绿色荧光蛋白（GFP）标记的尖孢镰刀菌 在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖

建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记姚锦爱;张鸿;黄鹏;陈峰;余德亿【摘要】[目的]开展建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白标记研究,直观观察尖孢镰刀菌在建兰植株上的侵染为害,明确病原菌的致病过程,为开展建兰茎腐病原菌的相关研究提供良好技术手段.[方法]采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白(GFP)转化,并检测转化子的遗传稳定性.[结果]G F P基因可被成功导入到尖孢镰刀菌F-02中并获得表达,转化子在蓝色光源激发下,菌丝和分生孢子均能稳定散发绿色荧光;转化子10次继代培养后菌落生长良好,菌丝和分生孢子仍可稳定散发出绿色荧光,对寄主植物的致病力也未发生改变,[结论]G F P基因可在建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中稳定存在,并对其致病力没有影响.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2019(034)001【总页数】6页(P70-75)【关键词】建兰;茎腐病;尖孢镰刀菌;绿色荧光蛋白;基因标记【作者】姚锦爱;张鸿;黄鹏;陈峰;余德亿【作者单位】福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省作物有害生物监测与治理重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院作物研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省农业科学院植物保护研究所,福建福州 350013;福建省作物有害生物监测与治理重点实验室,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】S436.80 引言【研究意义】由尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum引起的建兰茎腐病是影响福建省建兰种植的最严重真菌病害之一，可引起兰株假鳞茎和根部腐烂、维管束褐变，导致兰株萎蔫至死亡，兰株感病率高达15%～35%[1]。

目前对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性已有一些认知[2]，但对该菌的致病机理还缺乏深入研究，因此探讨如何更直观、方便地观察该菌在建兰植株上的侵染、致病过程，对研究该菌在建兰上的致病机理、科学防治建兰茎腐病具有指导意义。

2019,32(8)：200-201中国瓜菜文献编译绿色灾光蛋白(GFP)标记的尖孑包镰刀圉在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖孙洪宝，吕桂云，许勇(编译)(北京市农林科学院蔬菜研究中心北京100097)目的与意义：西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰砲属尖抱镰刀菌寄生引起的一种真菌土传病害，是世界范围内导致西瓜产量和品质降低的最严重病害。

明确枯萎病菌与寄主植物之间的互作机制,揭示其相互作用的分子机制，可为西瓜抗枯萎病育种和病害防治奠定理论基础。

利用绿色荧光蛋白(GFP)作为标记，研究枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖动态，从组织学的角度来阐释西瓜与枯萎病菌亲和互作和非亲和互作的差异。

材料与方法：1.以农杆菌AGL1为介导，将带有潮霉素抗性基因pCH-sGFP质粒转化到西瓜枯萎病菌中，成功获得了能稳定持续表达绿色荧光蛋白的枯萎病菌的突变株BEIJING1-sGFP,对转化子进行抗性鉴定表明，组成型表达sGFP的BEIJING1-sGFP不影响枯萎病菌的致病力。

2.以抗病品种'PI296341・FR'(PI)与感病品种'Black Dia­mond'(BD)为试验材料，种子消毒后催芽，釆用浸根法接种病菌。

3.在接种后的6h>1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d取样进行激光共聚焦显微镜观察。

结果与分析:从西瓜枯萎病菌GFP转化株中选出致病力与转化前的野生型FON1在西瓜抗、感鉴别寄主上的表现无明显差异菌株命名为BEIJINGl-sGFP,继代培养后的菌体都有稳定而强的荧光信号，但在细胞质中的液泡无荧光信号。

通过人工接种，在无菌条件下进行致病力的检测,BEIJING1-sGFP与转化前的野生型FON1在西瓜抗、感鉴别寄主上的表现无明显差异，说明GFP的转化和表达对枯萎病菌的转化株的致病力无明显影响。

用激光共聚焦显微镜观测GFP标记的西瓜枯萎病菌侵染西瓜感病品种'Black Diamond'过程。

西瓜枯萎病菌Tup1基因在致病性中的功能研究摘要西瓜枯萎病是一种重要的真菌病害，由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）引起，在西瓜生长发育的各个阶段发病。

近些年来，因农业种植面积不断扩大，轮种存在一定困难，导致西瓜枯萎病的危害日益加剧，对我国西甜瓜产业造成严重影响。

相比于其他植物病原真菌，目前关于西瓜枯萎病菌关键致病基因和作用机制的研究报道还较少。

Tup1-Cyc8复合体是真核生物中高度保守的一种转录辅阻遏复合物，参与调控多种生物学过程。

本文重点研究了辅阻遏蛋白基因Tup1在西瓜枯萎病菌致病性中的功能及其可能的作用机制。

依靠PCR克隆技术和生物信息学分析，鉴定得到西瓜枯萎病菌中的Tup1基因，利用PEG介导的原生质体转化技术获得敲除突变体ΔFonTup1和回补菌株ΔFonTup1-C；经菌丝生长及产孢表型分析、致病性测定、环境胁迫响应能力测定和转录组测序分析等研究，探究了FonTup1的生物学功能。

主要研究结果如下：（1）经过菌丝生长速率、产孢能力、分生孢子萌发情况、病原菌致病性等方面的表型测定，相比于野生型菌株WT，ΔFonTup1突变体菌丝生长受到明显抑制，产孢量极低，且孢子形态异常，伤根法接种病菌发现突变体在西瓜幼苗上的致病性显著下降。

ΔFonTup1突变体中致病相关基因FOW2、MPK1、FMK1和SHO1的表达水平发生变化，镰刀菌酸合成基因FUB1、FUB3、FUB6、FUB9、FUB11和FUB12表达量显著下调，说明FonTup1基因参与调控西瓜枯萎病菌菌丝生长、产孢、孢子形态分化和致病性，且通过调控真菌毒素合成影响真菌毒力。

（2）FonTup1基因参与调控细胞壁完整性。

通过细胞壁胁迫因子响应实验发现，ΔFonTup1突变体对细胞壁胁迫因子Congo Red的敏感性显著降低，生长抑制率显著下降，4个几丁质合成酶基因CHS2、CHS4、CHS5和CHS6的表达量显著低于野生型。

西瓜花粉自发荧光特征与荧光成像效果分析乔飞;江雪飞;张彦【摘要】With watermelon pollen as the material,the spectrum and intensity of the autofluorescenee were investigated,and the photographyof the autofluorescence of pollens were optimized combined with Apotome microscope.The results showed that the maximum intensity of autofluorescence was in blue spectrum;The intensity of autofluorescence in fresh pollens fluctuated only slightly during storage;And the autofluorescence was located mainly on the reticula.After staining the pollens with aniline blue,calcofluor white,propidiumiodide,acridine orange respectively,the other parts could also be fluorescent in specific channels.Therefore,the optimized method could be not only suitable for observing the size,shape,reticulum,aperture and germ furrow,but also indicate the distribution of chemical composition.%以西瓜的花粉为材料,研究西瓜花粉自发荧光的光谱特征、荧光强度,并结合结构照明显微技术优化花粉自发荧光成像方法.结果表明:西瓜花粉的自发荧光在蓝色波段最强;新鲜花粉在储藏过程中荧光强度变化不大;西瓜花粉的自发荧光主要位于花粉外壁网纹上;分别用苯胺蓝、Calcofluor white、碘化丙啶、吖啶橙对西瓜花粉染色后,花粉的其他部位在不同荧光通道下也可以呈现荧光.因此,本研究建立的方法不仅可用于分析西瓜花粉的大小、形态、外壁纹理、萌发孔、萌发沟等形态特征,还可以反映花粉表面荧光物质分布的特征.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2017(038)012【总页数】5页(P2355-2359)【关键词】花粉;西瓜;荧光;染色;结构照明显微镜【作者】乔飞;江雪飞;张彦【作者单位】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室海南儋州 571737;海南大学热带农林学院,海南海口 570228;卡尔蔡司(上海)管理有限公司,上海200131【正文语种】中文【中图分类】Q944.57花粉是种子植物特有的结构，具有较强的遗传保守性，不同种类植物的花粉粒在形状、大小、外壁和纹理等方面都有着明显的差别。

万方数据２００４年６月绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究进展７１随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因，现有的报告基因主要有：分泌型胎盘磷酸酯酶（ｓ秘Ｐ）、Ｂ一半乳糖苷酶（互丑ｃｚ）、８一葡糖苷酸酶（ＧＵＳ）、萤火虫荧光素酶（ＬＵｃ）等，但这些基因的检测方法并不理想，它们都需要底物和辅助因子，因而在活体中的应用受到限制。

最近，一种全新的非酶性报告基因——绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）引起了人们的关注，该蛋白能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。

作为报告基因，ＧＦＰ是目前唯一能在活细胞中表达的发光蛋白；作为荧光标记分子，ＧＦＰ既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。

最近又发现Ｇ即还是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子，可以跟踪观测第二信使。

近来关于ＧＦＰ方面的研究和综述越来越多，但多是针对某一方面的特点或应用，作者将ｃＦＰ基础理论和应用研究进展作一简要综述。

ｌＧＦＰ基础理论研究进展１．１发展历史１９６２年蹦ｎ舢ｕ飓等…首先从多管水母属（枷ｒｉａ、ｒｉｃｔｏ．ｒｉａ）中分离出了ｃＦＰ；１９９２年Ｐｒａｓｌｌｅｒ等ｕ３克隆了ＧＦＰ基因的ｃＤＮＡ，并分析了ＧＦＰ的一级结构；１９９４年ｃｈ址ｅ等ｂ３首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了ＧＦＰ，开创了ＧＦＰ应用研究的先河，之后很快发现ＧＦＰ能在多种异源细胞中表达，ＧＦＰ在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮；１９９ｒ７年１０月１８—２２日在美国Ｎｅｗ—Ｊ嘲ｙ专门召开了一次关于ＧＦＰ的国际会议。

１．２ＧＦＰ结构、生化特性、发光机制、光谱特性１．２．１结构由正常野生型ｃＦＰ（ｗｔＧ即）的ｃＤＮＡ序列推出的蛋白质一级结构，由２３８个氨基酸残基组成，ｓＤ卜ＰＡＧＥ凝胶电泳测定其分子量为２７—３０ｌ【Ｄ。

晶体学证据Ｈ’表明，ＧＦＰ中央是一个Ｂ罐（ｐ一锄）结构。

ＧＦＰ的生色团位于“一６９的六肽内。

西瓜抗枯萎病菌生理小种1与2的遗传和染色体定位分析作者：任毅焦荻宫国义张海英郭绍贵张洁许勇来源：《中国瓜菜》2019年第08期目的与意义：西瓜枯萎病是一种世界性的毁灭性土传真菌病害，是导致全球西瓜产量和品质降低的最严重障碍。

西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌引起的，研究西瓜抗枯萎病菌生理小种1和2的遗传分析和染色体定位，将有利于高效改良栽培西瓜的枯萎病抗性，为开展西瓜抗枯萎病分子辅助育种提供技术支撑。

材料与方法：以来自中国优良栽培品种‘97103’与美国的栽培品种‘PI 296341-FR’杂交的103个重组近交系（RIL）组成的F8群体为实验材料。

每个品系挑选生长一致的15株植物，用于枯萎病致病菌接种。

其中‘Sugar Baby ’和‘Black Diamond’作为FON生理小种1（FON-1）感病品种对照，‘Charleston Gray’‘Crimson Sweet’和‘Calhoun Gray’作为FON生理小种1的抗病品种对照。

‘Calhoun Gray’作为FON生理小种2（FON-2）的感病品种对照，‘SY630’作为FON 生理小种2的抗病品种对照。

结果使用SAS 8.0进行统计分析方差分析（ANOVA）。

根据Knapp等人计算H2置信区（CI）。

使用SAS在平均基础上计算Pearson在所有环境中的性状之间的表型相关系数。

并检测FON生理小种1和生理小种2抗性QTL，以及接种FON-2的SNP标记。

结果与分析：接种FON-1和FON-2后，‘97103’的发病指数高于‘PI 296341-FR’。

在RIL 群体中观察到FON-2抗性的超亲分离，而未检测到FON-1和FON-2抗性的平均疾病指数的变化，平均疾病指数分别为0.53和0.66。

FON生理小种1和生理小种2抗性测试中，接种FON生理小种1后，第21天RILs系存活近一半，R：S=1：1，表明FON-1的抗性可能受1个主效QTL的控制。

西瓜疫霉菌对细胞壁多糖的侵染与代谢机制西瓜是夏季非常受欢迎的水果，它富含营养，口感清爽。

但是，在西瓜的生长过程中，疫霉菌却常常威胁着这个甜蜜的水果。

疫霉菌是一种引起植物病害的真菌，它会入侵西瓜，导致腐烂。

本文将讨论疫霉菌如何感染西瓜细胞壁多糖以及其代谢机制。

西瓜细胞壁多糖细胞壁是植物细胞外围的重要部分，它保护和支持细胞。

细胞壁主要由纤维素、半纤维素和蛋白质等多糖物质组成。

这些多糖物质在植物的生长和发育以及与外界的相互作用中都具有重要的生理学作用。

西瓜细胞壁多糖的组成主要包括纤维素、果胶和半纤维素。

其中，果胶是西瓜细胞壁多糖的主要成分。

果胶分子由一系列的D-半乳糖醛酸（D-galacturonic acid，GalA）单元和一些不同的侧链单元组成。

果胶的质量和分子结构的变化可以影响果实发育和储存性能。

因此，果胶多糖在西瓜中具有重要的作用。

西瓜疫霉菌感染与细胞壁多糖侵染西瓜疫霉菌是一种致病性真菌，可以引起西瓜腐烂等病害。

疫霉菌侵染植物的过程包括周围环境感知、黏附、穿透细胞壁等多个步骤。

在疫霉菌侵染植物的过程中，其菌丝会不断伸长，并侵入植物细胞内部。

细胞壁多糖是疫霉菌侵染植物过程中的主要目标之一。

攻击细胞壁多糖是疫霉菌进一步侵染植物所必需的初步步骤之一。

为了感染植物，疫霉菌会释放多种分泌物进行植物细胞壁多糖的裂解和水解。

疫霉菌分泌的多酚氧化酶可以将一些细胞壁多糖的成分氧化，降低细胞壁的强度和稳定性，使细胞壁变得脆弱易碎，能够更好地穿透。

同时，疫霉菌产生的蛋白酶和纤维素酶也可以通过水解细胞壁多糖，使得疫霉菌可以穿过细胞壁侵入植物内部。

疫霉菌对细胞壁多糖的代谢机制当疫霉菌侵染至细胞壁多糖时，它需要一定的机制来分解这些多糖，并获取所需的营养物质来支持其生长。

疫霉菌产生的果胶酶可以裂解果胶分子，从而获得所需的营养物质。

果胶酶的作用机制主要是通过水解果胶分子中的β-1,4-连接状态下相邻两个半乳糖苷键，产生高甲氧基果胶酸中间体和低甲氧基果胶酸等产物。

西瓜、水稻根分泌物及酚酸类物质对西瓜专化型尖孢镰刀菌的影响郝文雅;冉炜;沈其荣;任丽轩【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2010(043)012【摘要】[目的]探讨西瓜、水稻根分泌物及其中的酚酸类物质对西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum, FON)的影响,阐释西瓜枯萎病的发生和西瓜/旱作水稻间作系统改善西瓜连作枯萎病的机理.[方法]营养液培养法收集西瓜根分泌物(REW)和水稻根分泌物(RER),研究其对FON生长的影响;HPLC法分离鉴定REW和RER中的酚酸类物质,并通过外源添加法研究该类物质对FON生长的影响.[结果]REW能显著促进FON孢子萌发和产孢,与对照相比,1.0 mL和5.0 mL的REW对FON孢子萌发的促进率分别为46.9%和59.2%;在0.1mL至2.0 mL范围内,REW对FON产孢的促进率从10.8%逐渐增加到84.6%;而RER能显著抑制FON孢子萌发和产孢,1.0 mL和5.0 mL RER对FON孢子萌发抑制率分别为14.3%和6.1%;并在0.1 mL至2.0 mL范围内,对该菌产孢的抑制率由4.6%增至37.5%.在REW和RER中同时检测到水杨酸、对羟基苯甲酸和邻苯二甲酸,而阿魏酸和香豆酸分别单独存在于REW和RER中;且RER中以香豆酸含量最高(占总量的37.9%);其酚酸总量是REW的1.4倍.综合FON孢子萌发、产孢能力和菌丝生长三项测定指标,香豆酸的抑菌效果最显著,抑制率分别为9.1%-70.5%、24.1%-100.0%和2.5%-47.5%,其次是水杨酸;而阿魏酸、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸对FON孢子萌发、产孢有不同程度的促进作用,以阿魏酸最为突出,浓度为40-160 mg·L-1时促进率分别为28.6%-114.3%和17.7%-54.8%.[结论]西瓜根分泌物对FON有刺激作用而水稻根分泌物对FON却具有抑制作用,这为阐释西瓜/旱作水稻间作系统改善西瓜连作枯萎病提供了理论依据.【总页数】10页(P2443-2452)【作者】郝文雅;冉炜;沈其荣;任丽轩【作者单位】南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室,南京,210095;南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室,南京,210095;南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室,南京,210095;南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用高技术研究重点实验室,南京,210095【正文语种】中文【相关文献】1.酚酸类物质和氨基酸对西瓜专化型镰刀菌生长的影响 [J], 刘爱民;徐双锁;李倩;蔡欣2.稻秸蓝藻混合厌氧发酵沼液及其化学物质对尖孢镰刀菌西瓜专化型生长的影响[J], 刘爱民;徐双锁;蔡欣;卢存龙;彭鹏3.GFP标记的尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染西瓜过程观察 [J], 李春强;梁慧施;夏亦荠;彭明4.解淀粉芽孢杆菌LZN01对西瓜专化型尖孢镰刀菌的抑制效应 [J],5.西瓜专化型尖孢镰刀菌的分离鉴定及水稻根系分泌物对其生长的影响 [J], 苏世鸣;任丽轩;杨兴明;徐阳春;周俊;沈其荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

生防改良菌株F1-35的GFP标记及其对西瓜幼苗生理及防御系统的影响甘良;查顺清;刘继红;蓝星杰;王阳;宗兆锋【摘要】为探究生防改良菌株F1-35的绿色荧光蛋白标记及其在标记后相关性状的改变情况,采用PEG-CaCl2法介导原生质体转化,成功地将GFP基因转入到生防改良菌株F1-35中,转化率为每微克质粒DNA6个转化子,转化子经继代培养5代后仍能在含潮霉素B的培养基上正常生长,且其荧光稳定,强度良好;其分生孢子也能表达强烈的荧光.灌根处理西瓜幼苗发现,与原始生防改良菌株F1-35比较,经GFP 标记后的菌株F1-35-GFP对西瓜的促生、抗逆作用以及其在西瓜幼苗根部的定殖情况和对西瓜枯萎病的防治效果未发生改变,防治效果仍能达60％以上;通过分析F1-35对西瓜枯萎病的防治效果及其对西瓜幼苗防御酶的影响关系发现,F1-35能提升PPO等防御酶的活性,从而抑制西瓜枯萎病的发生.可见,GFP能稳定存在于生防改良菌株F1-35中,且不对其促生、抗逆作用及防效产生影响,F1-35可通过提升西瓜幼苗防御酶活性来防治西瓜枯萎病的发生.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2015(024)012【总页数】9页(P108-116)【关键词】绿色荧光蛋白;生防改良菌株F1-35;原生质体转化;防御系统【作者】甘良;查顺清;刘继红;蓝星杰;王阳;宗兆锋【作者单位】旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;旱区作物逆境生物学国家重点实验室,西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S476.11962年于发光水母中发现的绿色荧光蛋白基因(Green Fluorescent Protein，GFP)已作为报告基因被广泛使用[1]，其荧光稳定、直观，且操作简单方便，不需添加额外底物便可在活体细胞组织中直接定位检测、观察[2]。

几株尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白基因转化黄东杰;彭明;李春强【摘要】Several Fusarium oxysporum strains (Foc1, Foc4, Foc 8359#, Foc 8361#, Foc 8363#, Foc 8368# and Fov) have been successfully transformed with the gene coding for green fluorescent protein (GFP) using protoplast transformation method mediated by PEG. Transformants can emit quite stable fluorescence under 480 nm laser after five successive subcultures. PCR analysis confirmed that the gfp gene had been transformed into F. oxysporum strains. Those GFP transformations of F. oxysporum will provide a visible material for the study of infection and control of fusarium wilt of banana and cotton.%利用PEG介导的原生质体转化方法，将绿色荧光蛋白基因转入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。

结果表明：转化子连续转接5代能够稳定遗传，荧光强度良好， PCR验证gfp基因已转入到菌株中，为后续研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可视化的检测和分析手段。

【期刊名称】《热带农业科学》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】4页(P59-62)【关键词】尖孢镰刀菌古巴专化型;尖孢镰刀菌萎蔫专化型;绿色荧光蛋白;原生质体转化【作者】黄东杰;彭明;李春强【作者单位】中国热带农业科学院科技信息研究所海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口 571101【正文语种】中文【中图分类】Q78香蕉枯萎病又称巴拿马病、黄叶病，是由半知菌亚门丝孢纲瘤座孢目镰刀菌属尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubence,Foc)引起的土传维管束病害[1]。

基因宏阵列和荧光定量PCR方法对西瓜枯萎病害土壤中尖孢镰刀菌的快速检测和定量赵爽;罗佳;凌宁;徐大兵;朗娇娇;胡江;沈其荣【摘要】采用基因宏阵列(Macroarray)和荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法,对引起两瓜枯萎病害的病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)进行了快速监测和快速绝对定量,并且对实验条件进行了优化和摸索.结果显示,在西瓜枯萎病害发病较为严重的处理N-+P-和N-+P+的根际土壤中,Macroarray检测到强烈的阳性信号,表明尖孢镰刀菌的大量存在,同时荧光定量PCR的结果也表明在这两个处理的根际土壤中尖孢镰刀菌数量最多,分别为每g土壤8.89×105和2.24 × 105个拷贝数;而在末发生枯萎病害的处理N++P-和N++P+中,Macroarray末检测到阳性信号,根际土壤中尖孢镰刀菌数量分别为每g土壤6.23×103和3.28×103个拷贝数;而四个处理的土体土壤中尖孢镰刀菌的数量均维持在每g土壤102～103个拷贝数,Macroarray未检测到阳性信号.与传统检测方法如病原菌的分离培养、平板稀释计数等相比,上述分子生物学方法对病原真菌的检测和定量更为准确快速、省时省力.【期刊名称】《土壤学报》【年(卷),期】2010(047)004【总页数】6页(P703-708)【关键词】尖孢镰刀菌;基因宏阵列;实时荧光定量PCR;SYBR Green I【作者】赵爽;罗佳;凌宁;徐大兵;朗娇娇;胡江;沈其荣【作者单位】南京农业大学资源与环境科学学院,南京,210095;江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室,江苏宜兴,214200;江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室,江苏宜兴,214200;江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室,江苏宜兴,214200;江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室,江苏宜兴,214200;江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室,江苏宜兴,214200;南京农业大学资源与环境科学学院,南京,210095;江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室,江苏宜兴,214200;南京农业大学资源与环境科学学院,南京,210095;江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室,江苏宜兴,214200【正文语种】中文【中图分类】S154.38植物枯萎病是由镰刀菌寄生引起的一种世界性的真菌土传病害，在棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫芦、甜瓜、丝瓜、白瓜等经济作物上发生较为严重［1］。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli 进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

西瓜枯萎病菌和哈茨木霉的GFP标记及根部动态定殖比较孟素玲;王媛;顾欣;王新谱
【期刊名称】《西北农业学报》
【年(卷),期】2024(33)2
【摘要】为明确西瓜枯萎病菌和生防哈茨木霉在西瓜根部动态定殖的差异,采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法,将携带绿色荧光蛋白基因的pCT74质粒分别与尖镰孢菌西瓜专化型和哈茨木霉M3菌株的基因组整合获得相应的转化子;将转化子接种于土壤,利用激光共聚焦显微镜示踪并比较两菌株转化子对西瓜幼苗根部的侵染动态过程。

结果表明,转化子连续传代6次仍能发出绿色荧光且荧光强度稳定,能够稳定遗传,经PCR验证绿色荧光蛋白基因转入成功。

盆栽试验中,两种转化子均能成功定殖于西瓜幼苗根部,在定殖初期,尖镰孢菌西瓜专化型在根内的扩散速度快于哈茨木霉M3菌株。

【总页数】9页(P355-363)
【作者】孟素玲;王媛;顾欣;王新谱
【作者单位】宁夏大学农学院
【正文语种】中文
【中图分类】S65
【相关文献】
1.钩状木霉ACCC31649的GFP标记及其对辣椒定殖和促生作用
2.溶杆菌SNNU513基因gfp标记及在玉米根部定殖
3.哈茨木霉NBL-Z1定殖动态及对草莓根腐病防治效果
4.生防菌哈茨木霉FJAT-9040的GFP标记及土壤定殖示踪
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利用GFP表达系统检测球孢白僵菌侵染昆虫过程金凯;张永军;罗志兵;林健文;裴炎【期刊名称】《菌物学报》【年(卷),期】2008(27)3【摘要】绿色荧光蛋白(GFP)作为一种重要的报告基因,在病原菌和寄主之间的互作研究中具有良好的应用前景.利用草丁膦抗性基因bar为筛选标记,构建了组成性表达绿色荧光蛋白基因egfp的载体pBG,并转入球孢白僵菌获得成功表达.将转化子接种菜青虫进行生物测定表明,组成性表达egfp不影响球孢白僵菌的毒力.进一步利用冰冻切片和荧光显微观察技术监测球孢白僵菌侵染寄主行为,结果显示,通过荧光观察可清楚的检测到病原菌在昆虫体表的附着、菌丝穿透体壁以及菌丝从寄主体内长出等侵染过程.由此表明,GFP可有效用于球孢白僵菌的遗传标记,进行病原菌的鉴别、侵染致病机理及相关功能基因的表达模式研究.【总页数】8页(P377-384)【作者】金凯;张永军;罗志兵;林健文;裴炎【作者单位】西南大学生物技术中心,农业部生物技术与作物品质改良重点实验室,重庆市农业生物技术重点实验室,重庆,400716;西南大学生物技术中心,农业部生物技术与作物品质改良重点实验室,重庆市农业生物技术重点实验室,重庆,400716;西南大学生物技术中心,农业部生物技术与作物品质改良重点实验室,重庆市农业生物技术重点实验室,重庆,400716;西南大学生物技术中心,农业部生物技术与作物品质改良重点实验室,重庆市农业生物技术重点实验室,重庆,400716;西南大学生物技术中心,农业部生物技术与作物品质改良重点实验室,重庆市农业生物技术重点实验室,重庆,400716【正文语种】中文【中图分类】Q93【相关文献】1.利用叶片真空侵染法表达外源蛋白GFP [J], 金太成;孟大伟;刘璐;廖艺红;张爽;罗佳尧;杨丽萍2.利用冷冻切片对球孢白僵菌侵染西花蓟马过程的观察 [J], 张志建;郑长英;赵川德;万方浩;王俊平3.球孢白僵菌生物学特性与其对不同昆虫侵染差异相关性分析 [J], 曹伟平;宋健;甄伟;王金耀;冯书亮;杜立新;4.球孢白僵菌生物学特性与其对不同昆虫侵染差异相关性分析 [J], 曹伟平;宋健;甄伟;王金耀;冯书亮;杜立新5.利用GFP表达系统检测雌激素类化合物的研究 [J], 雷卫祺;马海蓉;孙怡;曹旭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。