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荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。
本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。
使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。
小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。
我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。
最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。
不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。
因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。
在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。
使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。
使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapidphotoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。
与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。
本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。
荧光蛋白标记法
荧光蛋白标记法是一种利用荧光蛋白进行标记的技术，常用于生物学和医学领域的研究。
其基本原理是利用荧光蛋白（如绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白）与目标蛋白质融合，使目标蛋白质具有荧光标记，从而可以方便地对其进行观察和追踪。
荧光蛋白标记法具有操作简便、灵敏度高、对细胞或组织损伤小等优点。
它可以用于研究细胞内蛋白质的定位、分布、运动及相互作用等情况，对于研究细胞生物学、分子生物学、药物研发等领域具有重要的意义。
在实际应用中，荧光蛋白标记法可以通过基因工程技术实现。
首先，将荧光蛋白基因与目标蛋白质基因进行融合，然后转染到细胞或组织中，使目标蛋白质表达并带有荧光标记。
通过荧光显微镜观察，可以对目标蛋白质进行实时监测和追踪。
除了荧光蛋白标记法，还有许多其他标记技术，如免疫荧光标记技术、量子点标记技术等。
这些技术各有优缺点，可以根据实际需求选择适合的方法进行标记和观察。
需要注意的是，荧光蛋白标记法也有其局限性，如荧光蛋白可能会影响目标蛋白质的结构和功能，或者在某些情况下会出现荧光淬灭等现象。
因此，在使用荧光蛋白标记法时需要充分考虑其适用性和局限性，并进行适当的验证和优化。
荧光共振能量转移技术在蛋白质研究中的应用蛋白质是生命活动中不可或缺的分子，其结构和功能具有极其重要的研究价值。
荧光共振能量转移技术（FRET）是近年来被广泛应用于蛋白质研究中的一种技术。
本文将介绍FRET技术的基本原理以及在蛋白质研究中的应用，并且分析FRET技术的优势和局限性。
一、FRET技术的基本原理FRET是指基于两个发射荧光信号的不同颜色，即接受者荧光二次激发的信号和给体荧光发射的信号之间的能量传递。
在二者距离越近，能量转移的效率越高，也就是说接受者荧光强度则会增强，而给体荧光强度则减弱。
因此，FRET技术可以通过测量荧光强度的变化来研究分子间距离的变化。
FRET技术通常需要三个关键的组分：一是给体分子，即发出荧光信号的分子；二是接受者分子，即接收能量的分子；三是这两个分子之间的桥梁，即是通过某些特定的结构，比如基于染料、化学修饰物或蛋白质的标记来实现。
FRET研究的原理和应用包括以下几方面：1. 能量转移的范围介电常数（Dielectric constant）是常数，以描述介质对静电场的响应功能。
当介电常数越小时，FRET的距离传感器效果会更好。
2. 水解酶/内切酶的测量许多水解酶和内切酶都是含有两个底物的。
如果这两个底物分别标记为荧光基团（即“给体”和“受体”）并且贡献了不同的荧光谱轮廓，就可以测量它们之间的距离。
通常，分子底物被标记为一种用荧光染料标记的底物和一种荧光基团荧光标记的底物。
3. 蛋白质折叠和细胞信号的分析FRET技术也可以用于测量蛋白质折叠状态的变化。
蛋白质通常被认为处于“折叠状态”或“不折叠状态”。
如果在两者之间出现折叠的变化，则可以将该变化与一系列信号事件联系起来，包括结构变化、功能调节和疾病发展。
二、FRET技术在蛋白质研究中的应用FRET技术在蛋白质研究中有着广泛的应用。
主要包括以下几个方面：1. 研究蛋白质交互作用蛋白质间的交互作用是细胞中许多生化反应所必需的。
荧光共振能量转移技术在蛋白质相互作用研究中的应用随着生物医学领域的发展和人们对生命科学的兴趣日益加深，人们对生命体内分子间相互作用的研究也日益重要。
蛋白质是重要的生物分子，在维持细胞正常功能中发挥着重要作用。
因此，研究蛋白质的相互作用对于理解生命的基本机制和研发新药物具有不可忽视的意义。
荧光共振能量转移技术（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是一种在生命科学中被广泛应用的技术，它利用分子内两种荧光蛋白质之间的能量转移来研究蛋白质分子间的相互作用。
FRET技术在获得蛋白质相互作用信息方面有独特的优势，具有无标记低毒性、定量、实时监测、不受限于细胞和体外实验等多种优点。
在FRET技术中，荧光蛋白通常被用作接受体和供体。
供体由一个荧光标记分子和吸收光谱重叠的染料组成，典型的荧光蛋白标记包括荧光素、腺嘌呤核苷酸（Adenosine Nucleotide）、二苯乙烯橙等。
当供体中的荧光标记被激发并发射光子时，一部分光子会通过FRET转移到接受体中的荧光标记，同时，另一部分光子仍会由供体荧光标记直接发射出去。
因此，接受体和供体之间的距离和相对取向可以通过监测FRET效应的强弱来确定。
FRET技术广泛应用于单分子研究、细胞蛋白互作、蛋白结晶、蛋白纯化、药物筛选等领域。
下面从蛋白质相互作用方面介绍荧光共振能量转移技术的应用。
荧光共振能量转移技术在蛋白质交互作用中的应用：1. 了解蛋白质自身的构象变化蛋白质的功能与构象密切相关。
FRET技术可以利用供体和接受体分别标记在蛋白质的不同区域，经过荧光共振能量转移后，监测接受体的荧光强度变化，可以得出蛋白质的构象变化情况。
通过监测荧光信号，可以了解蛋白质分子在生物过程中的构象变化。
例如，FRET技术可以被用于研究激酶酶活性调控，研究生长因子的信号转导机制，测定核受体的构型改变等。
2. 探究蛋白质互作机制蛋白质是生物体内的重要分子，在细胞内起着各种作用。
荧光蛋白技术在生物分析中的应用生物学研究中有很多需要观测细胞、分子移动、信号转导等过程的实验。
在这个领域中，荧光蛋白技术是一种常用的手段。
它可以有力地解决这种研究中分子标记和信号监控的问题。
荧光蛋白技术在生物分析中应用广泛，包括监测DNA合成和 DNA 损伤修复、分析蛋白质的分布和相互作用、研究酶的功能及其动力学行为等。
下面，我们将详细介绍荧光蛋白技术在这些领域中的应用。
1、监测DNA合成和 DNA 损伤修复荧光蛋白用于监测 DNA 合成及 DNA 损伤修复的实验，可以通过荧光显微镜观测单个细胞或细胞群中单个细胞的荧光强度的变化。
荧光蛋白可以被标记在DNA 而不破坏其结构，从而使其与其他荧光蛋白结合，形成不同的荧光混合物，实现对 DNA 合成和损伤修复的监测。
荧光蛋白技术的一个突出应用是监测 DNA 合成和修复过程中的核转录现象，这个过程可以得到相关基因表达的信息。
2、分析蛋白质的分布和相互作用对于分子生物学研究来说，了解分子的结构、组成、量和分布等信息是非常重要的，这些信息可以了解蛋白质在生物体中的生理作用。
荧光蛋白可以用于标记蛋白质并实现它们的定位和分布，用于研究蛋白质相互作用等方面。
利用荧光标记的蛋白质，可以在荧光显微镜下观察它们在细胞内的运动轨迹、位置和数量。
荧光蛋白标记的蛋白质可以探测它们在不同生物活动状态下的变化，并可以用于检测蛋白质中某些基因的调控。
3、研究酶的功能及预测酶随时间的变化荧光蛋白技术也可以用于研究酶的功能及预测酶随时间的变化。
利用荧光蛋白标记酶的方法，可以将荧光标记的蛋白质与其他蛋白质结合，形成激酶-底物复合物，并使用荧光显微镜技术进行荧光成像和跟踪。
荧光蛋白技术可以直接监测酶的动态和功能的变化，并预测酶在不同条件下的表达和活性。
总之，荧光蛋白技术在生物分析中具有广泛的应用价值。
它可以提供定量和非侵入式的检测手段，有效地解决了生物分析实验中的多种问题。
对于生物学研究来说，荧光蛋白技术的应用将提高细胞和分子的观测能力，有助于更加深入地理解生命科学中的重要过程。
荧光分析在生物医学中的应用研究荧光分析是一种基于物质发射和吸收荧光的技术，已经广泛应用于生物医学领域。
荧光分析具有高灵敏度、高选择性和非破坏性等特点，被用于生物标记、细胞成像、蛋白质定量等方面的研究。
本文将从荧光标记技术、细胞成像和蛋白质定量三个方面探讨荧光分析在生物医学中的应用研究。
一、荧光标记技术荧光标记技术是将荧光染料或荧光蛋白标记在生物分子上，通过观察荧光信号来追踪和研究生物分子的活动。
荧光标记技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
例如，通过将荧光染料标记在抗体上，可以用于免疫组织化学分析，实现对特定蛋白质的检测和定位。
此外，荧光标记技术还可以用于细胞内RNA和DNA的检测，帮助研究者了解细胞的基因表达和遗传信息传递。
二、细胞成像荧光分析在细胞成像方面的应用是生物医学研究中的重要组成部分。
通过将荧光染料或荧光蛋白标记在细胞的不同组分上，可以实现对细胞内结构和功能的直观观察。
例如，通过将荧光染料标记在细胞核内，可以观察到细胞核的形态和分布情况，从而研究细胞核在细胞生命周期中的作用。
此外，荧光标记技术还可以用于观察细胞内蛋白质的定位和转运过程，帮助研究者了解蛋白质在细胞内的功能和相互作用。
三、蛋白质定量荧光分析在蛋白质定量方面的应用也非常广泛。
蛋白质定量是生物医学研究中的重要任务之一，可以帮助研究者了解蛋白质在生物体内的表达水平和功能。
通过荧光标记技术，可以实现对蛋白质的定量分析。
例如，可以将荧光染料标记在特定蛋白质上，通过测量荧光信号的强度来定量蛋白质的表达水平。
此外，荧光标记技术还可以用于蛋白质相互作用的研究，通过观察荧光信号的变化来揭示蛋白质之间的相互作用机制。
综上所述，荧光分析在生物医学中的应用研究具有重要的意义。
荧光标记技术可以帮助研究者追踪和研究生物分子的活动，细胞成像可以实现对细胞内结构和功能的直观观察，蛋白质定量可以帮助研究者了解蛋白质在生物体内的表达水平和功能。
随着技术的不断发展和创新，相信荧光分析在生物医学中的应用研究将会取得更加突破性的进展，为生物医学领域的发展做出更大的贡献。
蛋白质荧光标记技术简介蛋白质荧光标记技术是一种重要的生物化学技术，用于研究蛋白质的位置、表达和相互作用。
它通过将荧光染料或荧光蛋白与目标蛋白结合，从而使其在实验过程中能够被可视化和检测。
本文将介绍蛋白质荧光标记技术的原理、应用领域以及最常用的几种标记方法。
一、蛋白质荧光标记技术的原理蛋白质荧光标记技术的原理基于荧光现象，即某些物质在受到一定波长的光照射后，会发出可见光的特性。
这种技术利用具有荧光特性的染料或蛋白质与目标蛋白质发生特异性结合，从而实现对目标蛋白质的可视化和检测。
二、蛋白质荧光标记技术的应用领域1. 蛋白质定位和分布研究：蛋白质荧光标记技术可以帮助研究人员确定特定蛋白质在细胞或组织中的位置和分布情况，从而了解其功能和作用机制。
2. 蛋白质表达研究：通过标记目标蛋白质的荧光染料或蛋白质，可以追踪和监测蛋白质在细胞或组织中的表达水平和动态变化。
3. 蛋白质相互作用研究：蛋白质荧光标记技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用关系，如蛋白质的复合物形成、酶促反应等。
4. 药物研发与筛选：蛋白质荧光标记技术可用于评估药物与目标蛋白质之间的结合能力和影响，有助于药物研发和筛选过程。
三、常用的蛋白质荧光标记方法1. 化学标记法：化学标记法是通过将荧光染料或某些具有荧光性质的化合物与目标蛋白质反应来实现标记。
常用的化学标记剂有荧光同位素、闪烁染料和化学选择性染料等。
2. 基因工程标记法：基因工程标记法是通过将荧光蛋白基因与目标蛋白质基因相连接，使得目标蛋白质能够表达出与荧光蛋白相结合的融合蛋白，从而实现标记。
其中最为常见的是绿色荧光蛋白（GFP）。
3. 免疫标记法：免疫标记法是利用抗体的特异性与目标蛋白质发生结合，再将带有荧光标记的二抗与抗原-抗体复合物相结合，从而实现对目标蛋白质的标记。
四、对蛋白质荧光标记技术的观点和理解蛋白质荧光标记技术是一种非常强大和广泛应用的技术，在生物学研究领域中起到了至关重要的作用。
gfp标记蛋白作用GFP标记蛋白作用绿色荧光蛋白（GFP）是一种广泛应用于生物学研究的蛋白质标记工具。
它源自于一种发光海洋生物，具有独特的发光特性，发出强烈的绿色荧光。
GFP标记蛋白在细胞生物学、分子生物学和生物医学等领域发挥着重要作用，为科学家们提供了一个强大的工具，用于研究蛋白质在细胞内的行为、功能和相互作用。
首先，GFP标记蛋白通过其独特的荧光特性，使科学家们能够直接观察和跟踪蛋白质在细胞中的动态过程。
通过将GFP融合到感兴趣的蛋白质上，科学家们可以使用显微镜等技术实时观察这些蛋白质在细胞内的位置、分布和运动。
这为研究细胞的结构和功能提供了非常重要的线索，并有助于揭示蛋白质在生物学过程中的作用。
其次，GFP标记蛋白的应用也拓宽了科学家们对蛋白质相互作用的认识。
通过将GFP融合到不同蛋白质上，科学家们可以观察这些蛋白质在细胞中的互相作用情况。
如此，我们可以了解蛋白质之间的相互作用对细胞功能的调控机制，甚至可以揭示新的信号通路和蛋白质网络。
这有助于研究疾病的发生机制以及药物研发中的靶点发现。
此外，GFP标记蛋白还可以用于研究蛋白质的空间定位和生物化学特性。
通过在GFP标记蛋白上引入一些特定的突变或标记，我们可以分析蛋白质的结构以及其与其他分子之间的相互作用。
这有助于理解蛋白质功能的基本机制，并为结构生物学的研究提供了有力工具。
最后，GFP标记蛋白技术的广泛应用也促进了生物医学研究的发展。
通过GFP标记蛋白，科学家们可以追踪病毒、细菌和肿瘤细胞等病理过程，从而为疾病的发生、发展和治疗提供了新的思路。
此外，GFP标记蛋白还可以用于监测基因表达、细胞分化和疾病标记物等方面的研究，为临床医学的诊断和治疗提供了宝贵的信息。
综上所述，GFP标记蛋白作为一种重要的蛋白质标记工具，在生物学研究中发挥着重要作用。
它提供了直观的可视化手段，使科学家们能够更好地了解蛋白质在细胞内的行为和相互作用。
与此同时，GFP标记蛋白也为生物医学研究提供了新的平台和思路。
荧光蛋白在细胞示踪和分析中的应用随着人类对细胞生命活动的认识不断深入，对细胞内部动态过程的研究需要寻找一种有效的标记方法。
而荧光蛋白标记技术由于其非侵入性、无需外加工具等多种优点得到了广泛的应用，成为了研究细胞功能、设计药物、病毒和细胞治疗的重要工具之一。
本文将从荧光蛋白的基本结构、荧光原理入手，说明其在细胞示踪和分析中的应用。
一、荧光蛋白的基本结构和发现历程荧光蛋白（Fluorescent Protein，FP）是一类富含α螺旋、β折叠片段的酸性蛋白质，是一种自然存在的荧光分子。
它们通常是从许多种动物的变色龙、鬣蜥和珊瑚等生物体中发现。
其基本结构由11肽键组成的β桶形状，肽键之间的共振作用区使得氨基酸残基的电子能级发生变化，从而激发荧光分子发出特定波长的光。
最早发现的荧光蛋白是由美国生物物理学家Osamu Shimomura在1962年从发光珊瑚中分离出的大肠杆菌（Escherichia coli）亚稳态蛋白质(Green Fluorescent Protein, GFP)。
在1990年代，夫妇芬迪克和马丁·查尔芬发现了GFP基因，并运用此技术标记了其他生物体的细胞，从而打开了“荧光标记细胞”的先河。
二、荧光蛋白的荧光原理荧光蛋白之所以能够发出各种颜色的荧光，是因为在受到外部激发波长的激发后，其分子结构会发生一系列的电子跃迁过程，最终导致荧光分子自发地向周围发射出单色的光线。
这个电子跃迁过程分为两步：第一步是激发。
荧光蛋白分子会吸收一个激发波长的光子，使其中的电子透过分子的色素链向高能态跃迁，这个光度量和荧光的颜色有关。
第二步是荧光发射。
同样的电子会原路返回到基态或者较低的能态，这个过程中也释放出一个光子。
这个光子的颜色具有所谓的“荧光光谱”——即最大发射波长和荧光相对量的集合，通常是荧光蛋白的一个重要特征。
三、荧光蛋白在细胞示踪中的应用1.实现细胞标记荧光蛋白能够被植入到新生的胚胎细胞中，也能够被引入到已经成熟的细胞中。
荧光原理在生物技术中的应用随着科技的不断发展，生物技术在各个领域中起到了越来越重要的作用。
其中，荧光原理作为一种重要的分析方法，在生物技术中得到了广泛的应用。
本文将从三个方面介绍荧光原理在生物技术中的应用。
第一，荧光探针的研发与使用。
荧光探针是指通过在生物样品中引入荧光标记物，利用其发射荧光信号来检测目标分子的存在和活动状态的一种方法。
荧光标记物的选择十分重要，常见的有荧光染料、荧光蛋白等。
荧光标记物的特点在于其可以被高灵敏度检测仪器所探测到，且可以通过选择不同的荧光标记物实现多目标检测。
荧光探针的研发需要考虑到对样品的影响要尽可能小，确保准确可靠的实验结果。
第二，荧光显微镜的应用。
荧光显微镜是一种具有高灵敏度和高分辨率的显微技术，广泛应用于生物学实验中。
它可以通过激发样品中的荧光标记物，将其发出的荧光信号转化为电信号并放大，从而观察到细胞、分子以及细胞内的生物过程。
荧光显微镜在细胞生物学、分子生物学、生物医学等领域中都起到了重要作用。
例如，通过荧光显微镜观察细胞内某种蛋白质的定位情况，可以研究其在细胞内的功能和调控机制。
第三，流式细胞术的应用。
流式细胞术是一种利用荧光标记物和流式细胞仪联合使用的技术，用于分析和筛选细胞中的特定成分。
它可以通过标记不同的细胞分子，识别和分析细胞中的多参数，并能够进行单细胞水平上的检测和分析。
流式细胞术的应用十分广泛，可以应用于肿瘤学、免疫学、干细胞研究等领域。
例如，在肿瘤学研究中，通过标记不同种类的细胞表面标记物或细胞内标记物，可以准确地鉴别和定量不同类型的肿瘤细胞，并帮助研究人员了解肿瘤细胞的发展和转化机制。
总结起来，荧光原理在生物技术中的应用是多样而广泛的。
通过荧光探针的研发与使用、荧光显微镜的应用以及流式细胞术的应用，可以实现对细胞、分子的精确检测和分析。
荧光原理作为一种灵敏且非破坏性的检测方法，在生物技术的发展中发挥着重要作用。
然而，随着生物技术的不断进步，人们对于荧光原理的研究和应用还有很大的发展空间。
荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用Feb 20, 2010No Comments随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。
本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。
使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。
小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。
我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。
最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。
不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。
因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。
在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。
使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。
使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapidphotoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。
与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。
本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。
�0�2荧光标志物小分子有机染料小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。
利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。
现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不断增加之中。
不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1A~C）。
�0�2荧光蛋白第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻（cyanobacteria）中提取的触角光合色素（photosynthetic antenna pigments）。
这些生物大分子都含有多种胆汁三烯生色基团（bilin chromophores）。
这些生色基团都包裹在一种基质结构中，这样就能将它们的淬灭作用降至最小，因此这些藻胆蛋白的荧光亮度要比小分子荧光染料的亮度高出两个数量级。
不过这些藻胆蛋白的“个头（分子量高达200KD）”也限制了它们在细胞内的扩散，因此，它们也只能与抗体联用，在流式细胞术试验或ELISA试验中用来检测细胞表面的蛋白质分子。
不过如果能将这些藻胆蛋白在细胞中原位表达，那么它们的用途就会大为扩展，但问题在于胆汁三烯生色基团必须依赖脱辅基蛋白（apoproteins）的作用。
不过令人高兴的是，我们已经在这方面取得了一些成绩。
自从科学家从维多利亚发光水母（jellyfish Aequorea victoria）中发现了绿色荧光蛋白（GFP）之后，生物成像领域就发生了革命性的改变。
单独表达绿色荧光蛋白或与其它蛋白融合表达就可以在细胞内发出绿色荧光了，使用这种方法除了需要氧气O2之外，不再需要任何其它的试剂参与，因为生色基团是通过自发环化作用形成的，需要对深埋在直径约2.4纳米至4纳米的β桶（beta barrel）核心里的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-氨基乙酸）进行氧化才能发出荧光。
绿色荧光蛋白只是荧光蛋白大家族中的一员，这些荧光蛋白大部分都来自海洋腔肠动物，因为各自含有共价结构不同以及非共价环境不同的生色基团，所以可以发出不同颜色的荧光。
在实验室中对这些荧光蛋白进行遗传修饰之后可以进一步的丰富它们的特性，比如增加亮度和折叠效率、减少寡聚体形成等。
突变既可以增加荧光蛋白的光稳定性，还可以赋予荧光蛋白光操控性，比如控制荧光发射与否，或者发出哪种荧光。
这种光操控性既可以是可逆的也可以是不可逆的，可以用于监测蛋白的弥散过程、运输过程和老化过程等。
虽然荧光蛋白在生色基团形成的过程中会生成H2O2，但似乎没有产生太多的活性氧簇（ROS），这一点也并不奇怪，因为荧光蛋白在进化过程中都是暴露在阳光下的。
不过我们也可以对荧光蛋白进行改造使其能够形成ROS。
荧光蛋白发出的荧光一般对它们所处的生化环境都不太敏感，但是酸性环境或变性剂的存在可以淬灭荧光。
不过现在我们已经有了经过改造的、能耐受酸性环境或者能对金属离子、卤化物离子和巯基二硫化物氧化还原剂起反应的荧光蛋白。
�0�2量子点（QD）量子点是一种无机纳米结晶体，它可以根据其大小发出特定波长的荧光，它具有非常高的消光系数，其消光系数要比小分子荧光基团和荧光蛋白高出10倍至100倍，同时量子点的量子产率也非常好。
典型的量子点都含有一个硒化镉（CdSe）或碲化镉（CdTe）核心，外面包裹一硫化锌（ZnS）外壳（图1C）。
量子点的吸收波长范围覆盖从非常短的波长至略低于其发射波长的广阔范围，因此一束单波长激发光就可以让量子点达到多重发射。
对于生物学研究领域来说最重大的一项突破是研究出了能让量子点溶于水的包被材料，该材料能避免量子点被水淬灭，同时也能让量子点可以与抗体、抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）等分子相连接（图1B）。
不过这种结合了生物大分子的量子点体积过大（直径约10纳米至30纳米），从而阻碍了它通过细胞膜结构，这种量子点也就只能用于经透化处理的细胞，或者只能对胞外蛋白和可以被细胞内吞的蛋白进行研究。
量子点的光稳定性使其能够反复成像，而其大小和电子密度特性又使得它适合用于电镜研究。
在亲水的树枝状高分子聚合物（hydrophilic dendrimers）中形成的金或银纳米点材料也能发出荧光，同时也具有波长可调性。
这种新型材料在细胞生物学领域的应用前景也是不可估量的。
�0�2标记蛋白技术免疫标记法表1中列举了几种免疫标记法以及其它标记蛋白的技术。
在用荧光技术检测内源性蛋白质时最常用的方法就是免疫学方法，即先用特异性抗体（一抗）识别靶蛋白，再用标记有小分子有机染料、藻胆蛋白或量子点的二抗显色（图1A至C）。
或者，也可以直接将荧光标志物或者生物素连接在一抗上，然后再用抗生物素蛋白链菌素检测。
当把抗体直接注入细胞时或者为了对多个蛋白进行检测而使用了多种颜色的荧光时采用这种直接将标志物连接在抗体上的方法非常有效。
但是如果没有高质量的抗体时最好就是将荧光标志物与靶蛋白一起融合表达来检测，尽管这种融合蛋白不能算真正意义上的“内源性蛋白”。
对靶蛋白检测的精确程度取决于一抗的特异性，因此还需要用其它的方法进行佐证。
使用免疫荧光标记法的劣势在于前面所述的，该方法只能用于经透化处理的细胞、胞外蛋白和可以被细胞内吞的蛋白，而且这些抗体标志物的多价性（multivalency）还可能会导致靶蛋白形成寡聚体。
在标准的免疫标记法中，荧光标记的复合体通常来说分子量都会超过200KD，这有可能会影响到蛋白间的相互识别过程。
�0�2表1 荧光基团在蛋白质检测中的应用++、+/-、-分别表示“应用范围较广”，“在某些领域内有所应用”，“较少应用”�0�2遗传标记法将荧光蛋白与靶蛋白融合在一起的遗传标记法最大的优势就是可以对靶蛋白进行精确的标记（图1C和D）。
用转染技术和转基因技术进行荧光标记要比用荧光染料方便得多。
遗传标记法的缺点在于表达的蛋白不是“内源性”蛋白，荧光蛋白的分子大小会带来影响，融合蛋白可能会影响到目的蛋白的功能，以及荧光蛋白的限制性问题等。
因此，又发展出了好几种“混合系统”，在活细胞内或细胞表面将小分子荧光标志物与目的蛋白进行共价连接，或者通过酶的作用进行连接，甚至于可以自动连接。
不过这些技术中的大部分都太新了，还没有得到足够的实用检验。
这些混合系统中最好的系统应该算四半胱氨酸序列（tetracysteine）-biarsenical染料系统。
该系统用一段由12个氨基酸残基组成的肽段对目的蛋白进行修饰，这段短肽内包含有4个半胱氨酸，这些半胱氨酸能够与可以透过细胞膜的biarsenical染料分子相结合，形成FlAsH或ReAsH，发出绿色或红色荧光，这种结合过程是高亲和力的过程，只需要皮摩尔级的分子就足够了（图1C和E）。
同时使用小分子二巯基化合物解毒剂（dithiol antidotes）可以降低靶蛋白与染料之间的亲和力，同时减少毒性反应。
Tetracysteine 基序已经经过了好几轮改良以提高它与biarsenical染料之间的亲和力，这样只需使用很低浓度的biarsenical染料就可以达到目的，而且可以降低背景。
这种小分子Tetracysteine基序对目的蛋白的影响要比荧光蛋白小得多，有人用酵母微管蛋白（tubulin）、G蛋白和细菌致病蛋白等已经证实了这一点。
这种tetracysteine-biarsenical系统还具有其它荧光蛋白不具有的优势，比如可以用于亲和纯化（affinity purification）、荧光蛋白辅助的光灭活作用（fluorophore-assisted light inactivation）、检测蛋白质合成过程、进行脉冲追踪标记（pulse-chase labeling）以及电镜下定位等等。
不过，biarsenical染料会造成背景荧光偏高，因此在这一点上（荧光高对比度）相比荧光蛋白并不具备优势，因此还没有用于转基因动物，而且还不能同时对不同的蛋白标记上不同的颜色。
Tetracysteine序列有时也可以提供一个十六烷酰化位点（palmitoylation site），虽然这种修饰作用有时会被已经存在的原位标签（epitope tag）所阻碍。
这种遗传标记法具有其独特的优势，但是还是需要用其它方法验证标记物蛋白或融合蛋白是否会影响到目的蛋白的功能及定位。
�0�2�0�2荧光标记技术在原代细胞和固定组织中研究蛋白质表达情况和蛋白质定位情况时的应用用流式细胞术研究蛋白质表达情况和蛋白质活性免疫荧光技术是最适合研究内源性蛋白质的一种方法。
