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USP43 <61>非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法介绍下文所述的试验将允许在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的定量计数。
这些测试主要用于确定一种物质或制剂是否符合既定的微生物质量标准。
当用于此类目的时，应按以下的规定进行，包括要样品取样量，和解释判断如下所述结果。
本方法不适用于含有活微生物作为活性成分的产品。
可采用包括自动化方法在内的替代微生物学方法，前提是已经证明与药典方法等效。
一般程序在避免待检产品的受到外来微生物污染的条件下进行测定。
防止污染的措施必须确保不会影响待检产品中微生物的检出。
如果待检产品具有抗菌活性，则应尽可能将其去除或中和。
如果灭活剂用于此目的，必须证明其微生物有效性和无毒性。
如果表面活性物质用于样品制备，应确认其对微生物无毒性，并且与所用的任何灭活剂相容性。
计数方法按照说明，使用薄膜过滤法或平板计数法之一。
最可能数(MPN)法通常用于微生物计数准确度较差；但是，对于某些生物负荷非常低的产品，这可能是最合适的方法。
方法的选择是基于产品的性质和微生物限度标准等因素。
所选方法必须允许测试足够的样本量，以判断是否符合质量标准。
所选方法的适用性必须经确认。
生长促进试验、计数方法和阴性对照的适用性一般要求必须建立检测待测产品中微生物的能力。
如果引入了可能影响测试结果的测试性能或产品变化，则必须确认其适用性。
试验菌株的制备使用试验菌株的标准化稳定悬浮液或按如下所述进行制备。
采用适宜的菌种保藏技术，以确保用于接种的微生物的传代次数不超过5代。
如表1所述，分别培养每种细菌和真菌测试菌株。
霉孢子悬浮，可将0.05%的聚山梨醇酯80加入该缓冲液中。
悬浮液在2h之内使用，或存放在2～8℃条件下24h内使用。
作为制备并稀释黑曲霉或枯草杆菌营养细胞的新鲜悬浮液的替代方法，可制备稳定的孢子悬浮液，然后将适量的孢子悬浮液用于试验接种。
稳定的孢子悬浮液可在2～8℃下保存，保存期需经过时间验证。
62 MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: TESTS FOR SPECIFIEDMICROORGANISMS非无菌产品微生物限度检查:控制菌（USP38）1.INTRODUCTION导言The tests described hereafter will allow determination of the absence of, or limited occurrence of, specified microorganisms that may be detected under the conditions described.控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
The tests are designed primarily to determine whether a substance or preparation complies with an established specification for microbiological quality. When used for such purposes, follow the instructions given below, including the number of samples to be taken, and interpret the results as stated below.当本法用于检查非无菌制剂及其原辅料是否符合相应的微生物限度标准时,应按下列规定进行检验，,包括样品的取样量,结果的判断.Alternative microbiological procedures, including automated methods, may be used, provided that their equivalence to the Pharmacopeial method has been demonstrated.可以使用包括自动化法在内的方法,需确认与药典方法的等同性.2.GENERAL PROCEDURES通用规程The preparation of samples is carried out as described in Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests 61.供试品制备,同USP<61>If the product to be examined has antimicrobial activity, this is insofar as possible removed or neutralized as described in Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests 61.若供试品有抗菌活性,应尽可能中和或去除,中和或去除的方法同USP<61>If surface-active substances are used for sample preparation, their absence of toxicity for microorganisms and their compatibility with any inactivators used must be demonstrated as described in Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests 61.若供试品制备过程中使用了表面活性剂,应确认其对微生物的无毒性以及与所用的中和剂/灭活剂的相容性，同USP<61>3.GROWTH-PROMOTING AND INHIBITORY PROPERTIES OF THE MEDIA, SUITABILITYOF THE TEST AND NEGATIVE CONTROLS 培养基适用性检查，控制菌检查方法的适用性确认，阴性对照The ability of the test to detect microorganisms in the presence of the product to be tested must be established. Suitability must be confirmed if a change in testing performance or a change in the product that may affect the outcome of the test is introduced.在有供试品存在的情况下，所建立的方法应能检测微生物。
中国药典2015年版性项下的有关内容对准确度进行评价。
2.精密度微生物定量检验的精密度是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样测定，其检验结果的一致程度，通常采用标准偏差或相对标准偏差来表示，也可以采用其他适宜的方式。
精密度验证的方法是：制备试验菌的菌悬液，齒悬液的浓度应选择为能够准确读数的最高浓度，然后系列稀释至较低浓度（如小于l O cfu/m l)。
每个试验菌选择其中至少5个浓度的菌悬液进行检验。
每一个浓度至少应进行10次重复检验，以便能够采用统计分析方法得到标准偏差或相对标准偏差。
一般情况下，可以接受的相对标准偏差(R S D)应不大于35%。
不考虑特殊的检验结果，替代方法的相对标准偏差（R S D)应不大于药典方法。
例如，药典菌落计数平皿法其可接受的相对标准偏差（R S D)与含菌浓度的关系见表2。
表2不同含蔺浓度下预期的相对标准偏差cfu/皿预期RSD<10<35%10 〜30<25%30 〜300<15%3.专属性微生物定量检验的专属性是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。
例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。
专属性验证时，应能够设计出可能使替代方法出现假阳性的实验模型来挑战替代方法，从而确认替代方法的适用性。
当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时(如不需要增菌或在1〜50cfu范围内就可直接测定菌数的定量方法），以上验证方式就显得更为重要。
4.定量限微生物定量检验的定量限是指样品中能被准确定量测定的微生物最低数量。
由于无法得到含有已知微生物数量的实验样品，因此，在定量限验证时，应选择在检验范围内至少5个菌浓度，每个浓度重复取样测定不少于5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。
中国药典2020微生物限度检查摘要：1.2020 版《中国药典》微生物限度检查概述2.非无菌产品微生物限度的检查要点3.微生物限度计数及其应用4.药典委发布的相关国家标准草案5.中药饮片微生物限度检查法6.美国药典USP 微生物限度检查对比正文：2020 版《中国药典》微生物限度检查概述2020 版《中国药典》对微生物限度检查进行了详细的规定，涵盖了非无菌产品、生物制品以及中药饮片等多个领域。
微生物限度检查是评估药品在生产、储存和使用过程中微生物污染程度的重要手段，对保证药品质量和患者安全具有重要意义。
非无菌产品微生物限度的检查要点非无菌产品的微生物限度检查主要包括以下几个方面：1.菌种及菌液制备：需要对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等菌种进行培养，制备成菌液。
2.培养条件：将菌液接种在胰酪大豆腺琼脂培养基上，在35℃条件下培养24 小时。
3.菌落计数：将培养后的琼脂平板按区域划分，对每个区域进行菌落计数，以评估样品中的微生物污染程度。
微生物限度计数及其应用微生物限度计数是评估非无菌产品微生物污染程度的重要方法，其主要包括以下几个方面：1.耐胆盐革兰阴性菌：此类菌对胆盐具有较强的耐受性，是药品中常见的微生物污染菌。
2.大肠埃希菌：作为肠道常见菌，大肠埃希菌可能导致肠道感染等疾病。
3.沙门菌：沙门菌是一种常见的食源性病原菌，可能导致食物中毒等疾病。
药典委发布的相关国家标准草案国家药典委员会发布了《凡例》、《微生物限度检查法》等5 份国家标准草案，以规范药品微生物限度检查的方法和要求。
其中，《生物制品》分包装及贮运管理、《鼠源性病毒检查法》等文件对药品微生物限度检查进行了详细规定。
中药饮片微生物限度检查法中药饮片微生物限度检查法用于检查中药材及中药饮片的微生物污染程度。
检查项目包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、耐热菌总数、耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌。
中药饮片微生物限度检查的试验环境应符合微生物限度检查的要求，全过程必须严格遵守无菌操作。
1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法中菌药典2015年版表3供试品的最少检验量供试品供试品装量每支供试品接人每种培养基的最少量液体制剂^I m llm l<C V^40m l40m K V< 100m lV>100m l全量半量，但不得少于l m l20m l10%但不少于20m l固体制剂M〈50m g50m g^M<C300m g300m g^M<C5g全量半量150m g500m g半量（生物制品）生物制品的原液及半成品半量医疗器具外科用敷料棉花及纱布缝合线、一次性医用材料带导管的一次性医疗器具(如输液袋）其他医疗器具取lOOmg 或lc m X 3cm整个材料①二分之一内表面积整个器具®(切碎或拆散开）①如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000m l以上，将其完全浸没。
1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检査。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检査时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（M ost-P rob a b l e-Numb e r M e tho d,简称MP N法）。
MP N法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，M P N法可能是更适合的方法。
非无菌药品微生物限度检查指导原则微生物限度检查是药品质量控制中的重要环节，尤其对于非无菌药品而言更为重要。
本文将对非无菌药品微生物限度检查的指导原则进行详细介绍，旨在提高药品的质量安全性。
一、检验项目及标准非无菌药品微生物限度检查的主要检验项目包括总生菌数、大肠菌群、霉菌和酵母菌等。
每一项检验项目都有相应的标准来衡量合格与否。
以下是常用的标准：1. 总生菌数：根据药典要求，大部分非无菌药品每克不得超过1000 CFU（菌落形成单位）。
2. 大肠菌群：大肠菌群是肠道中的常见菌种，其存在可能暗示有肠源性污染。
检验结果一般要求不得检出大肠菌群。
3. 霉菌和酵母菌：霉菌和酵母菌是环境中广泛存在的微生物，在非无菌药品中的存在可能引发变质，甚至导致严重的药品质量问题。
一般情况下，每克药品中不得检出霉菌和酵母菌。
二、样品的选择和采集在进行微生物限度检查前，需选择合适的样品，并采取正确的样品采集方式。
以下是一些常用的样品选择和采集方法：1. 样品选择：根据药品的特性，选择代表性的样品进行检测。
选取多个批次的不同规格的样品进行检验更有利于全面评估该药品的微生物污染水平。
2. 样品采集：在采集样品前，先进行适当的表面消毒，以避免外源性污染。
采集时应遵循严格的无菌操作，确保样品的真实性和可靠性。
常用的样品采集方法包括划线法、切割法、稀释法等。
三、检验方法和操作流程微生物限度检查需要使用一系列严格的操作流程和检验方法，以保证结果的准确性和可比性。
以下是一般的操作流程：1. 样品预处理：根据药品的特性，选择适当的预处理方法，如溶解、稀释、震荡等，以提高微生物的检出率。
2. 培养基选择：根据不同的菌种需求，选择适宜的培养基进行菌落的培养。
常用的培养基有营养琼脂平板、大肠埃希菌选择平板、马铃薯葡萄糖琼脂平板等。
3. 培养条件：根据菌种的生长特性和检验项目的要求，设定适当的温度、时间和培养条件，以促进菌落的生长。
4. 菌落计数：通过目视或自动计数法，对培养基上的菌落进行计数。
中国药典2020微生物限度检查
中国药典2020中对微生物限度的检查要求如下：
1.总菌落数限度：需满足以下要求：
- 不应含有大肠埃希菌或粪链球菌。
- 对无菌制品，其总菌落数规定不应超过制定的标准。
- 必须符合产品特性和验证的任何特定需求。
2.酵母和霉菌限度规定：
- 对无菌制品，每克中不应含有可繁殖的酵母和霉菌。
- 对非无菌制品，每克中不应含有可繁殖的酵母和霉菌。
建议
进行采样和检测多数生物制品样品。
3.大肠菌群限度规定：
- 每克中不应含有大肠菌群。
对某些产品（如消毒剂指定的测定），可以采用其他方法或者规定了合适分析方法的产品例外。
4.针对特定微生物的检查：
- 对某些产品，药典可能要求进行特定微生物的检查，以确保
产品的安全性和质量。
需要注意的是，这只是中国药典2020中关于微生物限度检查
的一般要求，具体的规定可能因产品类型和特性而有所不同。
因此，在进行微生物检查时，需根据产品的特定需求和合适的分析方法进行操作。
在实际生产和质量控制过程中，还需严格按照相关法规和标准进行操作，确保产品质量和安全性。
1107 非无菌药品微生物限度标准
非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的 危害以及药品的特殊性而制订的。
药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原 料、辅料及中药提取物的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质 量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。
1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂和原辅料 应符合 无菌检查法规定。
2.用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法规定。
3. 非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生 物限度标准（见表 1） 表1 非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微
生物限度标准 给药途径 需 氧 菌 总 数 （ cfu/g 、 或
2
控制菌 霉菌和酵母菌总数 （cfu/g、cfu/ml 或 cfu/10cm2） 不得检出大肠埃希菌（1g 或
cfu/ml cfu/10cm ）
口服给药 固体制剂 液体制剂 10
3
1ml） ；含药材原粉的化学药 102 101 品制剂及含脏器提取物的制 剂还不得检出沙门菌 （10g 或 10ml）
102
口腔黏膜给药制剂 齿龈给药制剂 鼻用制剂 耳用制剂 皮肤给药制剂 102 101 102 101
不得检出大肠埃希菌、金黄 色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 （1g、1ml 或 10cm2） 不得检出金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌（1g、1ml 或 10cm ）
2
呼吸道吸入给药制 剂
102
101
不得检出大肠埃希菌、金黄 色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、
1
耐胆盐革兰阴性菌（1g 或 1ml） 阴道、尿道给药制 剂 102 101 不得检出金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、白色念珠菌 （1g、1ml 或 10cm2） ；中药 制剂还不得检出梭菌（1g、 1ml 或 10cm2） 直肠给药 固体制剂 液体制剂 其他局部给药制剂 103 102 102 10
2
不得检出金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌（1g 或 1ml）
102 102 不得检出金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌（1g、1ml 或 10cm2）
4. 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（见表 2） 表 2 非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准 给药途径 需氧菌总数 （cfu/g、 cfu/mL 或 cfu/10cm2） 固体口服给药制剂 不含豆豉、神曲 10 （丸剂 3×10 ） 等发酵原粉 含豆豉、神曲等 发酵原粉 液体口服给药制剂 不含豆豉、神曲 等发酵原粉 含豆豉、神曲等 发酵原粉 103 102 5×102 102 不得检出大肠埃希菌 （1ml） ； 不得检出沙门菌（10ml） ；耐 胆盐革兰阴性菌应小于 101 （1 ml） 105 5×102
4 4
霉菌和酵母菌总数 （cfu/g、cfu/mL 或 cfu/10cm ）
2
控制菌
不得检出大肠埃希菌（1g） ； 10
2
不得检出沙门菌（10g） ；耐 胆盐革兰阴性菌应小于 102 （1g） 。
2
固体局部给药制剂 用于表皮或黏膜 不完整 用于表皮或黏膜 完整 液体局部给药制剂 用于表皮或黏膜 不完整 用于表皮或黏膜 完整 102 102 102 10
2
不得检出金黄色葡萄球菌、 103 10
2
铜 绿 假 单 胞 菌 （ 1g 或 ；阴道、尿道给药制 10cm ）
2
104
102
剂还不得白色念珠菌、梭菌 （1g 或 10cm2） 不得检出金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌 （1ml） ； 阴道、 尿道给药制剂还不得白色 念珠菌、梭菌（1ml）
5. 非无菌的药用原料及辅料微生物限度标准（见表 3） 表 3 非无菌药用原料及辅料微生物限度标准 需氧菌总数 cfu/g 或 cfu/ml） 霉菌和酵母菌总 数（cfu/g 或 cfu/mL） 药用原料及辅料 103 102 * 控制菌
注*：限度未做统一规定。
6. 中药提取物及中药饮片的微生物限度标准（见表 4） 表 4 中药提取物及中药饮片的微生物限度标准 需氧菌总数 cfu/g 或 cfu/ml） 霉菌和酵母菌总 数（cfu/g 或 cfu/mL） 中药提取物 103 102 * 不得检出沙门菌（10g） ； 中药饮片 * * 耐胆盐革兰阴性菌应小于 104（1 g）
3
控制菌
注*：限度未做统一规定。
7.有兼用途径的制剂 8.霉变、长螨者
应符合各给药途径的标准。
以不合格论。
非无菌药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数照“非无菌产品微生物限度检 查：微生物计数法” （通则 1105）检查；非无菌药品的控制菌照“非无菌产品微 生物限度检查：控制菌检查法” （通则 1106）检查。
各品种项下规定的微生物限 度标准解释如下： 101cfu： 102cfu： 103cfu： 可接受的最大菌数为 20； 可接受的最大菌数为 200； 可接受的最大菌数为 2000：依此类推。
本限度标准所列的控制菌对于控制某些药品的微生物质量可能并不全面， 因 此，对于原料、辅料及某些特定的制剂，根据原辅料及其制剂的特性和用途、制 剂的生产工艺等因素，可能还需检查其他具有潜在危害的微生物。
除了本限度标准所列的控制菌外，药品中若检出其他可能具有潜在危害性 的微生物，应从以下方面进行评估: 药品的给药途径：给药途径不同，其危害不同（眼、鼻或呼吸道给药） ； 药品的特性：药品是否促进微生物生长，或者药品是否有足够的抑制微生 物生长能力； 药品的使用方法； 用药对象：用药对象不同，如新生儿、婴幼儿及体弱者，风险可能不同； 患者使用免疫抑制剂和甾体类固醇激素等药品的情况； 存在疾病、伤残和器官损伤，等等。
当进行上述相关因素的风险评估时，评估人员应经过微生物学和微生物数 据分析等方面的专业知识培训。
评估原辅料微生物质量时，应考虑相应制剂的生 产工艺、现有的检测技术及原辅料符合该标准的必要性。
说明： 1.微生物限度标准收载于《中国药典》一、二、三部附录中，内容不同。
2.本稿是 2010 年版微生物限度检查中“微生物限度标准”的内容修订稿，标 准内容除了包括中药、化药和生物制品的微生物限度标准外，还增订了原料、辅 料、中药提取物及饮片的微生物限度标准。
4
3.增加了标准应用的相关内容，这部分内容是参照 ICH 协调案“药品微生物 质量”进行修订。
5
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