２０１９年第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀青海师范大学学报(自然科学版)J o u r n a l o fQ i n g h a iN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e )㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１９N o ４基金项目:青海省科技厅项目(２０１８－N K－１３３,２０１９－Z J －９８２Q );中国科学院 西部之光 人才计划;中国科学院种子创新研究院(６１７７３１２８)．收稿日期:２０１９－０９－１４作者简介:刘明慧(１９９４－),女,汉族,河北秦皇岛人,在读硕士研究生．研究方向:植物分子遗传育种．魏㊀乐(１９６４－),女,汉族,陕西西安人,教授,硕士研究生导师．研究方向:植物分子遗传育种．黄枸杞中调控花青素生物合成候选基因A N ２相关功能验证刘明慧１,２,席杏媛２,宗㊀渊２,曹㊀东２,刘宝龙２,魏㊀乐１(１．青海师范大学生命科学学院,青海西宁㊀８１０００８;２．青海省作物分子育种重点实验室,青海西宁㊀８１０００１)摘㊀要:花青素是一种存在于植物中的显色水溶性类黄酮化合物,具有较高的营养价值．黄枸杞果实中色素的大量积累与花青素生物合成代谢密切相关．前人研究发现M Y B 转录因子L r A N ２主要参与调控黑枸杞黑色果实中花青素生物合成代谢途径,而黄枸杞中花青素合成代谢的分子机理尚不明确．本研究利用同源克隆的方式分离黄枸杞A N ２基因,通过G a t e w a y 技术构建植物中过量表达A N ２载体P J AM １５０２:A N ２．利用农杆菌侵染的方式将A N ２基因转染到模式植物烟草中,得到紫色烟草表型．花青素含量测定发现烟草叶片中花青素含量最高,同时q P C R 验证检测出转基因烟草中花青素合成代谢途径中的结构基因都显著上调,其中结构基因A N S 最为明显．本研究发现黄枸杞中A N ２基因与黄枸杞黄色表型的形成密切相关,为黄枸杞的分子育种研究提供可靠的理论基础．关键词:花青素;黄枸杞;A N ２;烟草中图分类号:P ６４１．７４㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀㊀文章编号:１００１－７５４２(２０１９)０４－００６２－０５１㊀引言枸杞是茄科植物,在我国栽培比较广泛,大多分布于我国西北地区㊁东北地区㊁河北地区等．枸杞的价值体现在药用价值㊁林业价值㊁观赏价值以及食用价值等．枸杞根据花青素含量差异,可分为红枸杞㊁黑枸杞㊁黄枸杞等．黑枸杞是近年来发现的多年生抗旱耐盐性的野生枸杞,主要分布在西北部地区,已发现的花青素含量最高,药用㊁保健价值远远高于普通红枸杞[１]．红枸杞是我国传统药材,种植分布于西北部地区,最常见的红枸杞为宁夏枸杞和新疆枸杞[２]．黄枸杞是宁夏枸杞的变种[３],与红枸杞㊁黑枸杞的研究相比,还需要深入研究．花青素是广泛存在于植物中的一类水溶性天然色素,属类黄酮化合物,多以糖苷为主要存在形式,是植物中的显色物质,使植物不同组织呈现五彩缤纷的颜色．花青素具有抗氧化㊁抗炎抗菌㊁抗辐射㊁防癌㊁增强视力㊁改善睡眠㊁降血糖㊁抗变异㊁修复肌肤等药理作用[４－５]．花青素还是植物压力调节器,可保护植物免受外界环境的损害[７,８]等．花青素是植物次级代谢产物,它的合成途径属于类黄酮次生代谢途径的一个重要分支．花青素生物合成相关的转录因子主要有三类:M Y B 类转录因子㊁b H L H 类转录因子和WD ４０类转录因子,它们大多以M BW (M Y B －B H L H －WD ４０)转录因子三元复合体的形式存在,通过激活或抑制结构基因的时空表达来调控着整个花青素合成代谢通路,其中R ２R ３－M Y B 型转录因子是调控类黄酮途径的重要转录因子,数目最多,在模式作物中被大量的发现[９]．红枸杞是历史悠久的传统药材,含有氨基酸㊁枸杞多糖㊁黄酮㊁微量元素等,其中黄酮为主要活性成分,也是红枸杞质量的评价指标[２],已被广泛研究．黑枸杞是已发现的花青素含量较高的野生果实,具有很高的营养价值㊁药用价值和广阔的市场发展前景[１０]．黄枸杞中色素的大量积累与花青素生物合成有关,但黄枸杞中花青素合成代谢的分子机理尚不明确．本研究主要将黄枸杞A N ２基因在烟草中过量表达,分析黄枸杞A N ２基因对烟草花青素合成代谢的影响．３６第４期刘明慧,等:黄枸杞中调控花青素生物合成候选基因A N２相关功能验证２㊀实验方法２．１㊀黄枸杞R N A的提取及c D N A的合成将黄枸杞迅速通过液氮冷冻并充分研磨,使用A x y P r e p M u l t i s o u r c eT o t a lR N A M i n i p r e p K i t２５０－p r e p提取试剂盒对实验材料进行R N A的提取,用１％琼脂糖凝胶电泳检测提取的R N A,用核酸蛋白测定仪检测R N A的浓度．以提取的R N A为模板,参照F a s t K i n gg D N A D i s p e l l i n g R TS u p e r M i x第一链合成试剂盒说明书进行c D N A的合成．２．２㊀P C R扩增以上述c D N A样品为模板进行P C R扩增,采用５０u L体系,P C R反应条件:９８ħ２m i n,９８ħ１０s,５６ħ３０s,７２ħ２m i n,３５个循环,７２ħ１０m i n．P C R产物通过１％琼脂糖凝胶电泳检测．所用引物序列见表１:表１㊀引物序列表基因正向引物反向引物A T TB G GC A A G T T T G T A C A A A A A A G C A G G A C C A C T T T G T A C A A G A A A G C TL r M Y B a t t b A A A A A G C A G G C T T C A T G A T G A A A G A A A G C T G G G T C C T A A T T C A G T２．３㊀植物表达载体构建２．３．１㊀瞬时表达载体构建根据G a t e w a y克隆试剂盒说明书,进行B P反应,将目标基因A N２转入到中间载体p D O N R２０７中,构建入门载体p D O N R２０７:A N２;进行L R反应:将入门载体p D O N R２０７:A N２与瞬时表达载体P J AM１５０２重组,获得瞬时表达载体P J AM１５０２:A N２．２．３．２㊀农杆菌转化取出存储于－８０ħ冰箱中的农杆菌L B A４４０４感受态细胞,解冻．取２~５μL质粒加入到感受态细胞中,混匀,放置冰上５m i n,液氮５m i n,放入３７ħ水浴锅中水浴５m i n,冰上５m i n,然后迅速加入２００~４００μL无菌未加抗性的L B液体培养基,２８ħ摇床培养１~２h至浑浊,涂于K a n a＋R i f的平板上,２８ħ培养箱中培养２天．培养皿上挑取单菌落接种于K a n a＋R i f的液体培养基中,２８ħ摇床培养浑浊,P C R鉴定．２．４㊀农杆菌侵染烟草将剪取的野生型烟草叶子(完整的)进行清洗灭菌,用７５％酒精清洗３０s,d d H２O清洗４~５次,２％次氯酸钠清洗１０m i n,d d H２O清洗４~５次,然后将烟草放入培养皿中切割烟草叶成小块,再将叶子完全侵入农杆菌菌液中,滤纸吸干菌液后,将叶子背面朝下放入M S(６B A＋N A A)培养基,闭光培养２天,M S(６B A＋N A A＋c e f e)培养基培养７天,M S(K a n a＋６B A＋N A A＋c e f e)培养基培养１４天,M S(K a n a＋N A A＋c e f e)培养基培养至生根．２．５㊀花青素含量检测分别称取０．１g转基因烟草的根㊁茎㊁花㊁叶㊁种子,放入２．０m l离心管中,液氮冷冻后,使用高通量组织研磨仪研碎,然后加入２．０m l０．１％盐酸,３２ħ水浴１６~１８h,用分光分度计测得A５３０㊁A６５７的数值,再用花青素含量计算公式:Q＝(A５３０－０．２５ˑA６５７)/０．１[１１],得到转基因烟草的根㊁茎㊁花㊁叶㊁种子的花青素含量．２．６㊀q P C R以微管蛋白基因A c t i n为内标基因,使用q P C R验证枸杞A N２基因在烟草转基因和野生型的根㊁茎㊁花㊁叶㊁种子部位的表达量,验证A N２基因转基因与野生型之间的差异．q P C R反应条件,S t a g e１(预变性):９５ħ３０s,S t a g e２(P C R反应):９５ħ变性５s,５７ħ退火３４s,４０个循环,S t a g e３:９５ħ１５s,５７ħ１m i n,９５ħ１５s．每个样本设置３个重复,取C t平均值进行计算．所用引物序列见表２:４６青海师范大学学报(自然科学版)２０１９年表２㊀引物序列表基因N C B I序号正向引物反向引物N b C H S E F４２１４３２A G A A A A G C C T T G T G G A A G C A A C T T G G T C C A A A A T T G C A G GN t C H I A B２１３６５１G A A A T C C T C C G A T C C A G T G A C A A C G T T G A C A A C A T C A G G CN t F３H A B２８９４５０．１A C A G G G T G A A G T G G T C C A A G C C T T G G T T A A G G C C T C C T T CN t F３ H A B２８９４４９．１T C C A A G A A T A C T G G C C C A A G C T C A C A A C T C T C G G A T G C A AF３ ５ H F J７０５８４５．１T T G T G G A T G G C G A A T G A G T T G G A T G T C G A A A T C A A A G C T TN t D F R E F４２１４３０．１T C C C A T C A T G C G A T C A T C T A A T G G C T T C T T T G T C A C G T C CN t A N S A B２８９４４７T G G C G T T G A A G C T C A T A C T G T T T C A A G G G T G T C C C C A A T AA c t i n G Q２８１２４６．１A A T G A T C G G A A T G G A A G C T G T G G T A C C A C C A C T G A G G A C A３㊀实验结果３．１㊀R N A取２μL R N A与３μL L o a d i n g B u f f e r混合均匀,并通过１％琼脂糖凝胶电泳检测R N A(图１)．图１㊀黄枸杞R N A图２㊀P J AM１５０２:A N２载体结构示意图３．２㊀植物表达载体构建３．２．１㊀载体构建利用G a t e w a y克隆技术,构建瞬时表达载体P J AM１５０２:A N２(图２)．３．２．２㊀表型观察通过表型观察,转基因烟草的叶㊁茎㊁根㊁花等组织或器官都有明显的花青素的积累,而野生型植物的相图３㊀烟草转基因型与野生型的表现比较第４期刘明慧,等:黄枸杞中调控花青素生物合成候选基因A N２相关功能验证应组织呈现为绿色．野生型与转基因型相比,叶片颜色加深,有紫有绿,种子与茎秆颜色变为全紫,花的花瓣与花蕊颜色加深,变成紫色,对比图３所示．３．３㊀花青素含量测定剪取转基因烟草的根㊁茎㊁花㊁叶㊁种子,通过分光分度计测得A５３０㊁A６５７的数值,再用花青素含量计算公式得到转基因烟草的根㊁茎㊁花㊁叶㊁种子的花青素含量,结果显示,烟草叶片中花青素含量最高,如图４所示．３．４㊀结构基因表达量分析结果表明转基因型中花青素合成代谢的结构基因C H S㊁C H I㊁F３H㊁F３ H㊁F３ ５ H㊁D F R㊁A N S等基因的表达量明显比野生型高,其中A N S表达量最高,为１２６．８５４,D F R为１０８．０４８,A N２为２３．５５１,C H S为１２．０３６,如图５所示．图４㊀转基因烟草花青素含量比对图图５㊀结构基因的表达量比对图４㊀讨论用核酸蛋白测定仪检测R N A的浓度,测得R N A浓度为７５０n g/μL㊁１３００n g/μL,R N A提取质量较高,为后续实验提供基础．植物表达载体构建主要是通过B P和L R反应进行基因重组,得到瞬时表达载体P J AM１５０２:A N２．在植物表达载体构建中选取P J AM１５０２载体,是由于P J AM１５０２载体含有３５s启动子,３５s启动子属于强启动子,几乎能够启动所有植物中的基因转录,并有效提高外源基因的表达水平．瞬时表达载体P J AM１５０２:A N２中A N２基因在３５s启动子下游,使得该表达载体能够正常运行．通过表型观察发现,烟草在幼苗期可能由于花青素的合成受到光诱导影响,颜色变化不明显．待烟草植株成熟后,根部长期在土壤里,也会由于光诱导影响花青素的积累,使得颜色变化不明显,而其他部位的颜色有了明显的差异,叶片有紫有绿,花的花瓣㊁花蕊变紫,根和茎颜色全变紫,说明黄枸杞A N２基因激活了烟草的花青素合成代谢途径．花青素合成代谢中含有结构基因与调节基因两类基因,基因调控可能会使某些关键结构基因的表达上调或下调,从而直接影响花青素的积累[１２]．q P C R验证检测出转基因型烟草中花青素合成代谢途径的结构基因都显著上调,其中C H S㊁A N S㊁D F R的表达明显上调,A N S基因表达量最高,可能是因A N２基因激活了A N S基因在花青素合成代谢中的表达,而F３H㊁F３ ５ H无明显变化．研究结果表明,黄枸杞A N２基因调控花青素合成代谢的水平比黑枸杞A N２基因的调控水平低,黄枸杞果实表型为黄色,果实色素的大量积累与花青素生物合成代谢密切相关,但关于黄枸杞中花青素合成代谢的研究尚不透彻,还有待进一步研究．５㊀结论利用同源克隆方法分离出黄枸杞中调控花青素生物合成A N２基因,通过G a t e w a y技术构建瞬时表达５６６６青海师范大学学报(自然科学版)２０１９年载体P J AM１５０２:A N２,并利用农杆菌侵染的方式将A N２基因转染到模式植物烟草中,结果得到紫色表型,说明黄枸杞A N２基因能够调控烟草的花青素合成．参考文献:[１]㊀李进．黑果枸杞色素研究[D]．上海:华东师范大学,２００６:２１－３２．[２]㊀张璟,郭晔红,师建玲,丁小琴,李欠,陈垣．黑果枸杞和红果枸杞的比较[J]．农业科技与信息,２０１８,(１０):４２－４４＋５２．[３]㊀秦国峰．枸杞属植物的一个新变种:黄果枸杞[J]．宁夏农业科技,１９８０,(１):２１－２３．[４]㊀韩海华,梁名志,王丽,等．花青素的研究进展及其应用[J]．茶叶,２０１１,３７(４):２１７－２２０．[５]㊀侯锐,陈琦,王利,等．花青素及其生物活性的研究进展[J]．现代生物医学进展,２０１５,１５(２８):５５９０－５５９３．[６]㊀B e l k a c e m iA,R a m a s s a m y C．A n t h o c y a n i n s p r o t e c tS K－N－S H c e l l sa g a i n s ta c r o l e i n－i n d u c e dt o x i c i t y b yp r e s e r v i n g t h ec e l l u l a r r e d o x s t a t e[J]．JA l z h e i m e r sD i s,２０１６,５０(４):９８１－９９８．[７]㊀李莹,高振蕊,张驰,等．花青素合成途径中分子调控机制的研究进展[J]．生态学杂志,２０１５,３４(１０):２９３７－２９４２．[８]㊀KJM,C h i aLS,G o hN K,e t a l．A n a l y s i s a n db i o l o g i c a l a c t i v i t i e s o f a 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t s,w h i c hh a sh i g hn u t r iＧt i o n a l v a l u e．T h e a c c u m u l a t i o n o f p i g m e n t s i nL y c i u mb a r b a r u mL f r u i t i s c l o s e l y r e l a t e d t o a n t h o c y a n i nb iＧo s y n t h e s i s a n dm e t a b o l i s m．P r e v i o u s s t u d i e s h a v e f o u n d t h a t M YB t r a n s c r i p t i o n f a c t o r L r A N２i sm a i n l y i nＧv o l v e d i n r e g u l a t i n g t h e p a t h w a y o f a n t h o c y a n i nb i o s y n t h e s i s a n dm e t a b o l i s mi nb l a c k f r u i t s o f L y c i u mr uＧt h e n i c u m M u r r,w h i l e t h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f a n t h o c y a n i n b i o s y n t h e s i s a n dm e t a b o l i s m i nL y c i u mb a rＧb a r u m L i s s t i l l u nc l e a r．I nt h i s s t ud y,t he A N２g e n eo fL y c i u m b a r b a r u m L w a s i s o l a t e db y h o m o l o g o u sc l o n i n g,a nd t he o v e r e x p r e s s i o nv e c t o r P J AM１５０２:A N２i n p l a n t sw a s c o n s t r u c t e db y G a t e w a y t e c h n i q u e．T h e A N２g e n ew a s t r a n sf e c t e d i n t om o d e l t o b a c c ob y Ag r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s,a n dth e p u r p l e p h e n oＧt y p ew a s o b t ai n e d．T h e c o n t e n t o f a n t h o c y a n i n i n t o b a c c o l e a v e sw a s t h eh i g h e s t,a n d t h e s t r u c t u r a l g e n e s i n a n t h o c y a n i nb i o s y n t h e s i s a n dm e t a b o l i s m p a t h w a y i n t r a n s g e n i c t o b a c c ow e r e s i g n i f i c a n t l y u p－r e g u l a t e d b yq P C R,a m o n g w h i c hs t r u c t u r a l g e n e s A N S w a s t h em o s to b v i o u s．T h es t u d y f o u n dt h a t A N２g e n e i n L y c i u mb a r b a r u m Lw a s c l o s e l y r e l a t e d t o t h e f o r m a t i o no f y e l l o w p h e n o t y p eo fL y c i u m b a r b a r u m La n d p r o v i d e d a r e l i a b l e t h e o r e t i c a l b a s i s f o rm o l e c u l a r b r e e d i n g o fL y c i u mb a r b a r u m L．K e y w o r d s:a n t h o c y a n i n;l y c i u mb a r b a r u m L;A N２;t o b a c c o。
