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通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24 小时。
通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时,按一次检出结果为准,不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24 小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48 小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24 小时。
62 MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: TESTS FOR SPECIFIEDMICROORGANISMS非无菌产品微生物限度检查:控制菌（USP38）1.INTRODUCTION导言The tests described hereafter will allow determination of the absence of, or limited occurrence of, specified microorganisms that may be detected under the conditions described.控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
The tests are designed primarily to determine whether a substance or preparation complies with an established specification for microbiological quality. When used for such purposes, follow the instructions given below, including the number of samples to be taken, and interpret the results as stated below.当本法用于检查非无菌制剂及其原辅料是否符合相应的微生物限度标准时,应按下列规定进行检验，,包括样品的取样量,结果的判断.Alternative microbiological procedures, including automated methods, may be used, provided that their equivalence to the Pharmacopeial method has been demonstrated.可以使用包括自动化法在内的方法,需确认与药典方法的等同性.2.GENERAL PROCEDURES通用规程The preparation of samples is carried out as described in Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests 61.供试品制备,同USP<61>If the product to be examined has antimicrobial activity, this is insofar as possible removed or neutralized as described in Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests 61.若供试品有抗菌活性,应尽可能中和或去除,中和或去除的方法同USP<61>If surface-active substances are used for sample preparation, their absence of toxicity for microorganisms and their compatibility with any inactivators used must be demonstrated as described in Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests 61.若供试品制备过程中使用了表面活性剂,应确认其对微生物的无毒性以及与所用的中和剂/灭活剂的相容性，同USP<61>3.GROWTH-PROMOTING AND INHIBITORY PROPERTIES OF THE MEDIA, SUITABILITYOF THE TEST AND NEGATIVE CONTROLS 培养基适用性检查，控制菌检查方法的适用性确认，阴性对照The ability of the test to detect microorganisms in the presence of the product to be tested must be established. Suitability must be confirmed if a change in testing performance or a change in the product that may affect the outcome of the test is introduced.在有供试品存在的情况下，所建立的方法应能检测微生物。
SOP-FF-9-045-C非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法标准操作规程SOP-FF-9-045-C 控制菌检查法标准操作规程第 1 页共 5 页题目：控制菌检查法标准操作规程编码：SOP-FF-9-045-C 起草：日期：审核：日期：批准：日期：生效日期：颁发部门：质管部分发部门：检验室依据：《中国药典》2015年版四部通则1106 第145页目的：建立控制菌检查法的标准操作规程。
范围：适用于药品中控制菌的检查。
职责：检验室主任、检验者对本规程的实施负责。
规程：1.简介控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检査供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)”。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
2.培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
2.1 菌种及菌液制备2.1.1 菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种。
为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则110 7），特制定本指导原则。
非无菌药品中污染的某些微生物可能导致药物活性降低，甚至使药品丧失疗效，从而对患者健康造成潜在的危害。
因此，在药品生产、贮藏和流通各个环节中，药品生产企业应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受微生物污染程度。
非无菌产品微生物计数法、控制菌检查法及药品微生物限度标准可用于判断非无菌制剂及原料、辅料等是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料等微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。
本指导原则将对微生物限度检查方法和标准中的特定内容及应用做进一步的说明。
1. 非无菌产品微生物限度检查过程中，如使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。
2. 供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法，同时，所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。
对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。
3. 对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适用性检查，以保证药品微生物检验用培养基的质量。
对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。
4. 进行微生物计数方法适用性试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法适用性试验。
此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，最高稀释级供试液的选择根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则而确定，如供试品应符合的微生物限度标准是lg需氧菌总数不得过10 3 cfu，那么最高稀释级是1：10 3 。
非无菌药品微生物限度检查指导原则微生物限度检查是药品质量控制中的重要环节，尤其对于非无菌药品而言更为重要。
本文将对非无菌药品微生物限度检查的指导原则进行详细介绍，旨在提高药品的质量安全性。
一、检验项目及标准非无菌药品微生物限度检查的主要检验项目包括总生菌数、大肠菌群、霉菌和酵母菌等。
每一项检验项目都有相应的标准来衡量合格与否。
以下是常用的标准：1. 总生菌数：根据药典要求，大部分非无菌药品每克不得超过1000 CFU（菌落形成单位）。
2. 大肠菌群：大肠菌群是肠道中的常见菌种，其存在可能暗示有肠源性污染。
检验结果一般要求不得检出大肠菌群。
3. 霉菌和酵母菌：霉菌和酵母菌是环境中广泛存在的微生物，在非无菌药品中的存在可能引发变质，甚至导致严重的药品质量问题。
一般情况下，每克药品中不得检出霉菌和酵母菌。
二、样品的选择和采集在进行微生物限度检查前，需选择合适的样品，并采取正确的样品采集方式。
以下是一些常用的样品选择和采集方法：1. 样品选择：根据药品的特性，选择代表性的样品进行检测。
选取多个批次的不同规格的样品进行检验更有利于全面评估该药品的微生物污染水平。
2. 样品采集：在采集样品前，先进行适当的表面消毒，以避免外源性污染。
采集时应遵循严格的无菌操作，确保样品的真实性和可靠性。
常用的样品采集方法包括划线法、切割法、稀释法等。
三、检验方法和操作流程微生物限度检查需要使用一系列严格的操作流程和检验方法，以保证结果的准确性和可比性。
以下是一般的操作流程：1. 样品预处理：根据药品的特性，选择适当的预处理方法，如溶解、稀释、震荡等，以提高微生物的检出率。
2. 培养基选择：根据不同的菌种需求，选择适宜的培养基进行菌落的培养。
常用的培养基有营养琼脂平板、大肠埃希菌选择平板、马铃薯葡萄糖琼脂平板等。
3. 培养条件：根据菌种的生长特性和检验项目的要求，设定适当的温度、时间和培养条件，以促进菌落的生长。
4. 菌落计数：通过目视或自动计数法，对培养基上的菌落进行计数。
2.6.12非无菌产品的微生物限度检查：微生物计数试验1.简介：该法所描述的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。
设计该试验的最初目的是为了确定一种物质或制剂是否符合微生物质量的既定标准。
如果是这种目的，则需要遵从下面的说明，包括所需样品数，从而根据下面所提到的方法来进行结果解释。
该法不适用于包含微生物作为活性成分的产品。
如果与药典的等效性作了相关说明，可以使用自动收集法作为替代法。
2.一般步骤设计方法时所用条件要避免外在微生物对待测产品的污染。
必须釆取措施，使其不影响任何待测微生物。
如果待测产品有抗菌活性，必须将这种活性去除或中和掉。
如果因此使用了灭活剂，必须证明它们对微生物的高效性和无毒性。
如果在样品制备中加了表面活性剂，必须证明它们对微生物的无毒性和与灭活剂的兼容性。
3.计数方法按规定用微孔滤膜法或平板计数法。
MPN法对微生物测定来说是最不精确的方法，但是，如果某些产品所含极少的微生物量，该法是最合适的。
方法选择基于下列因素：如产品的特性和所要求的微生物量。
所选方法必须能够测定充足的样品从而来判断其是否符合标准。
所选方法的适用性必须建立。
4.促生长实验、计数法的适用性和阴性对照4-1 总则在不加产品的条件下该试验检测微生物的能力必须已确定。
如果测试条件改变或产品改变，必须证实方法的适适用性，因为这些改变可能影响试验的最终结果。
4-2 试验菌株的准备使用测试菌株标准稳定的悬浮液或按下面方法制备。
使用批种子培养技术（seed-lot systems）使得用于接种的微生物从最初的主批种子传代不多于5次。
细菌和真菌试验株的生长分别见表2.6.12-2。
使用氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液或pH 7.2的磷酸缓冲液制作试验用悬浮液。
对于黑曲霉菌需要加入0.05％聚山梨醇酯80到缓冲液中。
在两小时内使用该菌悬液或2-8℃下可保存24小时。
作为一种可替代的制备方法，稀释含有黑曲霉菌或枯草芽孢杆菌的新鲜悬浮液，该悬浮液中加有营养细胞，从而可以制得一种稳定的孢子悬浮液，对于接种试验来说需要将该孢子悬浮液调整到一个合适的体积下。
微生物限度检查的原理微生物限度检查是指根据药典规定对药品中微生物污染水平的限度要求进行检查，以保证药品的质量和安全性。
微生物限度检查是药品质量控制的一个重要环节，也是药品生产过程中必不可少的一项检验项目。
微生物污染可能对药品的质量和安全性造成严重影响，因此对药品中的微生物进行限度检查具有重要意义。
微生物限度检查的原理主要包括以下几个方面：1. 法定要求：药典对不同类型的药品中微生物的限度要求是有明确规定的，这些规定主要基于药品的用途、剂型、注射给药途径等因素考虑而来。
各个国家的药典对微生物限度的要求可能有所不同，但都是为了保证药品的质量和安全性。
2. 安全性考量：药品中的微生物污染可能会对人体健康造成严重危害，尤其是注射剂等无菌制剂，微生物的污染可能导致败血症等严重后果。
因此，对药品中微生物的限度要求不仅是出于药品质量控制的考量，更是为了人体健康和安全着想。
3. 检测方法：微生物限度检查的原理还包括具体的检测方法和技术。
常见的微生物限度检查方法包括菌落总数、大肠菌群、铜绿假单胞菌等微生物的检测方法。
这些检测方法有其特定的原理和操作步骤，通过这些方法可以快速、准确地评估药品中微生物的污染水平。
4. 检测标准：微生物限度检查的原理还包括检测标准的确定。
药典对微生物限度的要求是明确的，通过对照药典的要求，可以确定合适的检测标准。
同时，根据药品的特性和使用要求，也可以进行适当的调整和确定特定的检测标准。
微生物限度检查的原理是基于上述几个方面的综合考量和要求的。
通过对药品中微生物的限度检查，可以有效评估药品的质量和安全性，保证药品的合格性和可靠性。
因此，微生物限度检查对于药品生产和质量控制来说具有重要的意义。
在具体的微生物限度检查中，主要包括以下几个步骤：1. 样品处理：首先需要对要检测的药品样品进行处理，以使其适合于微生物限度检查的要求。
样品处理通常包括制备适当的溶液、稀释和过滤等步骤，以减少背景微生物的干扰，保证检测结果的准确性。
微生物限度的检测原理微生物限度检测原理微生物限度是指在一定数量取样的样品中，允许含有的微生物数量的最大值。
微生物限度检测是一项质量控制的重要措施，可以用于净化水质、食品卫生、医药制品等领域。
检测原理微生物限度检测有两种方法：总生菌数和指示菌。
总生菌数法：常用于食品、医药制品等领域。
该方法将样品进行稀释后，接种到特定的培养基上，经过特定的时间和条件培养，根据生长的菌落数量和菌落特征进行计数和鉴定，计算出每单位重量样品中的菌落总数。
指示菌法：常用于检测细菌和真菌。
该方法是利用一种易于生长、常见、广泛分布但不致病的微生物来代表环境中的各种微生物。
常用的指示菌包括大肠杆菌、肠球菌、铜绿假单胞菌等。
检测步骤1.准备样品：采集样品时要注意采集工具的消毒、避免其他微生物的污染，同时还要考虑样品的保存条件。
2.制备培养基：根据检测方法选择合适的培养基，并按照要求配制好培养基。
3.菌群扩增：将取样和培养基混合，通过摇床、温度控制等方式，使其中的微生物得到充分的生长繁殖。
4.菌落计数：在培养基上形成的单个菌落被认为是由单个微生物生长产生的。
利用计数板或显微镜等设备，对表面菌落数量进行计数。
5.数据处理：根据实验结果计算出微生物限度，并对检测结果进行评估和分析，确定是否符合相应的标准要求。
常见反应溶液1.助溶剂：可使细菌快速释放出细胞内容物。
如：Tween80、Triton X-100等。
2.增殖剂：能够促进细菌的繁殖，加快菌落成长。
如：乳糖、葡萄糖等。
3.抑菌剂：用于防止不需要的菌落生成。
如：抗生素等。
应用领域微生物限度检测广泛应用于食品、饮料、医药制品、环境卫生等领域。
1.食品：微生物限度检测可以帮助食品厂家确定食品的质量和安全性，检测出食品中的致病菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。
2.医药制品：微生物限度检测可以检测制药过程中的菌落总数、霉菌数量等指标，确保药品纯度和安全性，避免交叉感染等问题。
3.环境卫生：微生物限度检测可以用于监测空气、水质和表面菌落数量，发现污染源，及时解决环境污染问题。
2020版药典非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）”。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所釆用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（B）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24小时。
⾮⽆菌产品微⽣物限度检查中控制菌检查原理⾮⽆菌药品微⽣物限度检查中控制菌检查及原理⼀、⼤肠埃希菌1.菌体特性⼤肠埃希菌属于肠杆菌科埃希菌属，菌体细胞两端钝圆，为⾰兰染⾊阴性⽆芽孢杆菌，细胞⼤⼩为1.1～1.5×2～6.0 µm。
周⾝鞭⽑、运动或不运动。
能形成荚膜和微荚膜。
最适⽣长温度37℃，可在15～46℃⽣长。
最适pH为7.4～7.6。
在营养⾁汤培养基中，37℃培养24⼩时后，形成菌膜，管底粘液状沉淀，培养物有粪臭味。
在伊红美兰琼脂（EMB）平板上，典型的菌落呈紫⿊⾊，有⾦属光泽，菌落扁平，低度凸起，光滑湿润。
也有呈粉红⾊、⽆⾦属光泽、中⼼紫⾊的菌落。
在麦康凯琼脂（MaCC）平板上，菌落扁平、圆形、光滑湿润。
呈桃红⾊、微红⾊或菌落中⼼桃红⾊。
2. ⽣化实验原理（1）MUG试验97％的⼤肠埃希菌含有β—葡萄糖醛苷酶，可分解4—甲基伞形酮β－D－葡萄糖苷酸，⽣成的4—甲基伞形酮在366nm紫外灯下产⽣蓝⽩⾊荧光。
（2）靛基质试验（I实验)有些细菌具有⾊氨酸酶，在蛋⽩胨⽔培养基中⽣长时，能分解蛋⽩胨中的⾊氨酸，⽣成靛基质（吲哚）。
靛基质⽆⾊，不能直接观察，加⼊靛基质试液（对⼆甲氨基苯甲醛试液），产成红⾊的玫瑰靛基质。
⾊氨酸酶活性的最适pH为7.4～7.8。
pH降低，靛基质产⽣减少，可能出现假阴性或弱阳性反应，故培养基pH应为7.4～7.6 。
因产⽣靛基质的细菌都能发酵糖类⽽产酸，增加培养基的酸度，不宜⽤含葡萄糖的培养基进⾏此试验。
（3）甲基红试验（M）肠杆菌科细菌均可发酵葡萄糖产⽣酸性代谢产物，使培养基pH值下降，最初可使甲基红指⽰液［变⾊域pH4.5－5.4（红→黄）］变⾊⽽呈现阳性反应。
但继续培养后，产⽓杆菌能将两分⼦的丙酮酸脱羧⽣成⼀分⼦的中性⼄酰甲基甲醇⽽使培养基pH值上升⾄5.4以上，使甲基红指⽰液变为桔黄⾊（甲基红试验阴性）。
⽽⼤肠埃希菌则继续产⽣⼤量的酸，如甲酸、⼄酸、乳酸、琥珀酸等，保持⾼氢离⼦浓度，故甲基红试验为阳性反应。
微生物限度检查的原理
微生物限度检查的原理是通过检测样品中微生物的种类和数量，确定样品的微生物污染水平。
具体原理如下：
1. 样品制备：将待测样品经过适当的处理和稀释，以便使微生物在培养基上能够生长。
2. 培养基选择：根据待测样品的特性选择合适的培养基，以促进目标微生物的生长。
3. 培养条件控制：对培养条件进行严格控制，如温度、湿度、pH值等，以提供最适宜的生长环境。
4. 培养时间：根据不同的微生物，确定适宜的培养时间，以获得最大的菌落形成。
5. 菌落计数：利用计数板、显微镜等工具对培养基上的菌落进行计数，并将结果转换为CFU（菌落形成单位）。
6. 结果解读：根据国家标准或行业规范，确定目标微生物的限度标准，并根据实际检测结果判断样品是否合格。
需要注意的是，微生物限度检查并非对所有微生物种类进行检测，而是针对特定的微生物指标进行分析。
此外，微生物限度检查还会受到样品的制备、培养条件等因素的影响，因此在进行检测时需要严格控制实验条件，并参照相应的质量标准进行解读。
2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查本文介绍了非无菌产品微生物限度检查中的微生物计数法。
该方法适用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
在检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应严格遵守无菌操作，防止再污染。
计数方法的选择应考虑供试品理化特性和微生物限度标准等因素，并经过确认。
此外，商品化的预制培养基和由脱水培养基或按处方配制的培养基都应进行培养基适用性检查。
在供试液制备过程中，应根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液，并在加温时均匀加热，且温度不应超过45°C。
供试液从制备至加人检验用培养基，不得超过1小时。
在进行多种品种计数方法的适用性试验时，需要注意时效问题。
在“供试液制备”这一节中，水溶性供试品、水不溶性非油脂供试品、油脂类供试品的制备方法没有变化。
在2020版药典中，将原来的“需用特殊方法制备供试液的供试品”中的小类（四种）提升至与上述三类并列，除气雾剂供试品外，制备方法没有变化。
具体是膜剂供试品、肠溶及结肠溶制剂供试品、气雾剂供试品（2015版：气雾剂、喷雾剂供试品）、贴剂、贴膏剂供试品（2015版：贴膏剂供试品）。
需要注意的是，气雾剂供试品的变化较大，需要特别注意。
在进行供试液接种后的抗菌活性去除或灭活时，可以使用中和剂或灭活剂（表2)来消除干扰物的抑菌活性。
最好在稀释液或培养基灭菌前加入。
如果使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量含中和剂或灭活剂的稀释液替代供试品同试验组操作。
需要注意的是，在方法学中，这个对照组的稀释液中显然要含有相应的中和剂或者灭活剂，进一步明确，以防止错误套用。
在供试品中微生物的回收中，涂布法中“取15~20ml”修订为“取适量（通常为15~20ml）”。
在薄膜过滤法中，所采用的滤膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50mm。
如果采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。
非无菌药品微生物限度检查中控制菌检查及原理一、大肠埃希菌1.菌体特性大肠埃希菌属于肠杆菌科埃希菌属，菌体细胞两端钝圆，为革兰染色阴性无芽孢杆菌，细胞大小为1.1～1.5×2～6.0 µm。
周身鞭毛、运动或不运动。
能形成荚膜和微荚膜。
最适生长温度37℃，可在15～46℃生长。
最适pH为7.4～7.6。
在营养肉汤培养基中，37℃培养24小时后，形成菌膜，管底粘液状沉淀，培养物有粪臭味。
在伊红美兰琼脂（EMB）平板上，典型的菌落呈紫黑色，有金属光泽，菌落扁平，低度凸起，光滑湿润。
也有呈粉红色、无金属光泽、中心紫色的菌落。
在麦康凯琼脂（MaCC）平板上，菌落扁平、圆形、光滑湿润。
呈桃红色、微红色或菌落中心桃红色。
2. 生化实验原理（1）MUG试验97％的大肠埃希菌含有β—葡萄糖醛苷酶，可分解4—甲基伞形酮β－D－葡萄糖苷酸，生成的4—甲基伞形酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。
（2）靛基质试验（I实验)有些细菌具有色氨酸酶，在蛋白胨水培养基中生长时，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。
靛基质无色，不能直接观察，加入靛基质试液（对二甲氨基苯甲醛试液），产成红色的玫瑰靛基质。
色氨酸酶活性的最适pH为7.4～7.8。
pH降低，靛基质产生减少，可能出现假阴性或弱阳性反应，故培养基pH应为7.4～7.6 。
因产生靛基质的细菌都能发酵糖类而产酸，增加培养基的酸度，不宜用含葡萄糖的培养基进行此试验。
（3）甲基红试验（M）肠杆菌科细菌均可发酵葡萄糖产生酸性代谢产物，使培养基pH值下降，最初可使甲基红指示液［变色域pH4.5－5.4（红→黄）］变色而呈现阳性反应。
但继续培养后，产气杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成一分子的中性乙酰甲基甲醇而使培养基pH值上升至5.4以上，使甲基红指示液变为桔黄色（甲基红试验阴性）。
而大肠埃希菌则继续产生大量的酸，如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，保持高氢离子浓度，故甲基红试验为阳性反应。
2CH3COCOOH→2CO2+CH3CO·CHOHCH3丙酮酸乙酰甲基甲醇（4）乙酰甲基甲醇生成试验(V－P)此项实验主要用于鉴别大肠埃希菌和产气杆菌这两种细菌在分解葡萄糖后的进一步反应。
大肠埃希菌于产生丙酮酸后，丙酮酸进一步分解形成甲酸、乙酸、乳酸等。
产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性环境下被空气中的氧气氧化成二乙酰（丁二酮），丁二酮与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基作用，生成红色化合物。
试验中加入的α—萘酚试液起到催化剂的作用，使反应的颜色增强。
（5）枸櫞酸盐利用试验（C）枸椽酸盐培养基中仅含有无机盐和唯一的有机物—枸椽酸。
一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源。
因此，根据能否利用枸椽酸盐，能鉴别某些菌种。
产气杆菌可以分解枸椽酸盐而取得碳源，能在含有枸椽酸盐的培养基上生长形成菌落, 并分解枸椽酸盐生成碳酸钠，使原来在pH7.0以下的培养基转为碱性，用溴麝香草酚兰作指示剂，接菌后的枸櫞酸盐培养基经过培养，培养基颜色由最初的绿色变为深兰色。
大肠埃希菌不能分解枸椽酸，所以得不到碳源不能生长，接菌后的枸櫞酸盐培养基经过培养，培养基中的溴麝香草酚兰指示剂也不会变色，培养基保持原来的绿色。
二、大肠菌群大肠菌群为水质粪便污染的指示菌。
是指37℃生长时能发酵乳糖，24小时内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌。
大肠菌群不是分类学上的名称，符合此定义的细菌包括埃希菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属和枸櫞酸菌属等菌属的细菌。
涵盖了正常人畜肠道内全部需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。
乳糖发酵实验原理：各种细菌含有发酵不同糖的酶，能分解不同的糖而产酸、产气，有的仅产酸，而不产气。
大肠菌群分解胆盐乳糖发酵培养基中的乳糖产酸，使培养基中的溴甲酚紫指示液由紫色变为黄色；产气可使液体培养基中的倒置小管内出现气泡。
三、沙门菌1.沙门菌特性沙门菌为肠杆菌科沙门菌属细菌，是人畜共患的肠道病原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒。
可通过人、畜、禽的粪便或带菌者接触，直接或间接地污染药品原、辅料及生产的各个环节，以动物来源的药物，如脏器、粪便、全虫体等污染机率更高。
因此，药品微生物限度标准规定，以动物来源的药物、生物脏器制品（不包括蜂蜜、王浆、动物角、阿胶）等的口服给药制剂不得检出沙门菌。
沙门菌为革兰阴性无芽孢短杆菌，菌体大小在0.4～0.9µm×1～3µm，两端钝圆,具周身鞭毛，能运动，一般无荚膜，少数有包膜。
沙门菌属营养条件要求不高，在营养琼脂平板上为无色半透明、表面光滑、湿润、隆起的菌落；直径在2～3mm。
生长温度10～42℃,最适温度37℃, pH范围4.5～9, 最适pH为6.8～7.8。
需氧或兼性需氧。
有时有粗糙型菌落，干燥、无光泽、边缘不整齐、中心和边缘不一致。
胆盐硫乳琼脂（DHL）、沙门、志贺菌属琼脂（SS）、麦康凯琼脂（Macc）及曙红亚甲兰琼脂（EMB）培养基中，都含有乳糖。
埃希菌属能发酵乳糖产酸产气，沙门菌则不能。
另外，埃希菌属不能分解含硫氨基酸生成硫化氢，而沙门菌属90%以上的菌H2S为阳性反应。
产生的H2S遇培养基中的铁盐生成FeS沉淀物（黑色沉淀物）。
因此，沙门菌在含有糖指示剂的EMB 和Macc培养基平板上，菌落为无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润。
在DHL和SS琼脂平板上，因培养基中含有糖和H2S指示系统，菌落中心带黑色或几乎全黑色。
2. 三糖铁琼脂培养基上的特征及其生化反应原理三糖铁琼脂培养基高层斜面：沙门菌在TSI斜面的反应为：(1)斜面呈碱性（红色），底层呈酸性（黄色），H2S阳性（底层黑色）或阴性（无黑色）。
(2)斜面及底层均为黄色，底层黑色。
实验原理：三糖铁琼脂培养基含二套指示系统，可检查糖类发酵情况和硫化氢产生。
培养基中含乳糖、蔗糖和葡萄糖（比例为10:10:1)；硫酸亚铁和还原剂硫代硫酸钠；酸碱指示剂为0.2%酚磺酞指示液[pH6.8～8.4（黄→红）]。
培养基灭菌后的pH值约为7.3。
若待检菌能够发酵乳糖或蔗糖，则产酸量较多，使整个培养基（斜面及底层）均呈黄色：如仅发酵葡萄糖，产酸量少，斜面部分由于细菌生长分解蛋白胨而产生氨，使培养基pH上升，酚磺酞指示剂显示碱性色（红色）。
而底层部分由于氧压较低，仍保持酸性反应呈酸性色（黄色）。
产生H2S的细菌使硫代硫酸钠分解，产生的H2S与Fe2+形成FeS不溶性黑色沉淀。
反应需在较为厌氧的条件下进行，故观察到的黑色反应在培养基底层。
三糖铁琼脂斜面系半固体培养基，细菌发酵糖产生气体，可使琼脂层出现气泡甚至断裂，绝大多数沙门菌的细菌均产生气体。
另外，穿刺接种部分还可观察细菌有无动力。
有动力的细菌生长后，可由穿刺线扩展到整个底层，使培养基变浊，无动力的细菌仅沿穿刺线生长，形成一条清晰的生长线。
沙门菌仅发酵葡萄糖，不发酵乳糖及蔗糖，产生H2S (90％以上）。
大肠埃希菌能发酵葡萄糖、乳糖，部分能发酵蔗糖而产酸、产气，不产生H2S。
它可使TSI斜面和底层整个变为酸性色（黄色），琼脂层出现气泡甚至断裂。
Na2S203 + 2H＋→H2S↑+ Na2S03H2S + Fe2＋→FeS↓+ 2H+细菌还原硫代硫酸钠产生硫化氢，须在酸性环境和厌氧条件下，培养基中糖的成分可提供酸性环境，培养基底层需要一定高度，以保持较为厌氧的环境，故在三糖铁高层培养基斜面的底层可有黑色FeS沉淀物产生。
如出现疑似沙门菌的三糖铁琼脂管应继续分别作革兰染色、镜检，生化反应及血清学凝集试验。
3.靛基质试验用接种环沾取少许培养物接种至蛋白胨水培养基管，照大肠埃希菌靛基质试验操作，判断结果。
沙门菌应为阴性反应。
4. 脲酶试验变形杆菌属的细菌具有尿素酶，能分解培养基中的尿素，产生大量的氨，使培养基呈碱性，酚磺酞指示剂显红色。
沙门菌属和志贺菌属的细菌无此反应。
其他肠道细菌的尿素酶试验多数为阴性反应。
试验以培养基产碱为判断依据，某些细菌能利用培养基中的蛋白陈水解后，也可使培养基pH升高，造成假阳性。
因此，须用无尿素的相同培养基作为对照管。
4.赖氨酸脱羧酶试验细菌分解氨基酸使其脱羧，生成胺和CO2，此反应由细菌产生的脱羧酶来完成。
各种细菌产生不同的氨基酸脱羧酶，均可使培养基变碱，由培养基中的指示剂显示出来。
沙门菌属除伤寒沙门菌和鸡沙门菌外，此反应均呈阳性。
志贺菌属除宋氏和鲍氏志贺菌外均为阴性。
注意事项：(1)沙门菌经培养1-2天，大多数出现阳性结果，亦有3-4天出现的。
(2)经培养后，阴性对照管必须为黄色，否则试验无效。
(3)判断结果时，必须与未接种的培养基进行比较，试验管只要有紫色痕迹出现都可判为阳性结果。
培养时间最长不得超过4天。
否则，可因蛋白胨中的氨基酸分解产碱而出现假阳性。
6. 氰化钾试验氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂。
细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的辅基为铁卟啉，氰化钾能与铁卟啉结合，使这些酶失活，从而抑制细菌生长。
但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在下仍能生长。
借此特性可以鉴别不同种属的细菌。
当培养基中氰化钾的含量在1:104或1:1.33 ×104时，肠杆菌科的沙门菌属，志贺菌属和大肠埃希菌属的细菌生长受到抑制，其他细菌仍可生长。
注意事项：(1) 氰化钾为剧毒品，操作时须特别慎重，勿用口吸溶液，用后的培养管加少量硫酸亚铁和0.5ml的20%氢氧化钠去毒，再高压灭菌、洗涤。
(2) 氰化钾培养基试管灭菌后换橡胶塞封口，以防止氰化钾分解成氰氢酸气体，使氰化钾浓度下降，抑制作用减弱，造成假阳性。
(3) 接种1环肉汤培养基培养物即可，过量接种在未培养前就产生混浊，造成假阳性。
7. 血清凝集试验沙门菌的抗原有三种：菌体抗原（O抗原）、表面抗原（K抗原）和鞭毛抗原（H抗原）。
表面抗原是菌体抗原的一种，是荚膜或鞘物质。
存在于细胞壁之外。
荚膜是疏松透明的多糖类胶状物，能耐受100℃或更高的温度。
鞘物质存在于少数沙门菌中，又称Vi抗原，经60℃加热或石碳酸处理即被破坏。
Vi抗原能阻止O抗原与O抗体凝集，加热破坏Vi抗原后，O抗原与相应的O抗体能发生凝集。
鞭毛抗原（H抗原）存在于细菌鞭毛中，不耐热，经60～70℃15分钟或者经乙醇或酸处理后即失去抗原性。
另在培养基中加入0.1％的石碳酸即可暂时抑制鞭毛的形成。
H抗原与H 抗体形成疏松状易摇散的絮状凝集。
菌体抗原也称为O抗原，能耐受100℃2.5小时，并能抵抗乙醇与0.1％石碳酸的破坏，与特异性血清形成颗粒状凝集。
形成慢，不易摇散。
现已知有50多种O抗原成份，分别以阿拉伯数字1, 2, 3……表示。
有的沙门菌有一种O抗原，多数沙门菌为两种以上O抗原；有的O抗原为一种菌独有，有的为几种菌共有。
