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仪器分析结课论课题：高效液相色谱法研究系别：生物工程系专业：生物制药技术班级：制药1432班学号：************姓名：***指导老师：***高效液相色谱法研究摘要：高效液相色谱法，也称高压液相色谱法。

它是在经典的液相柱色谱的基础上发展而成的一种高效、快速、高灵敏的色谱分离方法。

根据柱内填料的不同及不同的分离机制，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱及凝胶色谱。

由于采用了高效填充剂，并配以高压输液泵、高灵敏检测器、自动记录装置及自动收集装置，使高效液相色谱法的分离速度及效率均大大提高，更趋于仪器化、自动化，且使用范围广。

制备型的HPLC能大量分离制备较纯的样品。

随着计算机技术的不断发展，HPLC与质谱、核磁共振谱、红外光谱等波谱技术的联用进展加快。

关键字：液相色谱；分类；应用一、高效液相色谱法分类根据分离机理可分为：吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱、大小排阻（凝胶）色谱、液-液分配色谱法。

1、吸附色谱分离吸附色谱法是当组分分子流经固定相（吸附剂，如硅胶或氧化铝）时，不同组分分子、流动相分子就要对吸附剂表面的活性中心展开竞争。

这种竞争能力的大小，决定了保留值大小，即被活性中心吸附得越牢的分子，保留值越大。

2、键合相色谱分离键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。

采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。

若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。

这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。

3、离子交换色谱分离离子交换色谱法是流动相中的被分离离子，与作为固定相的离子交换剂上的平衡离子进行可逆交换时，它们对交换剂的基体离子亲和力大小的不同而达到分离的。

组分离子对交换剂基体离子亲和力越大，保留时间就越长。

4、大小排阻色谱分离大小排阻色谱法的固定相是一类孔径大小有一定范围的多孔材料。

被分离的分子大小不同，它们扩散渗入多孔材料的容易程度不同。

小分子最易扩散进入细孔中，保留时间最长；大分子完全排斥在孔外，随流动相很快流出，保留时间最短。

5、液-液分配色谱法分离液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂,分离时,组分溶入两相,不同的组分因分配系数(K)的不同而被分离.目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的,使用化学键合固定相的色谱方法(简称键合相色谱法)可以用分配色谱的原理加以解释.键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位,是应用最广的色谱法.按照固定相和流动相极性的不同,分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类.二、高效液相色谱仪简介高效液相色谱仪主要由：输液系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、数据记录处理系统等组成。

1、输液泵：高效液相色谱的流动相采用高压泵输送,有不同类型的输液泵,按输液性质可分为恒压泵和恒流泵.目前使用较多的是柱塞式往复泵。

2、进样器：进样器是将试样送入色谱柱的装置.一般要求进样装置的密封性好,死体积小,重复性好,保证中心进样,进样时对色谱系统的压力,流量影响小。

3、色谱柱：色谱柱是色谱分离的核心.为了保证色谱柱的柱效高,使用寿命长,一般使用由专业化工厂生产的商品柱.色谱柱管多由不锈钢制成,内装一定的固定相.色谱往长一般10～30cm,内径2～5mm. 化学键合相是广泛使用的固定相,其中又以十八烷基硅烷键合硅胶的应用最为广泛。

4、检测器：样品经色谱柱分离后进入检侧器进行检测.按其适用范围检测器可分为通用型和专属型两大类,专属型检测器只能检测某些组分的某一性质,紫外检测器(UVD),荧光检测器(ED)属于这一类,它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应;通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质,示差折光检测器(RID),蒸发光散射检测器(ELSD)等.液相色谱-质谱联用(LC-MS)则是用质谱作为高效液相色谱的检测器。

5、数据记录处理和计算机控制系统 :现代HPLC的特征是用微机控制仪器.HPLC仪器的中心计算机控制系统,即能做数据采集和分析工作,又能程序控制仪器的各个部件,还能在分析一个试样之后自动改变条件而进行下一个试样的分析,许多色谱仪的软件系统具有方法认证功能,使分析工作更加规范化.三、高效液相色谱的特点高压——压力可达150～300 kg/cm2。

色谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。

高速——流速为0.1～10.0 mL/min。

高效——塔板数可达5000/米。

在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。

同时消耗样品少。

四、高效液相色谱法的应用1.在鉴别中的应用在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。

2.在杂质检查中的应用HPLC分离效能高,灵敏,在药物的杂质检查中应用广泛.主要用于药物中有关物质的检查。

“有关物质”是指药物中存在的合成原料,中间体,副产物,降解产物等物质,这些物质的结构和性质与药物相似,含量很低,只有采用色谱的方法才能将其分离并检测.若杂质是已知的,又有杂质的对照品,可用杂质对照品做对照进行检查.若杂质是未知的,可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查。

3.在含量测定中的应用用高效液相色谱法侧定含量可以消除药物中的杂质,制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰.中药材及其制剂组成复杂,基中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法。

五、高效液相色谱法测定VE含量1 实验目的1.1了解高效液相色谱仪的基本操作；1.2了解高效液相色谱仪测定V E的原理。

2 实验原理高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

V E（维生素E）又名生育酚或产妊酚，在食油、水果、蔬菜及粮食中均存在。

有抗氧化作用，能增强皮肤毛细血管抵抗力，并维持正常通透性；有改善血液循环及调整生育功能、抗衰老作用等。

V E通过高效液相色谱柱进行分离，PDA检测器检测，外标法定量。

3实验器材3.1 实验样品V E样品溶液3.2 实验试剂浓度为50µg/ml的V E标样3.3 实验仪器高效液相色谱仪附PDA检测器4 色谱条件色谱柱：C18柱；流动相速度：0.3ml/min；进样量：5µl；柱温：30℃。

5 实验结果与讨论5.1实验结果本次实验采用的是单点法测定。

实验结果见表1。

表1. 液相色谱仪测定苹果的VE含量进样量保留时间峰面积标样5µl 3.59min 42217 待测样品5µl 3.59min 17369样品中VE的浓度=乙烯标样的总量×苹果的峰面积/乙烯标样的峰面积=5µl×50μg/mL×17369/（5µl×42217）=20.57μg/mL5.2实验讨论本次实验中，测定标样溶液V E含量时，在指定的保留时间内并未出峰。

讨论分析原因：样品溶液在上周实验后，一直置于离心管中，未避光低温保存，导致样品中V E氧化，液相测定时没有在相应的时间出峰。

本次实验时间较短，且主要目的是了解高效液相色谱仪的基本操作，以及液相色谱仪测定V E的原理，故结合前组同学对V E含量的测定数据进行讨论与分析。

因时间有限，实验采用了单点法进行测量分析，且无平行重复，这样误差较大。

我们以后实验时，V E标样可以选择5个浓度，每个浓度分别测定3-4次，取其峰面积的平均值后作标准曲线，这样误差更小。

六.应用前景展望液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快.分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法。

它出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。

其仪器结构和流程也多种多样。

典型的高效液相色谱仪结构。

高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。

高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。

对于高效液相色谱的发展前景应该是非常乐观的，现在的社会的发展节奏很快，各个领域对于分析检验的需求很多，而分析检验中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。

所以她的发展情景很乐观。

理由有几点1，随着科技的发展，技术的日臻完善，较之以前色谱分析的方法有了很大程度的提高，很多科学家在对于一些分析上的难点有了新的突破，这样一个不断完善的技术在以后的社会发展中一定会扮演着一个重要的角色。

2，最近,一些先进的检测仪器成功的用在了高效液相色谱分析法上,使得高效液相色谱的应用更广泛,并充分利用高效快速.选择性好.灵敏度高等优点,建立更加系统的成分分析方法.通过与质谱联用.梯度洗脱.柱切换技术.配合先进的检测技术,以及与分子生物学.现代分子药理学相结合,必将在中药分析中发挥很大作用. 3，在现在的生活中，人们对于物质的安全要求很高，对于物质中出现的对人体有害的东西，一直是一个敏感的话题，而对于这些东西何从分辨呢？最后还是要归于分析检验。

所以，色谱分析的前景很乐观。

今后，随着各种分析分离技术的出现及联用技术的发展，HPLC将会被应用到更广的领域，未来发展前途广大。