DNA电泳实验步骤 PPT

DNA电泳实验的操作步骤DNA电泳是一种常用于检测、纯化和分离DNA分子的技术。

它基于DNA分子在电场中的运动，通过分析DNA带的大小和形状，可以确定不同样品之间的DNA差异。

DNA电泳广泛应用于生物学、医学、生态学和遗传学等领域的研究中。

本文将介绍DNA电泳实验的基本操作步骤。

1.制备样品首先要制备DNA样品。

DNA可从细胞或组织中提取，也可从PCR反应或酶切反应中得到。

使用DNA电泳之前，需要确定DNA纯度和浓度。

一般来说，DNA纯度越高，结果越准确。

可以用比色法或荧光法来测量DNA浓度。

为了避免样品不完整或受到污染，最好在实验室内进行样品制备。

2.混合样品和电泳缓冲液将制备好的DNA样品和电泳缓冲液混合，一般比例为1：5或1：10。

电泳缓冲液是由含盐的缓冲液制成的，能够维持电场的稳定性，防止DNA降解。

关键是要保证样品混合均匀，否则会导致电泳带失真或其他问题。

3.装载样品至凝胶孔中接下来，需要将混合好的样品从开口瓶中转移到电泳凝胶孔（gel well）中。

电泳凝胶是一种聚丙烯酰胺凝胶，通常用于分离较小的DNA分子。

凝胶孔是由凝胶中挖出的小孔，用于装载样品。

装载样品时，需要将样品慢慢注射到凝胶孔中，避免过多溢出，导致结果不准确。

4.电泳电泳是将样品在电场中移动，以分离DNA片段。

准备好的样品需要加载到电泳槽中。

电泳槽是由两个垂直的平板组成，中间夹着凝胶。

样品放置在凝胶孔中，然后在电泳槽的两侧连接电极。

通电后，DNA分子会朝向同一个方向移动。

分子越小，移动速度越快，形成的带越靠近电极。

电泳时间一般在30分钟到几个小时之间，取决于样本类型和目的。

5.可视化结果实验完成后，需要对结果进行可视化。

可以通过染色、紫外线或荧光方法观察结果。

一般来说，DNA分子被染色后呈现出一系列分散的带状物，每个带状物代表不同大小的DNA分子。

结果应该与分子量标准（分子量刻度）相比较，以确定样品中的DNA大小。

总结DNA电泳是一种重要的实验技术，用于分析DNA分子的大小和形状。

凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
铺
胶
凝胶凝固后取出梳子
加电泳缓冲液
准备样品
点
样
电
泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照
相
DNA琼脂糖凝胶电泳
实验原理
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型凝
胶 ——分离、鉴定、纯化DNA
在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解
离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时 向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分
子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分
子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片 段检测其大小的目的。
实验原理
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium
bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出110ng的DNA条带, 从而可以确定DNA片段在凝胶 中的位置。
此外, 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA
条带, 用于以后的克隆操作。
状DNA>开环DNA
DNA片段越长，泳动速度越慢
在低电压时，泳动速度与电场强度成正比
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（W/V,%） 分离范围（kb）
0.3
0.6 0.7 0.9 1.2
5-60
1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6
1.5
2.0
0.2-4
0.1-3
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
胶浓（%） 0.6 溴酚蓝 b 0.15kb
2kb
1.6kb
操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝

琼脂糖凝胶作为一种固体支持基质,主要利用DNA分子在 电场中的泳动时的分子筛效应来达到分离混合物的目的。
在恒电场的一定电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于 由DNA分子的大小与构型。
DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。
-
电泳方向
+
700bp
900bp
相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同。
② 胶板的制备：胶槽置于水平支持物上（两侧封口）, 插上样品梳子, 注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保 持1mm左右的间隙；
③ 胶液的制备：称取0.6g琼脂糖,置于100ml锥形瓶中,加入 40ml 0.5×TBE稀释缓冲液,用保鲜膜封口（避免水蒸气 过度散失），然后在上面用枪头扎个小孔（加热过程中 可以放出少量水汽，以免瓶内压力过大）， 放入微波炉 里加热至琼脂糖全部熔化（1-2min, 液体变透明）,取出 摇匀（烫手！）,此为1.5%琼脂糖凝胶液。待胶冷却到 60度左右，加入DNA染料Goldview 2 ul，混匀；
④ 倒胶：将胶液缓慢倒入胶板内，注意：倒胶时的温度不 可太低,否则凝固不均匀；速度也不可太快,否则容易出现 气泡。
⑤ 待胶完全凝固后（10min）,拨出梳子,注意不要损伤凝胶, 然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过凝 胶的上表面。
2. 上样
电泳样品： 每人电泳两个样品，包括：1.质粒DNA；2 . PCR产物。
其中：L为比色杯的光程（杯的厚度，cm）；“50”为DNA在OD260=1 时的浓度。
质粒DNA浓度(ng / μl )=稀释倍数×OD260×50
注：OD260 值应在0~1之间，以在0.5左右为好。这样读数比较准确。
纯度测定：当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时， 会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的 OD260、OD280（280nm是蛋白质的吸收峰）和OD230（230nm 是酚类等杂质的吸收峰），计算其比值来衡量样品的纯度。

DNA琼脂糖凝胶电泳分析
3. 加样
• 将DNA样品（5ul）与6 × 上样缓冲液（1ul） 混匀后， 用微量加样枪小心加入样 品孔内。
– 注意加样枪的枪头不可插入 过深，以免刺穿凝胶，导致 样品外溢。
• 每加完一个样品要更换枪 头，以防止EB污染。电泳
• 接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切 记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的 一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极 之间的距离计算）
• 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA条带,用于以后的克隆操作。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
电泳指示剂：
• 核酸电泳常用的指示剂有两种 – 溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）； – 二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ）， 它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝 胶中的迁移率比溴酚蓝慢
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
• 银染色
– 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形 成稳定的复合物，然后用还原剂如甲 醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳 带染成黑褐色。
– 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色， 也用于琼脂糖凝胶染色。
– 灵敏度比EB高200倍，但银染色后， DNA不宜回收
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
• 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，
停止电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
5. 结果观察
• 电泳结束后，将凝胶板取出。 在紫外仪上观察电泳带及其位 置，记录实验结果。
DNA琼脂糖凝胶电泳分析
注意事项
1、 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否 则温度太高会使制板变形；
• 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下， 使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而 达到分离核酸片段检测其大小的目的。