耐药细胞株构建实验

依西美坦与低剂量甲氨蝶呤对依西美坦耐药人乳腺癌细胞的协同效应及逆转耐药机制居伶俐;袁媛;潘跃银【摘要】Objective To investigate the combined effect of exemestane and low-dose methotrexate on exemestane-resistant MCF-7 human breast cancer cells( MCF-7/EXE). Methods Antiproliferative effects of exemestane and low-dose of methotrexate, alone and in combination on growth of MCF-7/EXE cells were assessed by using the MTT assay. Synergistic interaction between the two drugs was evaluated in vitro by using the combination index ( CI) method. The cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry in a half inhibitory concentration of exemestane and low-dose of methotrexate . The changes of apoptosis on MCF-7/EXE cells exposed to two drugs alone or in com-bination were observed by fluorescence microscope. The expression of Bcl-2,AKT,P-AKT and cyclooxygenase-2 was investigated by Western blot. Results MTT assays indicated that the combination treatment apparently decreased the viability of MCF-7/EXE cells compared to single drug treatment (CI<0. 9). In addition, the combination of exemestane and low-dose methotrexate exhibited a synergistic inhibition of cell proliferation, arrested the cell cycle in the S phase significantly and produced a stronger inhibitory effects onP-AKT, Bcl-2 and cyclooxygenase-2 ex-pression than control or individual drug treatment. Conclusion The combination of the two inhibitors significantly increases the response as compared to single agent treatment,suggesting that combination treatment which can re-verse the resistance of exemestane could be a more effective approach to breast cancer.%目的研究依西美坦( EXE )与低剂量甲氨蝶呤( MTX)对依西美坦耐药人乳腺癌 MCF-7细胞( MCF-7/EXE)的增殖抑制作用及意义。

人肝癌多药耐药细胞系 Bel-7402／DOX 两种模型比较钟兴国;龚仁华;孙登群;曹葆强;范育林;姜世涛;蔡军;何新苗;骆会来【摘要】目的：比较体外浓度梯度递增诱导和裸鼠肝脏移植诱导两种方法建立人肝癌多药耐药细胞系Bel-7402/多柔比星（ Doxorubicin ，DOX）模型的生物学特性。

方法分别采用体外浓度梯度递增诱导和裸鼠肝脏移植诱导建立人肝癌多柔比星多药耐药细胞亚系Bel-7402/DOXV 和Bel-7402/DOXL 后，利用相差显微镜观察细胞，MTT法检测两种细胞的耐药性，细胞计数法绘制生长曲线并用公式法计算倍增时间，流式细胞仪测定细胞DOX的摄入和外排以及P糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、谷胱甘肽硫转酶系统（GSH/GST）的表达。

结果两组耐药细胞Bel-7402/DOXV 和Bel-7402/DOXL 对DOX、CD-DP均产生了交叉耐药性，较亲本Bel-7402 IC50值差异有统计学意义（P＜0．01）；较亲本细胞的倍增时间明显延长，分别为65 h和46 h；较亲本的DOX外排率明显升高，分别为81．06％、66．56％；两组耐药细胞P-gp、MRP表达较亲本细胞显著提高（ P＜0．01），而GSH/GST的表达无明显变化。

结论两种方法建立的耐药细胞系模型均有稳定的耐药性。

肝脏移植法更能高度模拟人肝癌，它是具有近似人肝癌生物学和抗癌药物动力学特征的较理想模型。

%Objective To compare the biological characteristics of two types of human hepatocellular carcinoma multi -drug re-sistant cell sub-lines Bel-7402/DOX models established by two methods .Methods We established human hepatocellular carcinoma doxorubicin multi-drug resistant cell sub-lines models Bel-7402/DOXV and Bel-7402/DOXL by in vitro concentration gradient in-creased induction and nude mice liver-implanted induction , respectively .Phase contrast microscopy was used to observe the cells and MTT ( methyl thiazolyltetrazolium ) method was used to detect drug resistance of the two different sub-lines of cells .The ingestion and excretion of cellular doxorubicin (DOX) and the expression of P-glycoprotein (P-gp), multi-drug resistance-sociated protein (MRP) and glutathione S-transfer enzyme system ( GSH/GST ) were detected by flow cytometry .Results The Bel-7402/DOXV and Bel-7402/DOXL generated cross-resistance to DOX and CDDP ( cis-Diaminedichloroplatinum ) , they showed a significant difference in re-sistance to Bel-7402 IC50 value (P<0.01).The doubling times were significantly extended , compared with the parent cell line (39 h) , and were 65 h ( Bel-7402/DOXV) and 46 h ( Bel-7402/DOXL) .The excretion rates of DOX were significantly increased , com-pared with the parent cell (34.14%) line and were 81.06%(Bel-7402/DOXV) and66.56%(Bel-7402/DOXL).Expressions of P-gp and MRP in the two groups of resistant sub-lines cells were significantly enhanced (P<0.01).There was no significant variation in the expression of GSH/GST (P>0.05).Conclusions Stable resistance is involved in the resistant cell line model established by the two methods above .Liver implantation is a good simulation of human hepatocellular and proves to be an ideal model with characteristics similar to human hepatocellular biology and the pharmacokinetics of anticancer drugs .【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2014(000)007【总页数】5页(P728-732)【关键词】肝癌;多药耐药;多柔比星;细胞系模型【作者】钟兴国;龚仁华;孙登群;曹葆强;范育林;姜世涛;蔡军;何新苗;骆会来【作者单位】230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科;230041 合肥，武警安徽总队医院普外科【正文语种】中文【中图分类】R735.7目前对于肝癌，尤其是对中晚期肝癌的治疗仍以手术及化疗相配合治疗为主。

分类号 学号 M201075292 学校代码 10487 密级硕士学位论文结肠癌5-Fu耐药株的建立及其生物学特性和相关耐药机制的探索学位申请人：张小明学科专业：外科学（普外）指导教师：马建华 副教授答辩日期：2013年5月A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirementsfor the Degree of Master of Medicine Establishment of 5-Fu drug resistant colon cancer cell line and the exploration of its biological characteristics and the related drug-resistant mechanismsCandidate : Zhang XiaomingMajor : General SurgerySupervisor : Prof. Ma JianhuaHuazhong University of Science and TechnologyWuhan, Hubei 430074, P. R. ChinaMay, 2013华中科技大学硕士学位论文独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。

尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。

对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。

学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

mTOR信号通路介导产生XCL1可促进乳腺癌耐药细胞株的增殖白玉盘;杨小利;欧周罗【摘要】背景与目的：统计表明90%以上肿瘤患者的死亡与肿瘤耐药相关，而在乳腺癌中常见PI3K/Akt/mTOR信号通路的异常激活，以此通路为靶点的药物已成为乳腺癌治疗的研究热点。

本研究主要分析C族趋化因子配基1(C chemokine ligand 1，XCL1)对乳腺癌耐药细胞增殖的影响及其产生机制。

方法：建立吉西他滨耐药性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231/Gem。

采用CCK8检测MDA-MB-231和MDA-MB-231/Gem的增殖能力，RT-PCR、ELISA检测2株细胞株XCL1表达差异，Western blot检测mTOR的表达。

结果：与MDA-MB-231相比，MDA-MB-231/Gem的增殖能力增强，XCL1在耐药细胞株表达增强。

mTOR在耐药细胞株表达水平及磷酸化水平增强。

在MDA-MB-231中加入外源性XCL124 h后，细胞增殖能力增强。

而在MDA-MB-231/Gem中加入抗XCL1抗体后，细胞增殖能力降低。

mTOR抑制剂处理MDA-MB-231/Gem后，细胞增殖能力降低，XCL1产生减少。

结论：趋化因子XCL1的分泌可促进乳腺癌耐药细胞的增殖并由mTOR信号通路介导产生。

%Background and purpose: More than 90% of cancer patients are incurable because of drug resistance. Activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in breast cancer, as a target for chemotherapy drugs has become a hot topic of breast cancer treatment. This study aimed to investigate the effect and mechanism of XCL1 on the proliferation of drug-resistant breast cancer cell, whether is related with the mTOR signaling pathway. Methods:Established gemcitabine-resistant breast cancer cell lines (MDA-MB-231/Gem). CCK8to detect the proliferation of MDA-MB-231 and MDA-MB-231/Gem, RT-PCR and ELISA to determine the XCL1 expression level of the two cell lines, Western blot to detect the expression of mTOR. Results:Compared with MDA-MB-231, MDA-MB-231/Gem showed an enhanced proliferative capacity. The expression of XCL1 was increased in the resistant cell lines. Both of protein level and phosphorylation level of mTOR increased in drug-resistant cell lines. The MDA-MB-231 added exogenous XCL1 for 24 h, showed an enhanced cell proliferation. Adding anti-XCL1 antibodies in MDA-MB-231/Gem could reduce cell proliferation and treating MDA-MB-231/Gem with the mTOR inhibitor could also reduce cell proliferation, as well as the XCL1 expression level. Conclusion:XCL1 promotes the proliferation of drug-resistant breast cancer cells mediated by activation of the mTOR pathway.【期刊名称】《中国癌症杂志》【年(卷),期】2014(000)010【总页数】7页(P770-776)【关键词】MDA-MB-231/Gem;趋化因子配基1;mTOR;乳腺癌【作者】白玉盘;杨小利;欧周罗【作者单位】复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，复旦大学乳腺研究所，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032;复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，复旦大学乳腺研究所，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032;复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，复旦大学乳腺研究所，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032【正文语种】中文【中图分类】R737.9恶性肿瘤已成为人类的第一杀手，严重危害人类的生命健康。

耐药细胞株的筛选
一种是脂质体转染后，单克隆筛选稳定细胞株。

另外一种是应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。

脂质体转染：在转染24小时后，消化XXX细胞并计数。

将细胞种到96孔板，保证每个孔2-3个细胞，这样才能得到单克隆。

待细胞贴壁后，加入抗生素筛选。

筛选时间和浓度视细胞而定。

一般G418（Geneticin,遗传霉素）作用一个星期，嘌呤霉素作用2-3天。

脂质体法筛单克隆时间较长，且效率低，大概只有1%。

慢病毒转染：先要用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，再用病毒转染目的细胞。

包装病毒视不同类型的病毒而定，一般要3-5天的时间。

包装好的病毒要测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。

转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。

综述肿瘤的多药耐药及其逆转剂研究进展安徽省肿瘤医院桂留中化疗仍是恶性肿瘤的重要治疗手段之一，然而肿瘤细胞的耐药常使化疗最终失败。

根据肿瘤细胞的耐药特点，耐药可分为原药耐药（Primary drug resistance,PDR）和多药耐药（Multidrug resistance ,MDR）。

PDR只对诱导药物产生耐药而对其他药物不产生交叉耐药性，如抗代谢药类；MDR 则是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药产生抗药性的同时，对其他结构和作用机制不同的抗肿瘤药产生交叉耐药性。

MDR的表现十分复杂，既可有原发性（天然性）耐药，也可有诱导性（获得性）耐药；还有典型性和非典型性耐药之分。

由于MDR给化疗带来了困难，近年人们对其产生的机制以及试图寻找逆转剂做了大量的工作。

本文简介MDR产生的机制并着重介绍近年逆转剂的研究进展。

1.MDR产生的机制1.1膜糖蛋白介导的机制1.1.1 P-gp与MDR 1976年Ling等首先在抗秋水仙碱的中国仓鼠卵巢细胞株上发现了一种能调节细胞膜通透性的糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）,因其相对分子量为170kd，又称P-170。

[1]。

P-gp主要分布在有分泌功能的上皮细胞的细胞膜中，在人类正常组织中有不同程度的表达，其中肾上腺、肺脏、胃肠、胰腺等组织中表达较高，而在骨髓中表达较低。

P-gp属于ATP结合盒家族的转运因子，其生理功能为在ATP供能下将细胞内的毒性产物泵出细胞，对组织细胞起保护作用。

P-gp由mdr1基因编码产生。

人类mdr1基因位于7号染色体长臂2区一带一亚带（7q21.1）。

1986年，Gros将编码P-gp的mdr1cDNA直接转染敏感细胞后，转染细胞表现出完全的MDR表型，从而提供了P-gp能够导致多药耐药的有力证据。

现已证明，许多肿瘤原发性或获得性耐药均与P-gp过量表达有关。

P-gp随mdr1基因扩增而增加。

P-gp有多个药物结合位点，因而具有多种药物泵出功能，不过其底物多为天然性抗癌药如长春碱类、蒽环类、紫杉醇类和鬼臼毒素类等。

硫氧还蛋白还原酶1（TrxR1）属于吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶家族，作为目前已知的唯一能够还原硫氧还蛋白（Trx ）的酶，TrxR1可以将氧化型的Trx 还原成还原型Trx ［1］。

还原型的Trx 能够还原多种蛋白的二硫键，进而调控细胞的多种生物进程，如细胞增殖、分化以及凋亡等等［2］。

肿瘤细胞的代谢水平远高于正常细胞，因而在细胞内会产生大量活性氧［3］。

因此，肿瘤细胞往往会通过诱导抗氧化酶的表达来维持自身的氧化还原稳态，而TrxR1是其中一种被诱导的抗氧化酶。

近年来研究发现，TrxR1在多种肿瘤组织和细胞中高表达，如乳腺癌［4］、胃癌［5］、肺癌［6］和肠癌［7］等，并通过蛋白激酶B （PKB,又名AKT ）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK ）及信号传导及转录激活蛋白3（Stat3）等信号通路促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡及诱导耐药，是一个理想的抗肿瘤药物开发靶点［3,8］。

目前靶向TrxR1的药物具有丰富的骨架结构，但尚无进入临床使用的TrxR1靶向药物，其中一大制约因素就是Construction and identification of a HEK293cell line with stable TrxR1overexpressionLÜXiaomei 1,ZHOU Zhiyin 1,ZHU Li 1,ZHOU Ji 2,HUANG Huidan 1,ZHANG Chao 1,LIU Xiaoping 11Center of Drug Screening and Evaluation,Wannan Medical College,Wuhu 241000,China;2Center for Reproductive Medicine,First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241000,China摘要：目的构建稳定过表达硫氧还蛋白还原酶1（TrxR1）的HEK293细胞株，为TrxR1的功能研究以及靶向TrxR1药物筛选提供细胞模型。

替莫唑胺耐药胶质瘤细胞U251的生物学特性的实验研究刘来兴;陈磊;邓轶鑫;赵翠梅;王翔毅【摘要】目的观察耐替莫唑胺胶质瘤细胞的生物学特性.方法 U251 MG细胞的复苏、传代、细胞耐药分步诱导、MTT法检测U251 MG/TR对TMZ的耐药指数、CCK8法检测替莫唑胺对两组细胞增殖能力的影响、细胞集落法计数细胞集落.结果建立脑胶质瘤耐药细胞系U251/TR U251MG/TR比U251MG有更强的替莫唑胺耐药性,且对替莫唑胺的IC50是U251MG的11.14倍.结论本研究观察耐替莫唑胺胶质瘤细胞的生物学特性,为进一步研究替莫唑胺对胶质瘤的耐药机制建立基础,为临床替莫唑胺药物治疗抵抗提供新的研究思路.【期刊名称】《内蒙古医学杂志》【年(卷),期】2019(051)004【总页数】3页(P393-395)【关键词】胶质瘤细胞;替莫唑胺;耐药【作者】刘来兴;陈磊;邓轶鑫;赵翠梅;王翔毅【作者单位】内蒙古包钢医院神经外科,内蒙古包头 014010;内蒙古包钢医院神经外科,内蒙古包头 014010;内蒙古包钢医院神经外科,内蒙古包头 014010;内蒙古包钢医院神经外科,内蒙古包头 014010;内蒙古包钢医院神经外科,内蒙古包头014010【正文语种】中文【中图分类】R978.1脑胶质瘤又称脑神经胶质细胞瘤(GBM)，是一种起源于神经上皮细胞的原发性脑肿瘤。

据统计，脑胶质瘤可占所有原发性中枢神经系统肿瘤的32%，占中枢神经系统恶性肿瘤的81%。

其5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌，位列第3位[1]。

此外，2012年中国肿瘤登记报告指出，中国脑及中枢神经系统恶性肿瘤死亡率为3.87/10万，位列十大高病死率肿瘤的第9位。

因此以恶性胶质瘤为代表的中枢神经系统恶性肿瘤已成为亟待解决的临床问题以及当今肿瘤研究的热点。

作为成人中最常见的恶性原发脑肿瘤以及最具侵袭性的肿瘤，GBM具有生长迅速、侵袭性强等特性[2]。