以上都不对 9.年轻恒牙活髓切断术的主要目的为 A保护牙髓活力，牙根继续发育B维持牙列完整行使功能C不刺激根尖周组织 D牙髓活力正常有利于颌骨及颅面的发育E减少患者就诊次数 10.牙髓温度测验的注意事项如下，除外 A先测对侧同名牙 B 隔离唾液C冷测可用小冰棒 D热测可用热牙胶E置于牙齿咬牙合面上
变形杆菌（大肠杆菌）噬菌体生理特性研究 1.变形杆菌、大肠杆菌的纯化 划线分离纯化 2. 变形杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体分离 器材： 菌种：变形杆菌、大肠杆菌 噬菌体样品：阴沟污水（100ml），土壤 培养基：3倍牛肉膏蛋白胨培养液（4瓶，每瓶50ml），牛肉膏培养液，牛肉膏蛋白胨半固体培养基（倒上层用），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒底层用） 仪器：离心机，细菌滤器，抽滤装置，恒温水浴锅，无菌涂布器，无菌吸管等 步骤： a.培养大肠杆菌至对数期600nm（OD值0.8左右） b.增殖噬菌体样品：取上述大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，后加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37℃摇床振荡培养12-14h，以增殖噬菌体。 c.制备裂解液：将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml 滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml 3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养12-18h 进行噬菌体富集。 d.将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10mL加入5mL 3×倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿主菌液1mL，室温下放置1h，37℃ 120rpm振荡培养 3.5h。 e.收集噬菌体：将上述培养液于4℃下12,000g 离心30min，上清液再经微孔滤膜（0.22μm）过滤，滤液即为拟含有相应宿主菌噬菌体的原液。 f.验证噬菌体存在：在大肠杆菌平板上，滴加上述滤液5-7小滴,同时滴加生理盐水作为对照，进行标记，37℃培养18-20h，若出现噬菌斑，则证明滤液中存在噬菌体。 3. 变形杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体纯化 (1)用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1ml大肠杆菌悬液，使混合均匀。 (2）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48℃（可预先溶化、冷却，放48℃水溶箱内备用）,加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2ml，立即混匀，并立即倒人底层培养基上，混匀，置37℃培养12h。 (3）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37℃
成体人牙髓干细胞的分离与鉴定 杨雪超樊明文 武汉大学口腔医学院(430079) email:yangxuecao@https://www.doczj.com/doc/6d8416966.html, 摘要：目地从成人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，研究其生物学性状。方法选取年青患者因正畸拔除的完好牙齿，取出牙髓，采用酶消化及过滤的方法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性,矿化结节形成，牙本质唾蛋白表达，Hoechst33342染色，Oil Red-O 染色，PPARr2基因表达等方面进行检测。结果在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP 活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达牙本质唾蛋白，已向成牙本质细胞方向发生了分化。Hoechst33342染色大部分细胞为阴性。成脂肪诱导后，Oil Red-O染色阳性，检测到PPARr2基因表达。结论从成体人牙髓组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，能够进行分化，为进一步的深入研究奠定了基础。 关键词：成体人牙髓干细胞牙本质唾蛋白成牙本质细胞 1．引言 目前普遍认为，干细胞是具有无限或很强自我更新能力细胞，能分化产生至少一种高度分化的后代细胞。干细胞应具有两个基本性质：（1）自我更新能力，能通过分裂维持自身群体的稳定；（2）分化能力，在一定条件下能分化产生具有特定功能的细胞[1]。干细胞又分为胚胎干细胞和成体干细胞两类，后者是目前研究的新热点。研究表明，皮肤[2]，乳腺[3]，肌肉[4]，甚至神经组织[5]等成熟组织器官中都存在成体干细胞（adult stem cell）。最近，国外学者证实成人牙髓组织中也存在干细胞[6]，国内关于此领域的研究尚刚刚起步，本文是系列研究的第一步，旨在探寻一条分离牙髓干细胞的可靠途径，为更深入的研究奠定基础2．材料和方法 2.1 材料 α-MEM培养基，特极胎牛血清（Hyclone, USA）; collagenase type Ⅰ,dispase(Sigma,USA);ALP检测试剂盒（南京建成）；β-甘油磷酸钠（进口分装）；兔抗人DSP抗体（NIDCR LW.Fisher 博士惠赠）；FITC标记二抗（武汉博士德）；Oil Red-O，IBMX, Hoechst33324(Sigma,USA)；One-Step RT-PCR试剂盒（Promage） 2.2 方法 2.2.1细胞培养和克隆 采用临床19-29岁因正畸或阻生需要拔除的健康第三磨牙，依照文献方法无菌条件下取出完整牙髓[7]。将牙髓剪碎，加入50倍体积的0.2% collagenase typeⅠ及0.2% dispase（体积比1︰1），37℃水浴摇床消化1小时，1000rpm/min离心10分钟，去上清。培养液（含20%胎牛血清）重悬沉淀，用100μm钢网过滤重悬液，获得单细胞悬液。细胞计数板计数 - 1 -
牙痛的诊断和鉴别诊断 牙痛是口腔科最常见的症状。必须详细询问有关病史及做针对性的检查，才能确定牙痛的病因，区分不同类型的牙病或非牙源性疾病所引发的牙痛。 一、病史要点 (一)现病史 1.疼痛的时间起始时间、持续时间、发作间歇时间；有无夜间痛，是否夜间疼痛比白天 2．疼痛的部位是局限的、可定位的，还是放散的或不定位的疼痛。如疼痛是放散的，须明确放散的范围。 3．疼痛的性质是自发痛还是激发痛。如为自发痛，是阵发性还是持续性，或为持续性痛阵发性加重，是锐痛、钝痛、跳痛、酸痛、胀痛还是烧灼样疼痛。 4．疼痛的促发因素牙痛的发作或加重是否与以下因素有关，即温度刺激(冷、热)，化学刺激(酸、甜饮食)，机械刺激(触摸口腔颌面部某一部位，即“扳机点”)，体位及头位的变化，说话、咀嚼、大张口、吞咽动作、气压变化(高空飞行)、精神情绪变化等。 5．近期是否正在接受牙病治疗。 (二)既往史 牙齿邻近组织的病史有无上颌窦炎、化脓性中耳炎、颌骨骨髓炎、颞颌关节痛、颌面部肿瘤。 (三)全身情况 是否接受过头颈部放疗；有无上呼吸道感染、冠心病、高血压、血管神经性头痛症、癔病；是否正处于月经期、更年期。 (一)视诊及探诊 1．疼痛侧上下颌牙齿有无龋坏应仔细检查牙齿的隐蔽部位，如邻面近颈部、与邻牙的重叠或相嵌处、义齿基牙、不良修复体边缘的牙齿、冠套已破损的牙齿。 2．牙有无充填物，充填物边缘与牙体是否密合，有咬殆接触的上下颌牙是否有不同金属的充填物或修复体。 3．牙体缺陷有无牙颈部楔状缺损(wedge—shapeddefect)、重度磨耗(attrition)、牙隐裂(crackedtooth)、畸型中央尖(abnormal central cusp)、牙釉质内陷(dens invaginatus)、牙折(tooth fracture). 4.牙周情况有无牙周袋(Periodontal Pocket)，牙龈乳头有无红肿或坏死，牙周有无红肿面部及口腔内唇颊沟、上腭有无肿胀，张口度是否正常，有无已感染的拔牙创面。 (二)叩诊 垂直及侧向叩击牙齿时，有无不适或疼痛。 (三)咬诊 正中及侧方牙合时，有无早接触或咬牙合疼痛。 (四)牙髓温度测试 牙髓温度测试是对牙髓感觉的测试。以低于10℃为冷刺激，高于60℃为热刺激，牙髓有病变时，对冷、热刺激可表现敏感，但有时可出现假阳性反应，故诊断时只能用做参考。 (五)扪诊 可疑患牙的根尖部有无压痛的肿胀；颞颌关节区有无弹响及压痛；上颌窦前壁有无压痛；
牙体牙髓病学试题(答案) １、影响龋病发生得因素有: A 细菌 B 易感牙面Ｃ食物 D 一定得时间 E 以上因素都有 2。浅龋得最常使用得常规诊断方法就是() A X线片检查B探诊C显微放射摄影法 D氩离子激光照射Ｅ冷热诊 3。隐裂发生最多得牙齿就是() A 前磨牙Ｂ第一磨牙C上颌第一磨牙 D上颌第二磨牙Ｅ下颌第二磨牙 4.Ｘ线检查一般不使用于() A He面龋B深龋C牙折 D慢性根尖周炎E牙髓疼痛 5、最适宜作直接盖髓剂得药物就是() A EOＥＢ氢氧化钙糊剂C 抗菌素糊剂 D抗菌素加激素糊剂E1—2％聚甲醛 6、额外牙最多发生得部位就是() A 下颌两中切牙之间Ｂ上颌两中切牙中间 Ｃ上颌两双尖牙之间D 上颌第二磨牙远中侧 E下颌第三磨牙远中侧 7。急性牙髓炎应急镇痛治疗得最好方法就是() A药物消炎,镇痛 B局部麻醉下开髓引流,辅以药物镇痛 C直接或间接盖髓D拔除牙髓E拔除牙齿 8 、牙髓坏死后牙齿变色得原因() Ａ失去血液供应 B血红蛋白分解产物进入牙本质小管 C脓液进入牙本质小管 D细菌分解产物进入牙本质小管
Ｅ胆固醇结晶进入牙本质小管 9。诊断牙本质过敏症得主要方法为() A问诊Ｂ探诊C摄X线片D 扣诊E望诊 10。恒牙列中患龋得频率最高得就是( ) A下颌第一前磨牙B下颌第二前磨牙 C上颌第一前磨牙D上颌第二前磨牙 E以上都不就是 1１. 临床记录中,舌面为( ) A La ＢL ＣM D D EO 12. 青少年畸形中央尖所致牙髓坏死首先用() A根尖诱导成形术B牙髓塑化治疗 Ｃ拔除Ｄ根管治疗E根管外科 １3. 对于牙本质过敏首选得治疗方法有( ) A药物脱敏B 牙髓治疗C 牙周洁治 Ｄ垫底充填E树脂充填 14 。目前认为菌斑中最主要得致龋菌就是() Ａ乳酸杆菌Ｂ血链球菌C大肠杆菌 D葡萄球菌E变形链球菌 15 釉珠附着在() A根尖牙骨质表面 B 髓腔内壁 C近颈部牙骨质表面Ｄ根管内壁Ｅ牙冠表面 16、畸形中央尖最好发于() Ａ下颌第一磨牙Ｂ下颌第二磨牙 C下颌第三磨牙D下颌第二前磨牙 E下颌第一前磨牙 1７制备倒凹就是为了( ) A 获得良好得抗力形 B 便于垫底 C 便于充填Ｄ获得良好得固位形 E 便于放置盖髓剂、 １8。浅表有隐裂。无明显症状,但牙髓活力正常者。其治疗应首选()