检测项目：氯霉素
检验标准：GB /T 22338-2008
判定标准：农业部235号公告
仪器：AB 4500液质联用仪（编号：JM070，已校准）
Sartorius CP225D电子天平（编号：JM003，已检定）
PB203-N电子天平（编号：JM012 已检定）
实验步骤：
标准品溶液的制备：精密称取氯霉素标准物质（13 99.4% 中检所）
0.01021g，用乙腈溶解并稀释至10mL配成1.015mg/mL的氯霉素标准贮备液。精密量取100 μL氯霉素标准贮备液于100mL容量瓶中，用乙腈稀释刻度，摇匀，配制成1.015μg/mL的氯霉素标准中间液。精密吸取250μL氯霉素标准中间液于5mL 容量瓶中用乙腈稀释至刻度，摇匀配制成50.75ng/mL的标准工作液。
氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作液：精密量取氯霉素-D5标准物质
（Dr.Ehrenstorfer GmbH 3080AC 100ng/μL）1.0mL于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，配成1.0ng/μL的内标贮备液，精密吸取200μL内标储备液，用乙腈定容至10mL，得到20ng/mL内标工作液。标准曲线配制见下表：
样品溶液的制备：
取样品可食部分，搅碎混匀。取混匀的样品W = g (约2g)，置于50mL离心管中，加入氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作液100μL、2g无水硫酸钠和20mL乙酸乙酯，涡旋1分钟，超声20分钟，4000转/分钟离心5min。将上清液移入25mL比色管中，50℃氮气吹干。加入甲醇0.5mL，4%氯化钠溶液4.5mL 溶解残渣，涡旋1min，加正己烷5mL，涡旋1min，离心，弃去上层正己烷，下层清液再加正己烷5mL，涡旋1min，离心后弃去。下层清液中加乙酸乙酯10mL，涡旋1min，离心，取全部上清液于氮吹管中，50℃氮气吹干。精密加流动相1mL，涡旋30s，过0.22μm滤膜，供液相质谱分析。
检测条件:
液相条件：色谱柱：Thermo C18（4.6×100mm，3.5μm）
进样体积：1μL流速：1.0 mL/min 柱温：40℃
停止时间：6min 流动相组成：水:甲醇(10:90)
质谱条件： MRM CUR气帘气：35mL/min ESI(-
) Ionspray voltage喷雾电压：-4500V
Gas temp 离子源温度: 600℃喷雾气Gas1:60 mL/min 辅助气Gas2:70 mL/min 碰撞气：medium
计算：（检出限：0.1μg/Kg）
结果：样品中氯霉素含量为，标准要求。(标准要求应不得检出)
作业指导书 O P E R A T I N G I N S T R U C T I O N S 可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯 霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量 的测定液相色谱-串联质谱法 编号：XZJY086-00-2019 版本：第一版第0次修改 编制：审核：批准： 实施日期：2019.01.01
一、编制目的 为规范可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的检验方法，编制本指导书。 二、适用范围 本指导书适用于可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定。 三、编制依据 GB/T 20756-2006《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定》 四、实验原理 试样中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液旋转蒸干后，残渣用水溶解，经正己烷液液分配。 五、试剂和材料 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为 GB/T6682规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 甲醇：色谱纯。 5.1.2 乙酸乙酯。 5.1.3 正己烷。 5.1.4 氢氧化铵25％~28％。 5.1.5 无水硫酸钠：经650℃灼烧4h，置于干燥器中备用。 5.1.6 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准物质：纯度≥99.5％。
5.1.7 氘代氯霉素内标标准溶液：100μg/mL。 5.1.8 标准储备溶液：100μg/mL。分别准确称取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准物质，用甲醇配成100μg/mL的标准储备溶液于100mL，该溶液于-18℃保存，可使用1年。 5.1.9 混合标准储备溶液：1μg/mL。分别准确吸取1mL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准储备溶液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释成刻度。该溶液于-18℃保存，可使用6个月。 5.1.10 中间浓度混合标准溶液：20ng/mL。准确吸取1mL混合标准储备溶液于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度。该溶液于4℃保存，可使用3个月。 5.1.11 内标标准储备溶液：1μg/mL。准确吸取100μL，氘代氯霉素（D5-氯霉素）标准溶液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液于-18℃保存，可使用6个月。 5.1.12 中间浓度内标溶液：20ng/mL。准确吸取1mL内标标准储备溶液于50mL容量瓶中，用水稀释成刻度。该溶液于4℃保存，可使用3个月。 5.1.13 基质混合标准工作溶液：根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围，吸取一定量的中间浓度混合标准溶液和中间浓度内标溶液，用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液，内标浓度均为0.3ng/mL。当天配制。 5.1.14 滤膜：0.2μm. 5.3 标准品 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准物质：纯度≥99.5％。。 5.4 标准溶液配制
水产品中氯霉素残留检测方法（一） 1 范围本标准规定了水产品中残留量测定的制样和发射受体分析 (Charm II)办法。本标准适用于水产品中氯霉素残留量的筛选测定。 2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后全部的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓舞按照本标准达成协议的各方讨论是否可用法这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682分析试验室用水规格和实验办法 3试样制备和保存 3.1试样的制备从所有样品中取出不少于500 g有代表性试样，用高速组织捣碎机捣碎匀称，将捣碎的样品充分混匀。装入清洁的容器内，加封并做标识。在制样的过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变幻。用于测定的样品细菌数不能超过106/g。 3.2 试样保存将试样于-18℃以下冷冻保存。 4 测定办法 4.1 原理 测定的基础是竞争性受体免疫反应。样品中的氯霉素残留经提取后，与[3H]标志的竞争细菌细胞中的氯霉素特异性受体，样品中的氯霉素药物含量越高，竞争结合的位点越多，[3H]标志的氯霉素结合的位点则越少。在一定温度反应后，离心分别，清除未结合的[3H]标志的氯霉素，加闪耀液后用液体闪耀计数仪测定样品中的[3H]含量cpm值(count per minute，即每分钟脉冲数)。cpm值越低，则样品中的氯霉素残留越高。 4.2 试剂和材料 4.2.1 水 GB/T 6682规定的一级水。 4.2.2 组织中氯霉素检测CharmⅡ试剂盒每批新试剂盒用法前须举行性能监测。 4.2.2.1 竞争性结合试剂：应储藏在-15℃或以下，在室温(15℃～25℃)下最多放置6 h。 4.2.2.2 [3H]标志的氯霉素：应储藏在-15℃或以下，在室温(15℃～25℃)下最多放置6 h。 4.2.2.3 阴性对比浓缩溶液：干粉储藏于2℃～6℃，用法时取浓缩干粉按标签上标志配制成阴性对比浓缩溶液，配制好的溶液可在2℃～6℃冰箱或冰浴中保存48 h；于-15℃以下的冰箱中，则可保存2个月，用法时将其解冻，解冻后的溶液在2℃～6℃冰箱或冰浴中保存24 h。 4.2.2.4 第1页共2页
氯霉素类药残留测定——气相色谱法 (7)气相色谱法(gas chromatography， GC) GC具有高分别效能、高 挑选性、高敏捷度等特点。因为CAPs分子中含有羟基、氯基、亚氨基，分子极性较大，挥发性和热稳定性差，须对它们的极性官能团举行酯化、硅烷化或酰化，生成热稳定和易挥发的衍生物，才干用法GC举行测定。 同时，CAPs 均含有电子亲和性强的化学基团，可以采纳电子捕捉检测器( electron capture detector，ECD) 举行测定。虽然GC办法分析CAPs已经较为成熟，但因为需要衍生化，操作繁琐，因而限制了应用。 1974年在AOAC年会上，提出了当初CAP分析最敏捷的GC办法。用提取动物组织中的CAP，蒸干后加4%溶液，脱脂，过硅藻土(Celite) SPE 柱净化，(TMS)衍生化后用GC-ECD检测。该办法肌肉样品的回收率大于80%，LOD 小于1 μg/kg。周金慧等建立了鸡肌肉和鸡肝脏组织中CAP 残留的GC-微电子捕捉(μECD)检测办法。提取液氮气吹干后，用Sylon BFT [N，O-双 (三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)三甲基氯硅烷(TMCS) (99+1)]衍生化，GC测定，外标法定量。鸡肌肉组织在0.1 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg三个添加水平，平均回收率为90.2%～94.3%，日内CV在4.5%～11.6%之间，日间CV在7.8%～ 14.3%之间，LOD为0.05 ug/kg，LOQ为0.10 μg/kg。鸡肝脏组织在0.2 μg/kg、0.5 μ g/kg、1.0 μg/kg三个添加水平，平均回收率为82.9%～90.8%，日内CV在7.0%～11.2%之间，日间CV在7.9%～14.5%之间，LOD为0.10 ug/kg，LOQ 为0.20 ug/kg。Kubala-Drincic 等建立了动物肌肉中的CAP的GC-ECD检测办法。MSPD 提取液蒸干后用Sylon HTP[-TMCS-吡啶 (3+1+9)]衍生化， GC测定。在5 μg/kg、10 μg/kg、15 ug/kg添 加浓度，平均回收率分离为93%、96%和98%， RSD为13%、11%和3%；LOD和LOQ分离为1.6 ug/kg和4.0 ug/kg。Cerkvenik-Flajs报道了采纳GC-ECD测定肌肉中的CAP残留。办法CCa和CCβ分离为0.07 μ g/kg和0.12 ug/kg，重复性和重临性分离小于8%和9%。宫向红等报 道了用GC检测水产品中的CAP。乙酸乙酯提取试样，加 第1页共2页
动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定引言： 动物源性食品中的药物残留对人类健康构成潜在风险，对动物源性食品中药物残留的 检测已经成为一个重要的研究领域。氯霉素是一类广谱抗菌药物，广泛应用于兽药领域， 但其滥用会造成严重的危害，因此需要建立有效的检测方法，及时监测和控制动物源性食 品中的氯霉素类药物残留。 方法： 1. 样品制备：将动物源性食品中的样品（如肉类、蛋类等）样本研磨成细粉，取适量样品加入盛有甲醇的离心管中，振荡混合，然后离心沉淀，将上清液收集。 2. 氯霉素的萃取：将上清液中的氯霉素通过固相萃取柱进行富集。将固相萃取柱放 入吸液架上，用甲醇预处理固相萃取柱。然后将样品上清液通入固相萃取柱，去除杂质。 再用甲醇洗脱固相萃取柱中的目标物质，收集洗脱液备用。 3. 氯霉素的分离：用高效液相色谱（HPLC）分离洗脱液中的氯霉素。选择适当的色谱柱，设定合适的流动相，控制流速和温度，以分离目标物质。通过检测器检测氯霉素的吸 光度，进行定量分析。 4. 氯霉素的测定：通过比对样品中氯霉素的峰面积与标准品中氯霉素的峰面积，可 以计算出样品中氯霉素的含量。 结果： 分析结果显示，样品中氯霉素的残留量为x mg/kg，符合食品安全标准要求。 讨论： 本研究建立了一种测定动物源性食品中氯霉素类药物残留的方法。该方法准确、简便、可靠，可以满足对动物源性食品中氯霉素残留的监测需求。但是该方法还存在一定的局限性，如需要专业仪器和试剂，操作过程较为繁琐，需要熟练的技术人员进行操作。在今后 的研究中，可以进一步优化该方法，提高检测的灵敏度和准确性，并扩大适用范围，以满 足对动物源性食品中药物残留的监测需求。 结论： 本研究成功建立了一种测定动物源性食品中氯霉素类药物残留的方法，该方法简单易行、准确可靠，并且符合食品安全标准要求。该方法的建立将为动物源性食品中药物残留 的监测提供了技术支持，对保障食品安全具有重要意义。
水产品中氯霉素的检测标准 水产品中氯霉素的检测标准 氯霉素是一种广泛应用于畜禽养殖中的抗生素，也被用于水产养殖中。然而，氯霉素对人体健康有一定的危害，因此被世界卫生组织列为二类致癌物质。为了保障消费者的健康，各国都制定了严格的水产品中氯霉素的检测标准。 我国水产品中氯霉素的检测标准主要包括以下几个方面： 1. 检测方法 目前，我国常用的氯霉素检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、荧光免疫分析法等。这些方法不仅能够快速、准确地检测出氯霉素的含量，而且能够同时检测出多种抗生素残留物质，具有较高的检测灵敏度和准确性。 2. 检测对象 我国水产品中氯霉素的检测对象主要包括鱼类、虾类、贝类等水产动物及其制品。其中，对于进口水产品，我国要求检测对象范围更广，包括所有水产品及其制品。
3. 检测标准 我国对于水产品中氯霉素的检测标准分为限量和禁止两种。其中，限量标准是指在一定重量范围内允许残留的最高含量，而禁止标准则是指在任何情况下都不允许出现氯霉素残留。 目前，我国对于水产品中氯霉素的限量标准如下： 鱼类及其制品：0.3mg/kg 虾类及其制品：0.5mg/kg 贝类及其制品：0.3mg/kg 对于进口水产品，我国要求检测出氯霉素残留物质即视为不合格。 4. 监督管理
为了保障水产品中氯霉素的检测质量，我国建立了完善的监督管理体系。各级食品药品监管部门对于生产、经营、使用水产品的企业进行定期监督检查，并对不合格企业进行处罚。同时，我国还建立了食品安全快速预警机制，一旦发现问题及时采取措施，确保消费者的健康安全。 总之，水产品中氯霉素的检测标准是保障消费者健康安全的重要措施。我们应该加强监督管理，严格执行检测标准，切实保障人民群众的饮食安全。
动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定 随着社会的发展和人们对食品安全的关注度越来越高，动物食品中的药物残留问题成为一个热点话题。氯霉素是一种广谱抗菌药物，常用于动物防治和治疗。长期过量或滥用氯霉素类药物会导致药物残留问题，威胁动物源性食品的安全性。对动物源性食品中氯霉素类药物残留的测定成为科研人员和食品检测部门的重要任务。 氯霉素类药物包括氯霉素、磺胺甲基异噁唑和苯甲酸等，这些药物通过抑制细菌蛋白质合成来达到抗菌效果。为了测定动物源性食品中的氯霉素类药物残留量，研究人员通常采用高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）和质谱法等技术。 首先介绍HPLC法。HPLC是一种高效分离技术，通过控制流动相在色谱柱中流动，实现对不同化合物的分离和定性定量分析。在测定动物源性食品中的氯霉素类药物残留时，可以使用反相色谱柱，并采用紫外检测器进行检测。HPLC法的优点是分离效果好、灵敏度高、定性定量准确，但需要耗费较多的试剂和仪器设备。 质谱法也是测定氯霉素类药物残留的常用方法之一。质谱法是一种结合了质量分析仪器和分析化学的分析技术，可以通过分子离子的质荷比来确定化合物的分子结构和含量。在测定氯霉素类药物残留时，可以采用液质联用技术（LC-MS）和气质联用技术（GC-MS）等。质谱法的优点是分离效果好、灵敏度高、准确性高，但需要较为复杂的仪器设备和数据解析。 总结一下，动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定是食品安全领域的热点问题。目前常用的方法有HPLC法、GC法和质谱法等。这些方法在分离效果、灵敏度和准确性方面各有优势，但也存在一定的局限性。随着科技的不断发展和进步，相信会有更加先进和高效的方法来解决动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定问题，从而保障食品的安全性。
LC-MS/MS法测定鱼肉中氯霉素的残留 朱叶青张晓东王瑞生（内蒙古自治区食品药品检验所呼和浩特010020）摘要：目的：建立动物源性食品氯霉素的残留分析方法。方法：采用乙酸乙酯提取鱼肉中氯霉素的残留，以甲醇-水（70：30）为流动相，流速0.2ml，进样量20μl，经高效液相色谱分离，以多反应监测（MRM）测定。结果：本方法在0.5 -10ng/ml内线性良好（r = 0.9996).）；检出限0.04μg/kg；方法回收率为76.93%，RSD为2.90%。结论：本方法稳定、可靠、准确，可用于动物源性食品中氯霉素的残留分析方法。 关键词：液相色谱-串联质谱鱼肉氯霉素食品安全 Vestigital of chloramphenicol residues in fish by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry zhu yeqing zhang xiaodong（Inner Mongolian Institute for the Control of Drug and Food，Hohhot，010020） Abstract：Aim：To establish a method for determination the chloramphenicol residues in fish .Methods：Ethyl acetate was used for extract chloramphenicol residues in fish. With mobile phase consisting of methanol-water（70：30）and eluted at flow rate of 0.2ml.min-1at 25℃.inject volume 20ul To Separate by HPLC, to analysis with MRM.Results The line ranges for chloramphenicol residues were within 0.5~10μg/L .the limit of detection was 0.04μg/kg.the average recorvery was 76.93%（RSD2.90%）.Conclusion：This method could be used for the determineation of the chloramphenicol residues in beef，and stable、reliable and accurate. Keywords Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，fish，chloramphenicol residues，the safe of foods 氯霉素对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用，且对后者的作用较强。其中对伤寒杆菌、流感杆菌、副流感杆菌和百日咳杆菌的作用比其他抗生素强，对立克次体感染如斑疹伤寒也有效，但对革兰阳性球菌的作用不及青霉素和四环素。氯霉素的主要不良反应是抑制骨髓造血机能。二是不可逆的再生障碍性贫血，虽然少见，但死亡率高。氯霉素也可产生胃肠道反应和二重感染。新生儿与早产儿剂量过大可发生循环衰竭（灰婴综合征）。 2001年初，因为有消费者在食用当地“家乐福”超市出售的冻虾仁引起过敏反应，奥地利“绿色和平”组织紧急对本国商场内所有的水产品进行检测。结果发现德国雷斯蒂克(RISTIC)公司生产的部分虾仁产品含有违禁物质——氯霉素。德国雷斯蒂克(RISTIC)公司决策层立即撤下公司所有在市场上出售的所有冻虾仁产品，连夜查验所有来自中国、印度和越南的进口库存原料。检测结果表明：
HPLC―MSMS同位素内标法检测养殖用水中氯霉素残留量氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种有效的广谱抗菌素，曾广泛的应用于畜牧、水产养殖。但是氯霉素能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血，白血病、过敏性变态反应等严重疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性[1-3]。因此，氯霉素在许多国家被禁止在食品性动物中使用。我国在农业行业标准《无公害食品渔用药物使用准则》（NY5071-2002）和《无公害食品畜禽饲养兽药使用准则》（NY 5030-2006）[4-5]中也已将氯霉素列为禁用药物。但是由于氯霉素具有价廉、高效、用量少的特点，氯霉素仍然存在非法使用和误用的可能。因此有必要建立养殖生产过程中氯霉素的有效检测方法，严控违禁药物的使用，确保养殖生产过程的无害化。 目前氯霉素的检测方法主要集中在动物源性食品的检测[6-8]，因为水体和养殖产品的样品性质、制备以及取样量存在较大差异，所需检测方法也有所不同。本研究建立了养殖用水中氯霉素的高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法，该方法具有快速高效、灵敏度高的优点，可应用于养殖用水中的氯霉素残留监测。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 高效液相色谱（美国Agilent公司，1200系列），三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司，6410系列），漩涡振荡器（德国IKA公司，MS2系列），旋转蒸发仪（德国IKA公司，RV 10 Basic V系列），纯水机（美国Millipore公司，Milli-Q系列）。甲醇（HPLC级）、乙腈（HPLC级），购
于Honeywell公司；氯化钠、乙酸铵均为AR级，购于广州化学试剂厂。标准品氯霉素（CAP）、氘代氯霉素（CAP-d5），购自美国Sigma-Aldrich 公司。 1.2 标准工作曲线配制 准确称取0.0500 g氯霉素标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成1 g/L的标准贮备液。于-20 ℃下保存。实验时，根据需要配成适当浓度的标准工作液，于4 ℃下保存，当天使用。准确称取0.0500 g氘代氯霉素标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成1 g/L的标准贮备液。于-20 ℃下保存。用甲醇稀释至10 mg/L，作为标准内标工作液使用。 1.3 仪器工作参数 （1）色谱条件；Agilent Eclipse C18液相色谱柱（4.6× 50mm，3.5 μm）。流动相：5 mmol/L 乙酸铵：甲醇（4+6）。流速：0.5 mL/min。进样量：10 μL。（2）质谱条件；电喷雾负电离源（ESI-）；离子雾化源温度350℃；气流速10L/min；雾化器压力40 psi；喷雾电压4000V；扫描模式：多重反应监测（Multiple Reaction Monitor，MRM）。优化后的检测条件见表1。 1.4 测定步骤 （1）样品保存与处理；水样经砂芯漏斗过滤除去固体悬浮物，于冰箱4℃下贮存备用。（2）提取；量取100.0mL水样，置于250 mL分液漏斗中，加入50μL标准内标工作液。加入5g氯化钠，振摇；再加入30mL乙酸乙酯，振摇1 min，静置分层，取上层乙酸乙酯于100 mL梨形瓶中。再加入20 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯提取液，于旋转蒸发仪
水产品中药物残留检测技术 近年来，水产品药物残留问题日益严重。生产中私用、滥用违禁药物现象严重，导致水产品药物残留问题突出。因此，应提高相应的检测技术。 1 药物残留的危害 药物残留对人体的危害非常大，会造成人体急性或者慢性中毒。一是突发性中毒。有些药物在水产品中残留量较大，毒性较强。一旦消费者食用有毒水产品，会出现中毒现象，对人体健康产生非常不好的影响，甚至危及消费者的生命。二是累积性中毒。药物在水产品中残留量较少，消费者长期食用，逐渐在人体内累积。当药物积累到一定浓度时，会使人体表现出急慢性中毒症状。许多药物具有致畸、致癌、致突变作用。许多抗菌药物能使某些人群发生过敏反应甚至休克。药物在对人体造成损害的同时也会对环境造成不良影响，一些药物进入动物机体后，随着动物的代谢重新进入环境，对环境造成不良影响[1-2]。 2 药物残留检测方法 2.1 气相色谱法 气相色谱法（GS）是以惰性气体为流动相的柱色谱法，是一种物理化学分离方法。其基本原理是混合物样品中各组份在色谱柱中的气相和固定相间的分配系数不同，当气化后的样品被载气带入色谱柱中运行时，组分就在两相间进行了反复多次的分配（吸附-脱附），由于固定相对各组分的吸附能力不同，各组分在色谱柱中进行的速度就不同，经过一定的柱长后，即得到了分离。气相色谱具有高效、快速、高灵敏度、样品用量少等优点。目前，水产品中氯霉素和五氯酚钠的检测主要采用气相色谱法[3-4]。 2.2 高效液相色谱法 高效液相色谱法（HPLC）是以高压液体为流动相的色谱法，是用
高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。该方法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，其已成为药残检测最常用的分析方法。目前水产品中孔雀石绿、结晶紫、甲基睾酮、喹乙醇、磺胺类的药物残留检测主要采用高效液相色谱法。 2.3 液相色谱串联质谱法 液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）是以质谱仪为检测手段，集HPLC高分离能力与MS高灵敏度和高选择性于一体的强有力分离分析方法。液质联用技术的主要特点是：一是能够对多种化合物进行分离，尤其是对热不稳定化合物，分离效果也较好，解决了常见的热不稳定化合物难分离的问题。二是分离能力强，在色谱上没有完全进行分离的混合物，可以后续通过MS的特征离子质量色谱图来进行定性定量。三是能够得到较可靠的分析结果。四是具有较低的检测限。五是分析的耗时较短。六是自动化程度较高。 2.4 免疫分析技术 免疫分析法的原理是抗原抗体特异性结合反应，检测的对象主要有微生物、激素、蛋白质、药物等。目前常用的方法是酶联免疫法（ELISA），该方法具有灵敏度高、成本低、可操作性强等优点。该方法的使用是建立在以下几个原理之上：一是抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；二是抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；三是酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此可以按底物显色的程度显示试验结果。目前水产品中己烯雌酚的残留检测主要采用免疫分析技术[5-7]。
可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定——适用范围和方法原理 4.2.2.1适用范围适用于可食动物肌肉、肝脏、鱼和虾中氯霉素、和 残留量的液相色谱-串联质谱测定。办法检出限：为0.1ug/kg、甲砜霉素和氟苯尼考为1.0ug/kg。 4.2.2.2办法原理试样中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留以碱性提取，提取液旋转蒸发挥干，残渣以水溶解，经液液分配脱脂后供高效液相色谱-串联质谱仪分析，内标法峰面积定量。 4.2.2.3 试剂和材料甲醇、乙酸乙酯、正已烷为色谱级；氨水(25%)；无水硫酸钠：650℃灼烧4h，冷却后储于密封容器中备用； 标准品氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素，纯度≥99.5%；氯霉素-D5，纯度≥98%。标准贮备液：精确称取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质，用甲醇配成100μg/mL的标准储备液，该溶液于-18℃下保存期一年；混合标准储备液：精确吸取一定量标准储备液于50.0mL容量瓶中，用水稀释至刻度，1mL该溶液分离含20ng的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素，该溶液于4℃下保存期三个月。内标标准储备液1：精确吸取100μL氯霉素-D5标准液于10.0mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，该溶液于4℃保存。保存期半年；内标标准储备液2：精确吸取1.00mL内标标准储备液于50.0mL容量瓶中，用水稀释至刻度。该溶液于4℃保存。保存期三个月。混合标准工作溶液：按照每种标准的敏捷度和仪器线性范围，临用时吸取一定量的混合标准储备液和内标标准储备液，用水配成适当浓度的混合标准工作液。 4.2.2.4仪器和设备液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源；分析天平：感量0.1mg和0.01g；离心机：4000r/min；高速台式离心机：13000r/min；组织捣碎机；匀质器；转蒸发器；超声波；液体混匀器；聚丙烯离心管：50mL，1.5mL，具塞；鸡心瓶：25mL；比色管：50mL，具塞。 4.2.2.5样品前处理 (1)试样制备取样品约500g用肉类组织捣碎机绞碎，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标志。将试样于-18℃冰箱中保存。 (2)提取称取5g试 第1页共2页
1 绪论 1.1 引言 随着社会经济的快速发展和人民生活水平的提高，动物源性食品在人们生活中所占比例越来越大，部分不法养殖户为追求经济效益最大化，不同程度的在饲料中添喂人用抗生素，使畜禽肉品中抗生素残留严重，成为的食品安全的重要问题之一。各国政府严格限制食品中各种有害成分，特别是抗生素、农药残留等。 食品安全检测是保障食品安全的基础，是监督管理的重要手段。为了有效地保障食品安全，就必须对食品安全中的各类样品进行准确地分析测定。目前食品安全检验部门通常采用气相色谱、液相色谱等分析仪器。然而使用这些仪器进行分析测定前，必须把样品制成溶液。 由于食品样品具有被测物浓度低、组分复杂、干扰物质多、易受环境影响而变化等特点，因此要获得数据准确、重现性好的分析结果，样品预处理是重要环节。样品预处理已成为分析化学领域中一个重要的分支，传统的样品预处理方法有液-液萃取、索氏提取、层析、蒸馏、吸附、离心、过滤等几十种。这些方法一般要使用大量的有机溶剂，而且处理时间长、操作步骤复杂，容易导致样品损失和玷污，产生较大误差。因此，迫切需要探索高准确度、快速、简单、不使用或少使用有机溶剂的样品预处理方法，发展较快的有固相萃取、固相微萃取等。 固相萃取技术以其高效性、高选择性、高自动化程度以及低耗性等特点被广泛地应用在生物医学、食品分析、环境分析等领域[1]，其关键是优良的固相萃取材料的制备。因此制备选择性高的固相萃取材料已为研究的热点。 1.2 氯霉素样品预处理及检测方法 1.2.1 氯霉素类抗生素来源及危害 我国是一个养殖大国，近年来养殖业飞速发展。由于集约化的高密度养殖、珍贵品种引进、使用催生长激素、环境污染等因素导致了养殖环境的恶化和畜禽疾病增加，又由于畜禽疾病防治体系的不健全和欠缺用药指导和规范管理，在养
利用酶联免疫法检测水产品中氯霉素残留的结果分析 作者：刘万学 来源：《黑龙江水产》 2015年第5期 刘万学 （黑龙江省水产技术推广总站黑龙江哈尔滨 150018） 随着水产养殖业的快速发展，人们对水产品质量安全日益关注。滥用抗生素、激素等药物 防治水产动物疾病，导致水产品的质量下降，使用禁用渔药而导致水产品药物残留超标。国家 投入大量的人力物力对食品安全进行监督抽查，确保餐桌上的安全。氯霉素就是水产品质量安 全监督抽查中的重要一项抗生素。 氯霉素最初是由委内瑞拉链丝菌（Streptomyces Venezuela）的培养液中提取制得，是一 种常用的广谱抗生素，曾在畜牧业中广为应用，治疗畜禽肠道感染有特效，至今已有50年的使用历史。但氯霉素有较强的副作用和毒性作用，如果氯霉素在食用动物中残留，可通过食物链 传给人类。长期微量摄入氯霉素会引起多种疾病，氯霉素抑制骨髓造血功能造成过敏反应，对 人体的造血系统危害很大，容易引起再生障碍性贫血。此外该药还可引起肠道菌群失调及抑制 抗体的形成，还会引起视神经炎、皮疹等不良反应，对人类的健康造成危害。氯霉素已在国外 较多国家禁用，是禁用抗生素。世界上许多国家禁止此药用于生产食品动物，并规定了在畜产 品中氯霉素不得检出。中国农业部已将氯霉素从2000年版《中国兽药典》中删除并将其列为禁药。而欧盟的进口食品卫生标准规定氯霉素含量标准为不得检出。 目前的氯霉素的检测方法是依据《水产品中氯霉素残留量的测定气相色谱法》使用气相色 谱仪进行检测，其检测结果可靠，但是分析速度较慢。因此，大都先使用酶联免疫法进行筛选，筛选结果为阳性的样品再使用气相色谱法进行确定。酶联免疫法具有灵敏度高、特异性强、高 通量、成本低等优点，因而适合于水产品中氯霉素日常检测。但是在使用过程中，由于使用不 同厂家的试剂盒和其精密度和灵敏度不同，而检测出的阳性结果比率不同，阳性结果过多，这 样需要经过气相色谱法进行确定，最终确定为假阳性。针对假阳性比率偏高采用两个不同厂家 的试剂盒（一个是进口的，一个是国产的）做了个比对试验： 1、检测材料：采自省内四市二县的农贸市场和超市的50个水产品样品。 2、检测方法：酶联免疫法（ELISA），阳性结果的样品由气相色谱法确定。 3、使用仪器：酶标仪、组织捣碎机、旋涡混合器、离心机、氮吹仪、均质机、电子天平、单道可调微量移液器、8道可调微量移液器。 4、试剂：氯霉素试剂盒、乙酸乙酯、正己烷。 5、检测样品前处理过程：（1）将待测样品的不可食部分去除，剩余可食部分从不同部位 挑选约400g用组织捣碎机捣碎，然后用均质机进一步捣碎均质,取大约3g左右放入50mL离心 管中，加入6mL乙酸乙酯,混合均匀后放入离心机中离心。（2）取离心好的样品上清液4mL放 入10mL的离心管中氮气吹干，同时取4mL乙酸乙酯放入10mL的离心管中氮气吹干做空白对照。（3）在吹干好的样品中加入1mL正己烷、1mL缓冲溶液、充分振荡混匀离心后取上层分析。
水产品中氯霉素类药物残留检测的衍生化条件 作者：綦天华，张慧峰，杨扬，修磊，杨春桥，韩立中 来源：《河北渔业》 2016年第2期 DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2016.02.009 綦天华，张慧峰，杨扬，修磊，杨春桥，韩立中 （吉林省长春市水产品质量安全检测中心，吉林长春130000） 氯霉素是一类具有广谱抗菌作用的抗生素类药物，应用在水产上可防治烂鳃和赤皮病等， 但其对人类有很大的毒害作用，且代谢较慢，不易排出体外，目前被很多国家禁用，该药残留 为我国申报无公害产品或进出口时的必检项目，对于该药的残留目前主要通过气相色谱法完成。但该法衍生化过程复杂，且可导致回收率偏低的因素较多。本文就衍生化中影响回收率的三个 重要影响因素进行了系统分析，通过正交试验法对其残留量的衍生化条件进行了优化，得到了 氯霉素残留量衍生化的最优条件。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1主要仪器与设备气相色谱仪 Agilent 6890N（配63Ni电子捕获检测器）；旋转蒸发 仪 BUCHI R-215；离心机上海安亭TDL-40B；漩涡混合器德国IKA MS3 DS25；氮吹仪航川奥盛 KD200。 1.1.2试剂与药品氯霉素标准品含量99.5%(Sigma C-0378)；乙酸乙酯(色谱纯) ；甲醇(色谱纯) ；氯化钠(分析纯) ；正己烷(色谱纯) ；三氯甲烷(色谱纯) ；乙腈(色谱纯) ；硅烷化试剂:BSTFA + T CMS (99∶1) (美国Supelco 公司) ；固相萃取小柱(SPE) : ENVI-18 (3 mL ，美国Supelco 公司)。 1.1.3样品及其制备用于实验的材料为淡水鲫鱼，去鳞、皮，沿背脊取肌肉；样品切为不 大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后混匀，放置冰箱中冷冻贮存备用。 1.2方法 1.2.1标准溶液的制备取氯霉素标准品0�025 g，甲醇定容到50 mL，浓度为500 μg/mL，4 ℃冰箱中保存待用。临用前取该贮备液，稀释为0.100 μg/mL的标准工作液。 1.2.2工作曲线的制备取标准工作液，用甲醇稀释，制备成浓度为0.1、0.5、20、50、100、200、500 μg/mL的标准使用液，分别置于5 mL玻璃离心管中，50 ℃干热尽干，加入100 μL 衍生化试剂，70 ℃恒温加热30 min，用氮气吹干多余试剂，用0.5 mL正己烷溶解待用。测定 峰高的响应值，以峰高值对质量浓度做工作曲线。 1.2.3色谱条件色谱柱：DB-5石英毛细管柱，固定相：SE-54(聚甲基苯基乙烯基硅氧烷），30 m×0.53 mm×0.5 μm。载气：氮气，线速度29 cm/s，进样口温度：260 ℃。温度程序： 初始柱温150 ℃，维持1 min，15 ℃/min升至260 ℃，维持10 min，然后设定30 ℃/min升
检测项目：氯霉素 检验标准：GB /T 22338-2008 判定标准：农业部235号公告 仪器：AB 4500液质联用仪（编号：JM070，已校准） Sartorius CP225D电子天平（编号：JM003，已检定） PB203-N电子天平（编号：JM012 已检定） 实验步骤： 标准品溶液的制备：精密称取氯霉素标准物质（13 99.4% 中检所） 0.01021g，用乙腈溶解并稀释至10mL配成1.015mg/mL的氯霉素标准贮备液。精密量取100 μL氯霉素标准贮备液于100mL容量瓶中，用乙腈稀释刻度，摇匀，配制成1.015μg/mL的氯霉素标准中间液。精密吸取250μL氯霉素标准中间液于5mL 容量瓶中用乙腈稀释至刻度，摇匀配制成50.75ng/mL的标准工作液。 氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作液：精密量取氯霉素-D5标准物质 （Dr.Ehrenstorfer GmbH 3080AC 100ng/μL）1.0mL于100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，配成1.0ng/μL的内标贮备液，精密吸取200μL内标储备液，用乙腈定容至10mL，得到20ng/mL内标工作液。标准曲线配制见下表：
样品溶液的制备： 取样品可食部分，搅碎混匀。取混匀的样品W = g (约2g)，置于50mL离心管中，加入氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作液100μL、2g无水硫酸钠和20mL乙酸乙酯，涡旋1分钟，超声20分钟，4000转/分钟离心5min。将上清液移入25mL比色管中，50℃氮气吹干。加入甲醇0.5mL，4%氯化钠溶液4.5mL 溶解残渣，涡旋1min，加正己烷5mL，涡旋1min，离心，弃去上层正己烷，下层清液再加正己烷5mL，涡旋1min，离心后弃去。下层清液中加乙酸乙酯10mL，涡旋1min，离心，取全部上清液于氮吹管中，50℃氮气吹干。精密加流动相1mL，涡旋30s，过0.22μm滤膜，供液相质谱分析。 检测条件: 液相条件：色谱柱：Thermo C18（4.6×100mm，3.5μm） 进样体积：1μL流速：1.0 mL/min 柱温：40℃ 停止时间：6min 流动相组成：水:甲醇(10:90) 质谱条件： MRM CUR气帘气：35mL/min ESI(- ) Ionspray voltage喷雾电压：-4500V Gas temp 离子源温度: 600℃喷雾气Gas1:60 mL/min 辅助气Gas2:70 mL/min 碰撞气：medium