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EP 7.0 2.6.12 非无菌产品的微生物限度检查

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欧洲药典 6.0 1 of 6 2.6.12非无菌产品的微生物限度检查：微生物计数试验

1.简介： 该法所描述的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。 设计该试验的最初目的是为了确定一种物质或制剂是否符合微生物质量的既定标准。如果是这种目的，则需要遵从下面的说明，包括所需样品数，从而根据下面所提到的方法来进行结果解释。 该法不适用于包含微生物作为活性成分的产品。 如果与药典的等效性作了相关说明，可以使用自动收集法作为替代法。 2.一般步骤 设计方法时所用条件要避免外在微生物对待测产品的污染。必须釆取措施，使其不影响任何待测微生物。 如果待测产品有抗菌活性，必须将这种活性去除或中和掉。如果因此使用了灭活剂，必须证明它们对微生物的高效性和无毒性。 如果在样品制备中加了表面活性剂，必须证明它们对微生物的无毒性和与灭活剂的兼容性。 3.计数方法 按规定用微孔滤膜法或平板计数法。MPN法对微生物测定来说是最不精确的方法，但是，如果某些产品所含极少的微生物量，该法是最合适的。 方法选择基于下列因素：如产品的特性和所要求的微生物量。所选方法必须能够测定充足的样品从而来判断其是否符合标准。所选方法的适用性必须建立。 4.促生长实验、计数法的适用性和阴性对照 4-1 总则 在不加产品的条件下该试验检测微生物的能力必须已确定。 如果测试条件改变或产品改变，必须证实方法的适适用性，因为这些改变可能影响试验的最终结果。 4-2 试验菌株的准备 使用测试菌株标准稳定的悬浮液或按下面方法制备。使用批种子培养技术（seed-lot systems）使得用于接种的微生物从最初的主批种子传代不多于5次。细菌和真菌试验株的生长分别见表2.6.12-2。 使用氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液或pH 7.2的磷酸缓冲液制作试验用悬浮液。对于黑曲霉菌需要加入0.05％聚山梨醇酯80到缓冲液中。在两小时内使用该菌悬液或2-8℃下可保存24小时。作为一种可替代的制备方法，稀释含有黑曲霉菌或枯草芽孢杆菌的新鲜悬浮液，该悬浮液中加有营养细胞，从而可以制得一种稳定的孢子悬浮液，对于接种试验来说需要将该孢子悬浮液调整到一个合适的体积下。该孢子悬浮液可以在2-8℃保存至已经验证的期限。

4-3 阴性对照 为了验证试验条件，必须使用可选用的稀释液作为阴性对照来替代测试液。在该阴性对照品中必须没有微生物生长。

4-4 促生长培养基 测试每一批准备好的培养基和每一批培养基，要么为脱水培养基要么含有所述成分。 用表2.6.12-1中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接种到含有大豆蛋白胨消化肉汤的液体/平板

和大豆蛋白胨消化琼脂上，对每一种使用各自的含有培养基的液体/平板。用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接种到沙氏－葡萄糖琼脂平板，对每一种微生物使用含各自培养基的平板。接种条件见表2.6.12-1。 对固体培养基而言，以标准接种物来说，所得的生长值不超过计算值的两倍。与用先前的测试方法和验证的批培养基所得的测试结果相比，新制备的接种物将会出现微生物的生长值。与用先前的测试方法和验证的批培养基所得的测试结果相比，如果微生物生长清淅可见，则液体培养基是合适的。 欧洲药典 6.0 2 of 6 表2.6.12.-1-微生物制备和使用

微生物 受试菌株制备 促生长 在产品存在的情况下的计数方法的适应性 需氧菌总数 总酵母菌和霉菌数 需氧菌总数 总酵母菌和霉菌数 金黄色葡萄球菌如： ATCC6538 NCIMB9518 CIP4.83 NBRC13276 酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤 30-35℃ 18-24小时 酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤 ≤100CFU 30-35℃ ≤3天 酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤 ≤100CFU 30-35℃ ≤3天 铜绿假单胞菌 如： ATCC 9027 NCIMB 8626 CIP 82.118 NBRC13275 酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤 30-35℃ 18-24小时 酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤 ≤100CFU 30-35℃ ≤3天 酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤 ≤100CFU 30-35℃ ≤3天 枯草杆菌 如： ATCC 6633 NCIMB 8054 CIP 52.62 NBRC 3134 酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤 30-35℃ 18-24小时 酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤 ≤100CFU 30-35℃ ≤3天 酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤 ≤100CFU 30-35℃ ≤3天 白色念珠菌 如： ATCC 10231 NCPF 3179 IP 48.72 NBRC 1594 沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤 20-25℃ 2-3天 酪蛋白大豆消化琼脂 ≤100CFU 30-35℃ ≤5天 沙氏葡萄糖琼脂 ≤100CFU 20-25℃ ≤5天 酪蛋白大豆消化琼脂 ≤100CFU 30-35℃ ≤5天 MPN： 不能适用 沙氏葡萄糖琼脂 ≤100CFU 20-25℃ ≤5天

黑曲霉菌 如： ATCC 16404 IMI 149007 IP 1431.83 NBRC 9455 沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡糖萄糖琼脂 20-25℃ 5-7天或能达到有很好的芽孢形成 酪蛋白大豆消化琼脂 ≤100CFU 30-35℃ ≤5天 沙氏葡萄糖琼脂 ≤100CFU 20-25℃ ≤5天 酪蛋白大豆消化琼脂 ≤100CFU 30-35℃ ≤5天 MPN： 不适用 沙氏葡萄糖琼脂 ≤100CFU 20-25℃ ≤5天

4-5对于待测产品合适的计数方法 4-5-1 样品制备 ：样品制备方法选择依赖于待测产品的物理特性。如果下述方法均不合适的话，可选用替代方法。 水溶性产品：溶解或稀释（通常1：10的稀释液）待测产品于氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液, pH7.2的磷酸缓冲液或酪蛋白大豆消化肉汤。如有必要，调节欧洲药典 6.0 3 of 6 pH 6-8。如果必要可用相同稀释液进一步稀释。 不溶于水的非脂类产品：使待测物（通常以1：10稀释制备）悬浮在pH7.0 的缓冲氯化钠蛋白胨溶液，pH7.2 的磷酸缓冲液或酪蛋白大豆消化肉汤中。加入如1g/l的聚山梨醇酯80表面活性剂使几乎能润湿的物质悬浮。如有需要，调节pH为6-8。如果必要可用相同稀释液进一步稀释 脂类产品：将受检产品溶解在豆蔻酸异丙脂中，通过过滤或把产品与最小需要量的无菌聚山梨醇酯80或与其他的非抑制表面活性剂混合进行灭菌，如果需要，加热到不超过40℃，或者在特殊情况下不超过45℃。仔细混合且如有必要在水浴中保温。加足量预热的所选稀释液来制备原产品的1：10的稀释溶液。仔细混合同时在所需的最短时间内保温来形成乳状液。可以使用含有合适浓度的无菌聚山梨醇酯80或其它的非抑制无菌表面活性剂来制备一系列的十倍稀释液。 液体或固体的气溶胶：将产品在无菌条件下转移到一个膜过滤装置或者一个无菌容器中来进一步取样。或使用总含量或使用每个容器剂量确定的量。 透皮贴剂。去掉透皮贴剂的保护层(‘隔离衬垫‘)并把它们向上贴在无菌玻璃或塑料盘上。 用无菌多孔物质例如无菌纱布来覆盖粘贴面，避免透皮贴剂粘在一起并把透皮贴剂转移到含有如聚山梨醇酯80和/或卵磷脂的灭活剂的所选适当体积的稀释液中。至少用力振摇制备溶液30分钟。 4-5-2 接种和稀释：加上述制备的样品（4-5-1）到一个控制的（不含待测物质）足够量的微生物混悬溶液中来获得一个不超过100CFU的接种液。接种液的体积不能超过稀释产品的体积的1%。 为说明产品的可接受微生物回收率，实验中应该使用制备样品的最低可能稀释因子。如果因为抗微生物活性或者差的溶解性而不可能做到，需要进一步探索合适的方案。如果样品的生长抑制不可避免，在中和、稀释或过滤后可加入微生物混悬液。 4-5-3 中和/去除抗微生物活性 把根据4-5-2所述稀释制备的样品和按照4-5-4中所述步骤培养的微生物数和与对照制备中回收的微生物数作比较。 如果生长被抑制（抑制因子大于2），修改计数测试的方法来保证结果的有效性。修改可能包括，如，（1）

稀释液或培养基体积的增加，（2）特殊的或一般的中和剂与稀释液的结合，（3）膜过滤，或（4） 上述措施的组合。 中和剂： 中和剂可被用来中和抗菌剂的活性（表

2.6.12.-2）。可在灭菌前加入到所选稀释液或更好的

培养基中。如果使用的话，它们的功效和对微生物无毒性必须通过使用中和剂而不使用产品的空白实验进行说明。

表2.6.12.-2 干扰物质的一般中和剂 干扰物质 可能的中和方法 戊二醛，汞 硫酸氢钠（亚硫酸氢钠） 酚，醇，醛，山梨酸酯 稀释 醛 氨基乙酸 季铵化合物(QACs)，对羟基苯甲酸酯（对羟基苯甲酸酯），二-二双胍类 卵磷脂

QACs， 碘，对羟基苯甲酸酯 聚山梨醇酯

汞剂 硫乙醇酸盐 汞剂，卤素，醛 硫代硫酸盐 EDTA（乙二胺四乙酸盐） Mg2+或Ca2+

若没有合适的中和方法，可认为分离接种微生物失败归因于产品的杀菌活性。这一信息说明产品不可能被上述微生物污染。然而，产品可能只对其中一些有抑制作用，但对其他一些测试菌株没有作用或菌株没有代表性。然后，以微生物生长和标准所允许的最高浓度系数进行试验。

4-5-4. 产品存在情况下微生物的回收率 对以上列出的微生物进行单独的试验。仅对加入的测试菌微生物进行计数。 4-5-4-1. 膜过滤： 使用孔径不大于0.45μm的滤膜过滤。选择滤膜材料类型时，要求滤膜对微生物的滞留能力不受到待测样品成份的影响。每种上述微生物使用一张滤膜。 将适量按4-5-1至4-5-3制备的样品（含1g产

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非无菌产品微生物检查控制菌检查法ppt课件

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供试品检查—— 沙门菌
沙门菌为革兰阴性杆菌，无芽孢，菌体 通常（0.4～ 0.9）μm×(1～3) μm，两 端钝圆。需氧或兼性厌 氧，10～42℃皆可 生长，最适温度37℃。
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沙门菌检查
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沙门菌检查
沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板上生长良好，菌落为 红色、中心有或无 黑色。
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2
概述
微生物限度检查法中的控制菌检查在药典一、二、三部附录中内容基本一致 参照ICH协调案”非无菌药品微生物限度检查：控制菌检查”进行修订。 主要修订内容 控制菌检查项目、培养基体系、 培养基适用性检查、 检查方法适用性试验、 结果判断等。
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3
控制菌检查法
供试液制备及实验环境要求 -同《非无菌产品微生物检查：微生物计数法》。 -如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。 -中和剂或灭活剂的使用 使用了中和剂或灭活剂应确认有效性及对微生物的无毒 性并应确认供试液 与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。
三糖铁琼脂培养基
斜面未见红色、底层未见黄色
或斜面黄色、 底层无黑色
判供试品未检出沙门菌。
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铜绿假单胞菌
形态特征 铜绿假单胞菌为革兰阴性、直或微弯曲的杆菌，其菌体的长短不一，短的为球杆 状，长为丝状，大小（0.5～1.0）μm×(1.5～3.0)μm。 除在硝酸盐培养基中以外都是专性好氧。 最适生长温度为35℃，在42℃能生长，4℃不生长。
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金黄色葡萄球菌检查
结果判断 ⒈若甘露醇氯化钠琼脂平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应 进行分离、纯化及适宜的鉴定试验, 确证。 ⒉若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或 疑似的 菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
EP2.6.12译文

EP2.6.12译文

微生物限度检查1.简介：该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。

设计该试验的最初目的是为了确定一种物质或制备液是否符合微生物质量已制定的规定。

如果是这种目的，则需要遵从下面的说明，包括所需样品数，从而根据下面所提到的方法来解释结果。

该法不适用于包含微生物作为活性成分的产品。

可以使用自动收集法作为替代法，与药典所用方法具有同样效力。

2.一般操作过程设计方法时所用条件要避免外在微生物对产品的污染。

必须釆取措施避免污染以便它们不影响任何所测微生物。

如果所测产品有抗菌活性，必须将这种活性去除或中和掉。

如果因此使用了灭活剂，必须证明它们对微生物的高效性和无毒性。

如果在样品制备中加了表面活性剂，必须证明它们对微生物的无毒性和与灭活剂的兼容性。

3.举例方法按规定用微孔滤膜法或平板菌落计数法。

MPN法对微生物测定来说是最不精确的方法，但是，如果某些产品所含极少的微生物量，该法是最合适的方法。

方法选择基于下列因素：如产品的特性和所要求的微生物量。

所选方法必须能够测定充足的样品从而来判断该法的适应性。

所选方法的合适性必须确定。

4.促生长实验和计数法4-1 总则在不加产品的条件下该试验能够检测微生物的能力必须已确定。

如果测试条件改变或产品改变，必须证实方法的适应性，因为这些改变可能影响试验的最终结果。

4-2 试验菌株的准备使用测试菌株标准稳定的悬浮液或按下面方法制备。

批种子培养技术（seed lot culture maintenance techniques, seed-lot systems）的使用以至于用于接种的微生物从最初的主批种子转移走不多于5通道。

细菌和真菌试验株的生产分别见表格2.6.12-2。

使用氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液或pH 7.2的磷酸缓冲液制作试验用悬浮液。

对于曲霉菌需要加入0.05％聚山梨醇酯80到缓冲液中。

如果在2-8℃下保存则该悬浮液要在2-24小时内使用。

ep8.02.6.13非无菌药品的微生物限度检查：特殊微生物的检查(中英对照)

ep8.02.6.13非无菌药品的微生物限度检查：特殊微生物的检查(中英对照)

文档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑•欢迎下载支持.EP 8.004/2010:20613 MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NON-STERILE PRODUCTS: TEST FORSPECIFIED MICRO-ORGANISMS （3）非无菌药品的微生物限度检查：特殊微生物的检查1.INTRODUCTION 导言The tests described hereafter will allow determ in ati on of the abse nee or limited occurre nee of specified micro-orga ni sms that may be detected un der the con diti ons described.下述检验方法用于检查在描述的试验条件下特定微生物的定性及限度。

The tests are desig ned primarily to determ ine whether a substa nee or preparati on complies with an established specificati on for microbiological quality. Whe n used for such purposes, follow the instructions given below, including the number of samples to be taken, and interpret the results as stated below.检验的主要目的是为了确定是否原料药或制剂符合已建立的微生物限度标准，当用于这一目的时，应按照以下方式（包括取样量），进行并按照下述描述对结果进行分析。

Alter native microbiological procedures, in clud ing automated methods, may be used, provided that their equivale nee to the Pharmacopoeia method has bee n dem on strated.如果可证明某种试验方法（包括自动化分析法）的效果与药典中的方法等同，该方法可作为另一种供选择的试验方法。

非无菌产品微生物限度检査指导原则

非无菌产品微生物限度检査指导原则

中国药典2015年版性项下的有关内容对准确度进行评价。

2.精密度微生物定量检验的精密度是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度，通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示，也可以采用其他适宜的方式。

精密度验证的方法是：制备试验菌的菌悬液，齒悬液的浓度应选择为能够准确读数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于l O cfu/m l)。

每个试验菌选择其中至少5个浓度的菌悬液进行检验。

每一个浓度至少应进行10次重复检验，以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。

一般情况下，可以接受的相对标准偏差(R S D)应不大于35%。

不考虑特殊的检验结果，替代方法的相对标准偏差（R S D)应不大于药典方法。

例如，药典菌落计数平皿法其可接受的相对标准偏差（R S D)与含菌浓度的关系见表2。

表2不同含蔺浓度下预期的相对标准偏差cfu/皿预期RSD<10<35%10 〜30<25%30 〜300<15%3.专属性微生物定量检验的专属性是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。

例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。

专属性验证时，应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法，从而确认替代方法的适用性。

当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时(如不需要增菌或在1〜50cfu范围内就可直接测定菌数的定量方法），以上验证方式就显得更为重要。

4.定量限微生物定量检验的定量限是指样品中能被准确定量测定的微生物最低数量。

由于无法得到含有已知微生物数量的实验样品，因此，在定量限验证时，应选择在检验范围内至少5个菌浓度，每个浓度重复取样测定不少于5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。