依维莫司对大鼠嗜铬细胞瘤裸鼠移植瘤的抑制作用

２５４　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｕｒｏｌ，Ｖｏ１．１９　Ｎｏ．４　Ａｐｒ．２０１４　・基础研究・　文章编号：１００９—８２９１（２０１４）０４—０２５４—０５　依维莫司对大鼠嗜铬细胞瘤裸鼠移植瘤的抑制作用　朱　奇，祝　宇，徐云泽，陈东宁，徐烈雨，张种宇，赵菊平，吴瑜璇，沈周俊，宁　光　（上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科，上海２０００２５）　

Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｍｐｌａｎｔｅｄ　ｒａｔ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏ。　ｍａ　ｉｎ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ　ＺＨＵ　Ｑｉ，ＺＨＵ　Ｙｕ，ＸＵ　Ｙｕｎ—ｚｅ，ＣＨＥＮ　Ｄｏｎｇ—ｎｉｎｇ，ＸＵ　Ｌｉｅ—ｙｕ，ＺＨＡＮＧ　Ｃｈｏｎｇ—ｙｕ，ＺＨＡＯ　Ｊｕ—ｐｉｎｇ，ＷＵ　Ｙｕ—ｘｕａｎ，ＳＨＥＮ　Ｚｈｏｕ—ｉ　ｕｎ，ＮＩＮＧ　Ｇｕａｎｇ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｒｕｉｊｉｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００２５，　Ｃｈｉｎａ）　

ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｍｐｌａｎｔｅｄ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ　ｉｎ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ，ａｎｄ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｖｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ａｎｇｉｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｏｆ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ　ｘｅｎｏｇｒａｆｔ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｃｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｐｌａｎｔｉｎｇ　ＰＣ１　２　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｅｆｔ　ｆｌａｎｋ　ｏｆ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ．Ａｆｔｅｒ　１　５　ｄａｙｓ，ｔｈｅ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ：ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ　ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ　ｂｙ　ｇａｖａｇｅ　ａｔ　ａ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　５　ｍｇ／ｋｇ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＮＳ　ｂｙ　ｇａｖａｇｅ　ａｔ　ａ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　１０　ｍＬ／ｋｇ）．Ａｆｔｅｒ　３　ｗｅｅｋｓ’ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｖｏｌｕｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　４ｔｈ　ｗｅｅｋ．Ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｉｓ　ｔｉｍｅ，ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｖｏｌｕｍｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｔｉｍｅ　ｗａｓ　ｒｅｃｏｒｄｅｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓ—　ｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　３（ＳＴＡＴ３）ａｎｄ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ｗｅｒｅ　ｄｅ—　ｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｉｎ　ｔｈｅ　４　ｗｅｅｋ．ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｓｉｚｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ（１　５０６．０１±３５２．６９）ｍｍ　，ｗｈｉｌｅ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ（４　３４０．６７士７９４．０７）ｍｍ。．Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｓｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ａ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ（３７．８±４．６）ｄａｙｓ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ（２５．３±２．４）ｄａｙｓ，ｗｉｔｈ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅｓｅ　ｄａｔａ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＳＴＡＴ３　ａｎｄ　ＶＥＧＦ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｉｓｓｕｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ％０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ　ｈａｓ　ａ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｐｈｅ０ｃｈｒｏｍ０ｃｙｔｏｍａ　ｉｎ　ｎｕｄｅ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＳＴＡＴ３　ａｎｄ　ＶＥＧＦ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ．　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ；ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　３；ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ　

摘要：目的本研究通过观察哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）抑制剂依维莫司对大鼠嗜铬细　胞瘤裸鼠移植瘤生长的影响，探讨依维莫司对大鼠嗜铬细胞瘤肿瘤生长和血管生成的抑制作用。方法　用大鼠嗜铬细胞瘤细胞　ＰＣ１２接种于裸鼠皮下，建立移植瘤模型，１５　ｄ后将荷瘤裸鼠随机分为２组，每组ｌ２只，分别为实验组（依维莫司灌胃５　ｍｇ／ｋｇ）　和对照组（生理盐水灌胃１０　ｍＬ／ｋｇ），用药３周，第４周后测量裸鼠移植瘤的体积变化以及裸鼠的生存时间，采用免疫组化方法　检测肿瘤组织中信号转导和转录活化因子３（ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　３，ＳＴＡＴ３）、血管内皮生长因子　（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）的表达，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测肿瘤组织中ＳＴＡＴ３、ＶＥＧＦ的表达。结果　第　４周时，对照组的移植瘤体积为（４３４０．６７±７９４．０７）ｍｍ。，实验组的移植瘤体积为（１　５０６．０１±３５２．６９）ｍｍ。，两组移植瘤体积存在　显著统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。对照组的平均生存时间是（２５．３±２．４）ｄ，实验组的平均生存时间是（３７．８±４．６）ｄ，用Ｋａｐｌａｎ—　Ｍｅｉｅｒ，Ｌｏｇ－Ｒａｎｋ方法分析两组的生存函数的差异有统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５）。实验组肿瘤组织的ｓ　ｒ　３，ＶＥＧＦ表达明显低于对　照组（Ｐ＜Ｏ．０５）。结论依维莫司对大鼠嗜铬细胞瘤裸鼠移植瘤有明显抑制作用，并可降低肿瘤组织中ＳＴＡＴ　３和ＶＥＧＦ的表达。　关键词：恶性嗜铬细胞瘤；信号转导和转录活化因子３（ＳＴＡＴ３）；血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）；依维莫司　中图分类号：Ｒ７３７．１　文献标志码：Ａ　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９—８２９１．２０１４－０４—０１５　

收稿日期：２０１３－１１－１１　修回日期：２０１３—１２—３Ｉ　基金项目：国家自然科学基金（Ｎｏ．８１２７２９３６）；上海市科委医学引导项目（Ｎｏ．１３４１１９ａ２７００）　通讯作者：祝宇，主任医师，硕士生导师．Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｙｙｙｈｙｑ＠１２６．ｃｏｒｎ　作者简介：朱奇（１９８７一），男（汉族），硕士研究生．研究方向：肾上腺肿瘤．Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｕｑｉｌ９８７１１１６＠１２６．ｃｏｒｎ　网络出版时间：２０１４—０１－１４　网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／Ⅵｗ　ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３７４．Ｒ．２０１４０１１４．１８４７．００４．ｈｔｍｌ　

ｈｔｔｐ　ｔ　ｆｆ　ｗｗｗ　ｚｇｍｎｗｋ．ｃｏｍ　现代泌尿外科杂志　２０１４年４月第１９卷第４期　肾上腺嗜铬细胞瘤属于神经内分泌肿瘤，源于肾　上腺髓质，可分泌儿茶酚胺，临床表现为阵发性高血　压、头痛和心悸等；其中恶性肿瘤的发病率在１Ｏ　左　右，５年生存率在４０　左右口］。良性嗜铬细胞瘤一般　采取手术切除，恶性嗜铬细胞瘤采用手术治疗很难达　到痊愈，目前分子靶向治疗成为治疗恶性嗜铬细胞瘤　的研究热点。　哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍＴＯＲ）信号通路的　过度活化与肿瘤的发生、发展密切相关ｌ＿２］。既往研究　表明：ｍＴＯＲ在恶性嗜铬细胞瘤瘤表达高于良性嗜　铬细胞瘤和正常。肾上腺组织，并且ｍＴＯＲ的表达与　肿瘤的预后有关　］。依维莫司作为ｍＴＯＲ的靶向抑　制剂，对多种肿瘤具有抑制作用，现已用于临床治疗　晚期肾癌　］。已有研究发现在细胞水平，ｍＴＯＲ抑　制剂对嗜铬细胞瘤细胞的增殖有抑制作用，可诱导其　凋亡［５］。而在动物研究方面，尚未有相关文献报道。　本研究通过对依维莫司在大鼠嗜铬细胞瘤细胞　裸鼠移植瘤上的应用，观察其对肿瘤生长的作用，检　测依维莫司对嗜铬细胞瘤的ＳＴＡＴ３和ＶＥＧＦ表达　的影响，探讨其可能的作用机制。　１材料与方法　１．１　材料　１．１．１　动物　２４只ＢＡＬＢ／ｃ／ｎｕ／ｎｕ裸小鼠购自上　海中科院，在无特殊致病原（ｓｐｅｃｉａｌ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｆｒｅｅ，　ＳＰＦ）实验动物屏障环境中繁育，雌性，５周，体重１４　～１６　ｇ，分笼饲养（每笼４只）。实验在ＳＰＦ环境下进　行。实验前１周购人裸鼠，使其适应新环境。　１．１．２　实验试剂　大鼠嗜铬细胞瘤细胞ＰＣ１２（由上　海瑞金医院神经内科实验室惠赠）。抗大鼠ＶＥＧＦ、　ＳＴＡＴ３抗体购自美国Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司，依维莫司购　自瑞士诺华公司。　１．２方法　１．２．１细胞培养及模型建立将ＰＣ１２细胞置于含　１０　小牛血清（体积分数）的ＤＭＥＭ培养液中，在　５　ＣＯ　（体积分数）恒温孵育箱中培养，常规传代，　收集体外培养的ＰＣ１２细胞，使细胞含量为１×１Ｏ　个／Ｌ，将０．１　ｍＬ的细胞液注入裸鼠腋窝皮下，每天　观察１次，每３　ｄ测量肿瘤大小，用游标卡尺测量肿　瘤３个互相垂直的直径，包括皮肤厚度在内，带入公　式计算肿瘤体积（体积公式为　一１／２ａｂｃ，ａ、ｂ、Ｃ分别　为肿瘤的长、宽、厚径）。肿瘤平均在注射后１Ｏ～１５　ｄ　出现。　１．２．２　实验分组待肿瘤生长到５０～１００　ｍｍ。，随　机数字表法将实验鼠随机分为实验组和对照组，每组　１２只。实验组每次依维莫司灌胃５　ｍｇ／ｋｇ，对照组　每次生理盐水灌胃１０　ｍＬ／ｋｇ，均为３次／周，连续３　周。期间观察肿瘤生长及体积变化，记录小鼠的生存　时间。　１．２．３取材固定　给药疗程完成后第１周，麻醉处　死小鼠，获取整个肿瘤，去除包膜、血液后，一部分标　本固定于４　甲醛（体积分数）中，石蜡包埋后行连续　切片，ＳＴＡＴ３、ＶＥＧＦ相关抗原免疫组化染色，检测　肿瘤组织中ＳＴＡＴ３、ＶＥＧＦ的表达情况，另一部分保　存于～２０℃冰箱中，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测肿瘤组织　的ＳＴＡＴ３和ＶＥＧＦ的表达。　１．２．４免疫组化检测肿瘤组织中ＳＴＡＴ３和ＶＥＧＦ　表达　石蜡切片经二甲苯脱蜡后，用３　Ｈ　Ｏ　（体积　分数）抑制过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）洗涤３　次，滴加１　山羊血清（体积分数），常温下孵育１Ｏ　ｍｉｎ以阻断非特异性反应，分别滴加ＳＴＡＴ３抗体　（工作浓度１：２０Ｏ），ＶＥＧＦ抗体（工作浓度１：１５０），　湿盒中４℃过夜，ＰＢＳ洗涤３次，滴加二抗（ＤＡＫＯ　公司Ｅｎｖｉｓｉｏｎ　ＴＭ　ＩｇＧ试剂盒），３７℃孵育３Ｏ　ｍｉｎ，　ＰＢＳ洗涤３次，二氨基联苯胺（ＤＡＢ）显色，苏木精复　染，脱水，透明，封片，显微镜下读片、拍照。用０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳ代替一抗作空白对照，用非免疫血清代　替一抗作阴性对照。免疫组化染色结果判定：　ＳＴＡＴ３以肿瘤细胞的胞质中出现棕黄色颗粒为染色　阳性，ＶＥＧＦ以肿瘤细胞的胞质中出现棕黄色颗粒为　染色阳性。　１．２．５　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测ＳＴＡＴ３、ＶＥＧＦ表达　用　ＰＢＳ缓冲液清洗组织２遍，剪去部分组织，称重，用１　：ＩＯＲＡＰＩ蛋白抽提液提取组织蛋白。１０　ｍｇ组织　加入１００　Ｌ蛋白提取液，在匀浆器内研磨，转移到２　ｍＬ　ＥＰ管中，用ＢＳＡ法测定蛋白质浓度，调整蛋白　浓度。取蛋白样品到１Ｏ　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ中电泳，转膜　后在５０　ｇ／Ｌ脱脂奶粉中室温下封闭１　ｈ，加一抗　ＳＴＡＴ３（１：１　５００），ＶＥＧＦ（１：１　０００）、８一ａｃｔｉｎ（１：　１　０ｏ０）到５０　ｇ／Ｌ脱脂奶粉中４＂Ｃ过夜，ＴＢＳＴ洗涤３　次后与５０　ｇ／Ｌ脱脂奶粉的ＴＢＳＴ稀释的二抗（０．２　ｇ／Ｌ）１　ｈ，机器显影。　１．３统计学方法　采用ＳＰＳＳ　１３．０软件进行统计学　分析，计量资料以均数±标准差（ｚ±ｓ）表示，２组移　植瘤体积、蛋白表达组间比较采用两独立样本的ｔ检　验，免疫组化结果用Ｆｉｓｈｅｒ’Ｓ确切概率分析，生存分　析用Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ，Ｌｏ　Ｒａｎｋ方法分析。