实验二十五基因重组实验Ⅳ——重组体的筛选与鉴定

实验二十五 基因重组实验Ⅳ——重组体的筛选与鉴定

[原理]

限制性内切核酸酶酶切鉴定：具体原理见实验二十一。

PCR反应鉴定：具体原理见实验十八。

[试剂]

1、DNA模板

2、引物

3、Taq DNA聚合酶

4、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）

5、10×PCR 反应缓冲液：100mmol/L Tris-HCl pH 8.3，500mmol/L

KCl，15mmol/L MgCl2，0.1%明胶

6、矿物油

1、超纯水

8、EcoR I酶解反应液（10×）: 1mol/L pH7.5 Tris-HCl , 0.5mol/L

NaCl , 0.1mol/L MgCl2 。

9、Hind III酶解反应液（10×）：1mol/L pH7.4 Tris-HCl , 1mol/L

NaCl , 0.07mol/L MgCl2 。

3.50×TAE 电泳缓冲液：称取242克Tris，加入57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA，调节pH至8.0，加蒸馏水至1000ml。

10、.凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液（w/v）。

11、1%（1.5%）琼脂糖凝胶：1×TAE 100ml含1g（1.5g）琼脂糖。

[器材]

1、DNA扩增仪

2、电泳仪、电泳槽

1 3、微量移液器

4、紫外投射仪

5、0.5ml塑料离心管

6、样品槽模板（梳子）

7、锥型瓶（100ml或50ml）

8、一次性塑料手套

9、凝胶成像系统

[操作步骤]

1. 酶切反应体系的建立（20μl反应体系）

按下表要求配制酶切反应体系

质粒DNA 6μl 10×Buffer 2μl

HindIII 1μl H2O 10μl

EcoR I 1μl

混匀后置37℃水浴3h。

2. PCR反应体系的制备(25μl反应体系)

按下表要求配制酶切反应体系

DNA 2μl 10×Buffer 2.5μl

dNTP 0.1μl H2O 17.2μl

Primer-1 0.1μl TaqE 1μl

Primer-2 0.1μl 50%甘油 2μl

混匀后，2000rpm离心30sec，然后按

94℃ 5min

94℃ 40sec

55℃ 40sec 35cycles

72℃ 90sec

72℃ 3min

3. 电泳：1%琼脂糖凝胶（酶切）和1.5%琼脂糖凝胶（PCR反应）

将20μl酶切和PCR产物进行电泳，观察结果。

2 Vocabulary in Biochemical technology

A

Absorbance 吸光度

Absorbent 吸附剂

Absorption chromatography 吸附层析

Absorption spectrum 吸收光谱

Acrylamide, Aa/Acr 丙烯酰胺（单体）

Adenine, A 腺嘌呤

Affinity chromatography 亲和层析

Agarose 琼脂糖

Agarose gel electrophoresis，AGE 琼脂糖凝胶电泳

Allele specific oligonucleotide, ASO 等位基因特异性寡核苷酸杂交

Ammonium persulfate, AP 过硫酸胺

Angle rotor 角式转头

Anion exchange chromatography 阴离子交换层析

C

Carrier ampholyte 载体两性电解质

Cation exchange chromatography 阳离子交换层析

Cellulose acetate membrane electro

-phoresis，（CAME） 醋酸纤维薄膜电泳

Cellulose ion-exchangers 纤维素离子交换剂

Centrifuge 离心机

Centrifugal force 离心力

Centrifugal technique 离心技术

Coenzyme 辅酶

Column chromatography 柱层析

Cytosine, C 胞嘧啶

D

Denature gradient gel eletro

-phoresis , DGGE 变性梯度凝胶电泳

Deoxyribonucleic acid, DNA 脱氧核糖核酸

Dialysis 透析

Differential centrifugation 差速离心

3 Discontinuous PAGE 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

E

Eletro-osmosis 电渗

Emission spectrum 发射光谱

Exclusion chromatography 排阻层析

G

Gel chromatography 凝胶层析

Gel filtration 凝胶过滤

Guanine，G 鸟嘌呤

H

Homogenizer 匀浆器

Holozymase 全酶

I

Ion-exchange chromatography 离子交换层析

Ion-exchange gel 离子交换凝胶

Ion-exchange resin 离子交换树脂

Isoelectric focusing, IEF 等电点聚焦

Isoenzyme 同工酶

L

Ligand 配基

M

Melting temperature, Tm 溶解温度

Matrix 载体

Mobile phase 流动相

Molecular sieve filtration 分子筛过滤

N

N,N,N’,N’-methylenc

Bisacrylamide , Bis N,N,N’,N’-四亚甲基

双丙烯酰胺

N,N,N’,N’-tetramethylethylenedi

-amine, TEMED 四甲基乙二胺

4 O

Osmosis 渗透

P

Paper chromatography 纸层析

Partition chromatography 分配层析

Partition coefficient 分配系数

Photoelectric colorimetry 光电比色法

Plasmid 质粒

Polyacrylamide gel electrophoresis,

PAGE 聚丙烯酰胺凝胶

Polymerase chain reaction, PCR 聚合酶链反应

Primer 引物

R

Relative centrifugal force, RCF 相对离心力

Restriction endonuclease ，RE 限制性内切酶

Restriction fragment length

polymorphism, RFLP 限制性片段长度多态性

Rate zonal centrifugation 速率区离心法

Reverse osmosis 反向渗透

Revolution per minute ,rpm 每分钟转速

Ribonucleic acid, RNA 核糖核酸

Rotor 转头

S

Salting in 盐溶

Salting out 盐析

Saphadex 葡聚糖凝胶

SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶

Sedimentation coefficient 沉降系数

Sedimentation velocity 沉降速率

Sedimentation time,ST 沉降时间

Sepharose 琼脂糖凝胶

Sequencing 测序

Single strand conformative

polymorphism, SSCP 单链构象多态性

Sodium dodecyl sulfate, SDS 十二烷基硫酸钠

5 Spectrophotometer 分光光度计

Spectrophotometery 分光光度法

Stationary phase 固定相

Swing-out rotor 水平式转头

T

Thin-layer chromatography, TLC 薄层层析

Transmittance 透光率

Thymine, T 胸腺嘧啶

Transformation 转化

Transfection 转染

Transduction 转导

Transposition 转位

U

Ultrafiltration 超滤

Uracil, U 尿嘧啶

V

Visible and ultraviolet Spectro

-photometery 紫外可见分光光度法

Vector 载体