分析测试经验介绍 (203 ~ 208)激光共聚焦显微镜测量表面粗糙度的探究廖奕鸥,冯 辉,张重远(中国科学院 金属研究所 分析测试中心,辽宁 沈阳 110016)摘要:介绍了利用激光共聚焦显微镜对不同粗糙度标准样块表面进行粗糙度测量时,各试验参数对测量结果的影响. 对于标准样块,测得的面粗糙度(S a )符合测量要求(示值误差≤5%),最终确定合理的试验参数. 方法不但具有非接触、高分辨率、测量速度快的特点,同时可以获得被测表面的三维形貌,可以更加直观的对表面进行评价,使激光共聚焦显微镜能够更好的应用于工业材料表面轮廓分析领域.关键词:激光共聚焦显微镜;非接触;三维形貌;面粗糙度中图分类号:O65 文献标志码:B 文章编号:1006-3757(2023)02-0203-06DOI :10.16495/j.1006-3757.2023.02.010Research on Measuring Surface Roughness with Laser Confocal MicroscopeLIAO Yiou , FENG Hui , ZHANG Zhongyuan(Analysis and Testing Center , Institute of Metal Research , Chinese Academy ofSciences , Shenyang 110016, China )Abstract :The effect of experimental parameters on the measurement results, using a laser confocal microscope for the roughness measurement on the surface of different roughness standard sample blocks, was introduced. For the standard sample block, the measured surface roughness S a met the measurement requirements (indication error ≤5%), and the reasonable experimental parameters were finally determined. The method not only has the characteristics of non -contact,high resolution and fast measurement speed, but also can obtain the three-dimensional topography of the measured surface, which can more intuitive to evaluate the surface, so that the laser confocal microscope can be applied more favorably in the field of industrial materials profile analysis.Key words :laser confocal microscope ;non -contact ;three-dimensional topography ;surface roughness激光扫描共聚焦显微镜是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一[1],其在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置,使用紫外光或可见光激光荧光探针,利用计算机进行图像处理[2]. 激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究,在形态学、生理学[3]、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用[4].随着科学技术的快速发展,激光共聚焦扫描显微技术凭借它的特有优势成为一种高分辨率的显微成像技术[5],但在工业材料领域的应用鲜有报道.工业用激光共聚焦显微镜的工作原理[6](如图1所示)是采用点光源照射样本,在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点. 该点被照射后发出的反射光被物镜搜集,并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器. 分光器将光直接送到探测器[7]. 光源和探测器前方都各有一个针孔,分别称为照明针孔和探测针孔. 照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔,焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像,这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面,避免了非焦平面上杂散光线的干扰,克服了普通显微镜图像模糊的缺点[8],把样本分为若干光学断层,逐层扫描成像,层与层之间有较高的纵深分辨率,因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像.收稿日期:2023−03−13; 修订日期:2023−05−12.作者简介:廖奕鸥(1994−),女,本科,主要从事材料表面形貌分析工作,E-mail :.第 29 卷第 2 期分析测试技术与仪器Volume 29 Number 22023年6月ANALYSIS AND TESTING TECHNOLOGY AND INSTRUMENTS June 2023detectorconfocal pinholelaserscannerobjective lensscanning volumefocal plane图1 激光共聚焦显微镜工作原理Fig. 1 Working principle of laser confocal microscope近几年材料表面粗糙度越来越受到重视,科研人员研究了其表面微观形貌的参数. 传统用于表征物体表面二维轮廓的粗糙程度参数R a(线粗糙度)[9]是在一定测量长度l范围内,轮廓上各点至中线距离绝对值的算数平均值. 计算公式如式(1):其中:l为测量长度,y为各点至中线距离绝对值,x 为测量距离.而用于表征物体表面三维形貌的粗糙程度S a[10](面粗糙度)则是基于区域形貌粗糙度的评定参数,表示相对于表面的平均面,各点高度差的绝对值的平均值. 计算公式如(2)(3):其中:µ是平均高度参数,M为测量长度,N为测量高度,k为测量长度M上的点,l为测量高度N上的点,z为物体表面区域轮廓上点到基准面的距离. 它表示区域形貌的算数平均偏差. 利用工业激光共聚焦显微镜对材料表面信息进行采集,获得结构清晰地材料表面三维轮廓图像,通过软件对图像进行处理,可以计算出材料粗糙度(S a或R a).随着科学技术的快速发展,金属材料表面结构的加工精度越来越高,因此对表面粗糙度测量方法的要求也随之提高. 对于一些软质材料,传统触针式测量不但可能会在测量过程中破坏试样表面结构,影响其金属表面粗糙度结果,而且无法展现材料表面的真实形貌. 现阶段测量要求对材料无损伤产生,同时可以观察材料表面的三维立体形貌,检测速度快、精度高. 非接触式测量方法在现代测量的发展过程中应运而生,成为了获取材料表面微观形貌特征的一种重要检测方法. 利用工业激光共聚焦显微镜对材料表面进行粗糙度测量则是非接触式测量方法之一,其具有测量范围广、分辨率高、速度快等特点. 同时可以获得被测表面的三维形貌图[11],可以更加直观的对表面进行评价.本文利用激光共聚焦显微镜对6种不同粗糙度的标准样块进行粗糙度测量,讨论了试验过程中各参数[12]对测量结果的影响.1 试验部分1.1 样品试验使用6种不同粗糙度的多刻线样板(购于辽宁北方计量器材有限公司),经专业机构校准后作为待测样品,如图2所示.(a)(b)(c)(d)(e)(f)图2 6种不同粗糙度的标准样块(a) 编号120028,(b) 编号120054,(c) 编号112494,(d) 编号112454,(e) 编号110768,(f) 编号112421 Fig. 2 Surface macromorphology of six standard sampleblocks with different roughness(a) No.120028, (b) No.120054, (c) No.112494, (d) No.112445,(e) No.110768, (f) No.1124211.2 标准样块微观形貌二维曲线图利用接触式表面轮廓仪获得标准样块(编号为112454)的二维曲线图,如图3所示.1.3 仪器和测试条件德国蔡司公司生产的LSM700激光共聚焦显微镜[13],405 nm固体激光控制器,选用5X、10X、20X、50X、100X物镜进行测试.204分析测试技术与仪器第 29 卷2 结果与讨论2.1 物镜选择将已经校准的6种不同粗糙度的标准样块作为待测样品,分别使用5X 、10X 、20X 、50X 、100X 物镜进行测量. 测量S a 结果如表1所列.由于试验选择的样品为标准样块,其粗糙度范围在0.096~3.072 µm 范围内. 考虑到不同物镜的工作距离及分辨率对应的粗糙度值测量精度有一定的范围,采用不同倍率的物镜进行单个视场扫描并测量,得到粗糙度值如表1所列. 与校准值进行比较发现,在利用激光共聚焦显微镜进行粗糙度测量时,其测量结果准确与否与物镜选择息息相关. 放大倍数越大,物镜景深则越小,需要Z 方向逐层扫描精度也就越高. 因此不同粗糙度样品应采用不同放大倍数进行测量. 针对本试验中样品类型,粗糙度在0.1~0.4 µm 的样品,由于粗糙度较小应选择较高放大倍数50X 物镜进行测量,粗糙度在0.4~3.2 µm 样品应选择放大倍数20X 物镜进行测量.2.2 扫描步长参数在已确定的物镜倍率下,为了更好的确定步进参数对测量结果的影响,分别对粗糙度较小(编号为120028、120054、112494)及粗糙度较大(编号为112454、110768、112421)的标准样块进行试验,S a 结果如表2、3所列.比较表2、3数据发现,由于标准样块形貌属于表 1 6种不同粗糙度的标准样块在不同物镜下测量S a 值Table 1 Measured S a values of six standard sample blocks with different roughness under different objective lenses/µm 物镜大小标准样块编号1200281200541124941124541107681124215X (29.3) 1.879 2.951 2.488 1.862 3.89811.22910X (30.1)0.5270.6560.864 1.783 1.924 4.09820X (30.1)0.1740.3210.5440.836 1.442 2.96850X (46.6)0.1080.2150.4220.7150.909 2.470100X (83.6)0.0620.1290.2300.3240.581 1.495校准值0.0960.2140.4400.8541.4653.072表 2 50X 物镜下3种不同粗糙度的标准样块不同步进参数下测量S a 值Table 2 Measured S a values of three standard sample blocks with different roughness using asynchronous advancingparameters under 50X objective lensNo. 120028No. 120054No. 112494步长 /µm S a/µm 扫描时间/s 步长 /µm S a/µm 扫描时间/s 步长/µm S a/µm 扫描时间/s0.1000.1103710.2000.2152450.5000.422380.0500.1087330.1000.2155200.2000.4221030.0200.111 1 7420.0500.216 1 0130.1000.4262000.0100.1252 5150.0200.2182 3980.0500.427405注:图像扫描像素为512×512,扫描范围为120 µm×120 µm表 3 20X 物镜下3种不同粗糙度的标准样块不同步进参数下测量S a 值Table 3 Measured S a values of three standard sample blocks with different roughness using asynchronous advancingparameters under 20X objective lensNo.112454No.110768No.112421步长/µm S a/µm 扫描时间/s步长/µm S a/µm 扫描时间/s 步长/µm S a/µm 扫描时间/s1.0000.82851 1.500 1.44755 3.0002. 872280.5000.836103 1.000 1.44275 1.500 2.968590.2000.8392540.500 1.440149 1.000 2.962780.1000.8415100.2001.450408″0.5002. 964212注:图像扫描像素为512×512,扫描范围为300 µm×300 µm0.51.01.52.0 2.53.03.54.0−1.01.0H e i g h t /μmLength/mm图3 标准样块(编号为112454)的二维曲线图Fig. 3 2D curve of standard sample block (No. 112454)第 2 期廖奕鸥,等:激光共聚焦显微镜测量表面粗糙度的探究205均匀台阶,且台阶较为平坦. 在固定物镜下,利用激光共聚焦显微镜进行粗糙度的测量时,扫描步长参数设置对标准样块粗糙度值影响不大. 但由于激光共聚焦显微镜的工作原理是逐层扫描成像,因此扫描步长参数设置影响着扫描速率及扫描时间. 当扫描步长参数设置越小时,扫描的层数越多,而激光共聚焦显微镜扫描的层与层之间具有较高的纵深分辨率,所以扫描时间就会越长. 因此为了综合测量结果和测量效率,测量过程中应合理选择扫描步长参数.2.3 三维形貌选择合适物镜,设定合理扫描步长参数的条件下,获得标准样块的三维形貌图如图4所示. 由图4可以看出真实的表面形貌.9.0 μm6.0 μm 3.0 μm 0 μmZ /μm1.3020406080100120120100806040200X /μmY /μm 2.0 μm1.4 μm 0.8 μm 0.4 μm 0 μmZ /μm6.002040608010012012010080604020X /μmY /μm 2.0 μm 1.4 μm 0.4 μm 0 μmZ /μm7020*********120120100806040200X /μmY /μm 25.0 μm 15.0 μm 5.0 μm 0 μmZ /μm11050100150200250300300250200150100500X /μmY /μm0 μm2.0 μm 4.0 μm 6.0 μm 8.0 μm 10.0 μm Z /μm18050100150200250300300250200150100500X /μmY /μm0 μm4.0 μm 8.0 μm 12.0 μm 16.0 μm 20.0 μm Z /μm40050100150200250300300250200150100500X /μmY/μm (a)(b)(c)(d)(e)(f)图4 6种标准样块三维形貌(a )编号120028,(b )编号120054,(c )编号112494,(d )编号112454,(e )编号110768,(f )编号112421Fig. 4 Three dimensional morphology of six standard sample blocks(a) No.120028, (b) No.120054, (c) No.112494, (d) No.112454, (e) No.110768, (f) No.112421206分析测试技术与仪器第 29 卷2.4 重复性在已确定的试验参数下,对编号112454的标准样块重复测试10次,结果如表4所列.由表4可以看出,标样重复测量10次的相对标准偏差(RSD )均小于5%,重复性良好.表 4 编号112454标准样块重复性试验测量S a 值Table 4 Repeatability test measurement S a value ofstandard sample block No.112454测试次数/次S a/µm RSD/%10.836−0.11920.834−0.35830.8390.23940.836−0.11950.835−0.23960.8400.35870.8410.47880.836−0.11990.8390.239100.834−0.358平均值0.8370.000 23 结论利用激光共聚焦显微镜进行粗糙度测量时,应选择合适的放大倍数和扫描步长参数. 针对本试验中多刻度线样板样品,粗糙度在0.1~0.4 µm 的样品应选择放大倍数50X 物镜进行测量,粗糙度在0.4~3.2 µm 样品应选择放大倍数20X 物镜进行测量. 而扫描步长参数的设置影响测量时间,为了综合测量结果和效率,测量过程中应合理选择扫描步长参数. 利用激光共聚焦显微镜测量材料表面轮廓不但具有非接触、高分辨率、测量速度快的特点,并且在获得相关轮廓参数的同时可以获得被测表面的三维形貌. 本试验对于测量未知样品提供了参考依据,可以更加直观的对材料表面轮廓进行评价.参考文献:孙学俊, 闫喜中, 郝赤. 激光共聚焦扫描显微镜技术简介及其应用[J ]. 山西农业大学学报(自然科学版),2016,36(1):1-9, 14. [SUN Xuejun, YAN Xizhong, HAO Chi. Confocal laser scanning micro-scopy, a general guideline and its applications [J ].[ 1 ]Journal of Shanxi Agricultural University (Natural Sci-ence Edition),2016,36 (1):1-9, 14.]杨子贤, 王洪星, 易小平. 激光扫描共聚焦显微镜在生物科学研究中的应用[J ]. 热带生物学报,2013,4(1):99-104. [YANG Zixian, WANG Hongxing, YI Xiaoping. Future prospects of laser scanning confocal microscope in bioscience [J ]. Journal of South China University of Tropical Agriculture ,2013,4 (1):99-104.][ 2 ]李玲, 马华玲, 张文娟. 激光共聚焦显微镜在肿瘤研究方面的应用[J ]. 医学信息,2014,27(34):390. [LI Ling, MA Hualing, ZHANG Wenjuan. Application of laser confocal microscope in tumor research [J ]. Journ-al of Medical Information ,2014,27 (34):390.][ 3 ]朱珊珊, 黄志江. 激光扫描共聚焦显微镜在生命科学研究中的应用[J ]. 国外医学(麻醉学与复苏分册),2005(2):118-119. [ZHU Shanshan, HUANG Zhiji-ang. Applying laser scanning confocal microscopy in-to life science reseach [J ]. Foreign Medicine:Interna-tional Journal of Anesthesiology and Resuscitation ,2005 (2):118-119.][ 4 ]陈晨, 陆乃彦, 范大明, 等. 激光共聚焦扫描显微镜技术在不同食品体系中的应用研究[J ]. 食品安全质量检测学报,2018,9(17):4581-4586. [CHEN Chen,LU Naiyan, FAN Daming, et al. Application of con-focal laser scanning microscope in food system [J ].Journal of Food Safety & Quality ,2018,9 (17):4581-4586.][ 5 ]黄晓敏, 王飞. 激光扫描共聚焦显微镜在电子材料研制中的应用[J ]. 电子元件与材料,2014,33(4):87-88. [HUANG Xiaomin, WANG Fei. Application of laser scanning confocal microscope in the develop-ment of electronic materials [J ]. Electronic Compon-ents & Materials ,2014,33 (4):87-88.][ 6 ]涂真珍, 王韦刚. 激光扫描共聚焦显微镜在光电材料中的应用[J ]. 广州化学,2019,44(5):66-71. [TU Zhenzhen, WANG Weigang. Application of laser scanning confocal microscope on opto-electronic materials science [J ]. Guangzhou Chemistry ,2019,44(5):66-71.][ 7 ]刘东武, 牟洪善. 激光扫描共聚焦显微镜技术在材料学研究中的应用[J ]. 生命科学仪器,2006,4(5):11-14. [LIU Dongwu, MOU Hongshan. Application of laser scanning confocal microscopy on materials [J ].Life Science Instruments ,2006,4 (5):11-14.][ 8 ]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 产品几何技术规范(GPS)[ 9 ]第 2 期廖奕鸥,等:激光共聚焦显微镜测量表面粗糙度的探究207表面结构轮廓法术语、定义及表面结构参数:GB/T 3505—2009[S]. 2010.Geometrical product specifications (GPS)-Surface tex-ture: Areal Part 2: Terms, definitions and surface tex-ture parameters: SO. ISO 25178-2 [S]. 2012.[ 10 ]孙大乐, 吴琼, 刘常升, 等. 激光共聚焦显微镜在磨损表面粗糙度表征中的应用[J]. 中国激光,2008,35(9):1409-1414. [SUN Dale, WU Qiong, LIUChangsheng, et al. Application of laser scanning con-focal microscopy in roughness characterization ofworn surface[J]. Chinese Journal of Lasers,2008,35(9):1409-1414.][ 11 ]尹立新, 刘卫平, 鞠新华, 等. 一种用激光扫描共聚焦[ 12 ]显微镜测量表面粗糙度的方法: CN102927933A[P].2013-02-13. [YIN Lixin, LIU Weiping, JU Xinhua, et al. Method of measuring surface roughness byusing confocal laser scanning microscope:CN102927933A[P]. 2013-02-13.]段妍, 关苑君, 蓝秀健, 等. Zeiss LSM710激光扫描共聚焦显微镜的使用和管理[J]. 实验室研究与探索,2012,31(8):239-241. [DUAN Yan, GUAN Yuanjun, LAN Xiu jian, et al. Use and management of laserscanning confocal microscopy Zeiss LSM 710[J]. Re-search and Exploration in Laboratory,2012,31 (8):239-241.][ 13 ]声明本刊许可中国学术期刊(光盘版)等数字化传播的声明 本刊已许可中国学术期刊(光盘版)、超星全文“域出版”期刊、《中文科技期刊数据库》、《中国终身教育学术研究数据库》、《中国科研仪器案例成果数据库》和《万方数据-数字化期刊群》在其系列数据库产品中以数字化方式复制、汇编、发行、信息网络传播本刊全文. 该社著作权使用费与本刊稿酬一并支付. 作者向本刊提交文章发表的行为即视为同意我社上述声明. 《分析测试技术与仪器》编辑部208分析测试技术与仪器第 29 卷。