酶联免疫分析法探测 Cry1Ab蛋白在不同介质中的构象变化

酶联免疫分析法探测Cry1Ab蛋白在不同介质中的构象变化邬建敏1　奚凤娜1　叶庆富32　刘维屏31(浙江大学理学院化学系,杭州310027) 2(浙江大学原子核农业科学研究所,杭州310029)

3(浙江大学环境科学研究所,杭州310029)

摘　要　采用酶联免疫分析(ELISA)方法,根据构象变化后的蛋白与抗体结合能力下降从而导致ELISA测定值降低的原理,探测了转cry1Ab基因水稻表达的Cry1Ab蛋白在不同溶液介质中的热致构象变化行为,以及不同有机溶剂及溶液pH值对该蛋白构象变化的影响程度。实验表明,CrylAb蛋白在不同条件下的构象变化程度可以灵敏地通过ELISA方法检测。在不同的介质中,Cry1Ab蛋白的热致构象变化程度不同。在Na

2SO4

介质中,该蛋白具有较高的热稳定性;SDS的存在,可以促进该蛋白的构象变化。常温下,25%(V/V)的有机

溶剂乙腈、异丙醇、甲醇、乙醇均能使该蛋白的构象发生转变,其中以乙腈最为显著。醇类溶剂对Cry1Ab蛋白的构象影响程度随疏水性增大而增大;溶液pH值也对该蛋白的构象变化产生影响。pH在8～10之间,该蛋白构象能保持稳定;酸或过碱性的溶液均能使蛋白构象偏离原始状态,从而引起ELISA测定值的降低。另外,腐殖酸能在一定时间内保持Cry1Ab蛋白构象的稳定性。

关键词　酶联免疫分析,Cry1Ab蛋白,构象,转基因植物

　2004208226收稿;2005201224接受本文系国家自然科学基金资助项目(No.20277031和No.20177021

)

1　引 言cry1Ab基因是从苏云金杆菌(Bacillusthuringiesnis,Bt)中分离出来的一种能够表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt基因。转基因植物释放的外源基因及其表达产物对环境的影响备受关注[1,2]。外源基因表达的活性蛋白在离开植物体后会进入不同的环境介质中,致使该蛋白暴露于与其原来所存在的植物体内完全不同的环境中。大量文献报道表明,蛋白质在介质条件改变时,会引起其构象的改变而影响其生物活性[3,4]。Cry1Ab蛋白在生物体外的活性保持情况,也与其在相应的介质环　中构象的变化、降解等因素有关。目前蛋白质在溶液状态下的构象变化研究手段主要采用荧光光谱法[5]、圆二色谱(CD)法[6]和核磁共振法[7]等。然而这些光谱学方法研究蛋白质在溶液状态中的构象变化时,必须对目标蛋白进行高度纯化,而且一般需要在mg/L级以上才能满足光谱测定的灵敏度。采用单克隆抗体测定抗原蛋白的构象变化近年来已有少量报道[8],这种基于抗原构象改变引起其与抗体结合能力改变的酶联免疫分

析法(ELISA)具有灵敏高,研究对象不需纯化等优点。由这种方法所产生信号的探针不再是单一的氨基酸(如荧光法中以色氨酸作为内源荧光探针),而是蛋白质表面的抗原决定簇。蛋白质的构象变化势必会引起抗原决定簇的折叠状态变化,进而引起其与抗体结合能力的变化,最后以底物对这种构象变化的信号进行放大。根据这一原理,本实验采用ELISA法研究了不同温度及介质条件对Cry1Ab蛋白构象的影响,为进一步开展蛋白构象变化与生物活性的关系研究奠定了基础。

2　实验部分2.1　仪器及试剂SPECTRAMax100酶标分析仪(美国Sunnyvale公司);pH计(pHS210,杭州);天平(德国Sartorius公司)。Cry1Ab/AcELISA试剂盒(美国Envirologix公司);三羟甲基甲胺(Tris)、盐酸、乙醇、乙二醇、异丙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化钠、硫酸钠等试剂均为分析纯;甲醇和乙腈为色谱纯试剂。缓冲液B

(10×:100mmol/LTris2HClpH8.0+5mmol/LEDTA,用时稀释10倍并加NaCl至所需浓度)。实验

所用的Cry1Ab蛋白从转Cry1Ab基因水稻中提取,并经初步的纯化后得到[9,10],经ELISA测定,Cry1Ab

蛋白浓度为10mg/L。

第33卷2005年8月 分析化学(FENXIHUAXUE)　研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry 第8期1105～11082.2　实验方法2.2.1　ELISA法分析Cry1Ab蛋白在不同温度下及介质下构象变化　将4支装有200μL浓度为5μg/L的Cry1Ab蛋白溶液的微量离心管分别置于25℃、50℃、75℃、100℃4min,冷却至室温后立即取100μL注入酶联免疫试剂盒(EvirologixCorp.,USA)96孔板中,每孔均涂有Cry1Ab蛋白抗体,反应15min后,加入酶标一抗(过氧化氢酶标记),振荡后静置1h,用PBS+Tween20洗涤液洗去未结合的酶标一抗,然后加入底物显色,30min后加入1mol/LHCl终止液,用酶标仪在450nm的波长下测定每孔的吸光度值。按上述同样方法,分析在乙二醇、SDS、Na2SO4存在下,Cry1Ab蛋白在上述不同温度下的ELISA测定值。2.2.2　ELISA法分析Cry1Ab蛋白在不同有机溶剂存在下构象变化　在5支微量离心管中均加入250μL蒸馏水,20μL浓度为10mg/L的Cry1Ab蛋白溶液,并分别加入250μL的乙腈、乙二醇、异丙醇、甲醇及乙醇,最后用30mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液稀释至1mL。为考察蛋白构象变化程度与有机溶剂加入后反应时间的关系,将上述混合液取出100μL立即稀释50倍,另取100μL在25min后稀释50倍。各稀释液分别取样100μL按上述ELISA试剂盒分析程序进行分析。2.2.3　ELISA法分析Cry1Ab蛋白在不同酸度下构象变化　在4个微量离心管中均加入250μL蒸馏水,20μL浓度为10mg/L的Cry1Ab蛋白溶液,然后在各离心管中分别加入250μL的pH分别为2.0

HCl溶液,pH4.0的HAc2NaAc缓冲液以及pH为6.0、8.0的PBS缓冲液,并用3.0mmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液稀释至1mL,25min后取样并用Tris缓冲液(pH=8.0)稀释50倍。各稀释液分别取样100μL按上述ELISA试剂盒分析程序进行分析。另取一支离心管,加入1mg腐殖酸(HA),溶液pH用稀盐酸调至2,其它试液按上述相同方法加入,以考察HA存在下Cry1Ab蛋白构象在酸性条件下的稳定性。

3　结果与讨论3.1　Cry1Ab蛋白在不同温度下及介质下构象变化Cry1Ab蛋白在不同温度下的ELISA测定值,实验结果如图1所示。在各种介质下,ELISA分析值均随着温度的升高而降低。说明该蛋白在温度升高后构象变化而导致其与抗体结合能力降低。由于ELISA分析前溶液均冷却至室温,但其构象并未恢复至初始状态。说明了Cry1Ab蛋白的热致构象变化

　图1　不同介质中Cry1Ab蛋白ELISA

分析值随温度的变化曲线Fig.1　Variationofenzyme2linkedimmu2nosorbentassay(ELISA)valuesofCry1Abproteinindifferentmediumwiththetemperature1.Na2SO4;2.Tris2缓冲液(Tris2buffer);3.乙二醇(glycol);4.十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)。

的可逆性较低。Na2SO4对于Cry1Ab蛋白的构象具有一定的稳定作用,在各种温度下,其ELISA分析值均明显高于Tris缓冲液。这可能是由于在盐溶液中,蛋白质分子内部的疏水作用较强,而疏水作用是稳定蛋白质构象的主要作用力之一[11]。乙二醇对蛋白质的热致构象变化在小于75℃时并未有显著的作用;在高温下乙二醇对该蛋白的构象具有一定的保护作用。在SDS存在下,

ELISA分析值随温度上升后的降低幅度最为明显。在100℃时,已经完全失去与抗体结合的能力。可见SDS对该蛋白的构象变化具有显著的促进作用。这可能是由于SDS扰乱了蛋白质中氨基酸残基间的疏水作用,使其构象变化的活化能降低。杀虫活性实验结果表明,部分或完全失去免疫活性的Cry1Ab蛋白其杀虫活性也随之降低或消失,进一步证明了ELISA测定值的变化指示了该蛋白构象的变化。另外由于加热作用时间只有4min,可以排除这种免疫反应性的降低是蛋白质水解所致。3.2　Cry1Ab蛋白在不同有机溶剂存在下的构象变化蛋白质在有机溶剂中的构象变化主要是由于折叠(folding)在蛋白质内核的疏水性氨基酸经过去折叠过程(unfolding)暴露于蛋白质表面[12]。乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇等5种有机溶剂与Cry1Ab

蛋白作用不同时间后的ELISA分析结果如图2所示。该图纵坐标为Ai/A0表示变性蛋白的ELISA分析值(A

i)与同浓度原始Cry1Ab蛋白的ELISA值(A0

)之比。结果显示,各种有机溶剂存在下ELISA测定

6011 分析化学第33卷结果均显著降低,这与文献报道的许多蛋白质在有机溶剂中会发生不可逆的构象变化的结果一致。其　图2　Cry1Ab蛋白在不同有机溶剂中的ELISA分析值Fig.2　RelativeELISAvaluesofCry1Abproteinunfoldedbydiffer2entorganicsolventA.乙腈(acetonitrile);B.乙二醇(glycol);C.异丙醇(isopropanol);

D.乙醇(ethanol);E.甲醇(metha2nol)。

中乙腈对Cry1Ab蛋白的构象影响最为显著,而且反应很快,即使加入后立刻稀释,ELISA分析值也为0。醇类有机溶剂与Cry1Ab蛋白瞬间作用后的ELISA分析值按乙二醇、甲醇、乙醇、异丙醇顺序递减速,说明醇类有机溶剂对该蛋白的构象影响程度与溶剂的疏水性有关,溶剂的疏水性越大,其对Cry1Ab蛋白构象的影响越大,这一结果符合蛋白质在疏水环境下的构象变化机制,并与Cry1Ab蛋白在不同有机溶剂中的荧光光谱分析结果一致[13]。图2还表明Cry1Ab蛋白的构象变化程度与有机溶剂反应的时间有显著关系。反应25min后,该蛋白的ELISA测定值均有所下降,但下降的幅度各不相同,说明该蛋白在不同极性的有机溶剂作用下构象变化的动力学性质有所差异。在异丙醇存在下,蛋白构象的变化速率最快,其ELISA测定值仅为瞬时作用后ELISA值的1313%。在甲醇溶液中的变化速率最小,反应25min后的ELISA值为初始值的75.8%.可见ELISA分析法可以指示出蛋白质构象变化的动力学过程。3.3　溶液pH对Cry1Ab蛋白构象变化的影响　

　图3　pH对Cry1Ab蛋白ELISA

相对分析值的影响Fig.3　EffectofpHontherela2tiveELISAvaluesofCry1Abpro2tein