思考题完整

1  Q n 冷冻电镜技术与常规电镜技术有哪些差别？  定向包埋的目的是什么？怎样进行定向包埋？ 目的：用包埋剂逐步取代样品中的脱水剂，使细胞内外所有空隙都被包埋剂所填充。 定向包埋法：定向包埋方法是先在定向包埋板内加入配制好的包埋剂，再将样品按所需方向放入包埋板的尖端，加温聚合后，将带有固化包埋剂的样品从包埋板中取出，夹在特制的鸭嘴形样品夹中，再进行定向超薄切片。  常规包埋的具体步骤是什么？ a.将胶囊或包埋板放入60℃干燥箱甩烘干2小时左右；b.用吸管吸取配好的包埋剂灌满胶囊或包埋板，在其一侧放入用硫酸纸写好的样品标签小纸条（包括课题号、日期、包埋块号别等）；c.用牙签挑起样品，放入胶囊中央，静放数小时后样品会自然下落到胶囊的底部；d.将胶囊或包埋板放入恒温箱内加温聚合。加温时先37℃～45℃1天，后60℃恒温箱聚合2~3天。  包埋时要注意什么？ 1．浸透、包埋用注射器、吸管、烧杯、胶囊、牙签及其它器皿，均应在用前烘干，不能有任何水分；用后要及时清洗盛过包埋剂的容器，否则树脂固化后难以清洗。清洗时先用废纸擦净剩余的包埋剂，而后再用丙酮洗净。 2．所用药品均应注意防潮，药品应在干燥器中存放或在冰箱里保存。但从冰箱中取出的药品必须等到恢复至室温时才允许打开盖子，否则水分会进入药品内。 3．包埋时动作要轻巧，避免产生气泡影响切片。 4．操作时皮肤切勿接触包埋剂，以防引起皮炎，有的包埋剂有致癌作用，应注意防护。 5．制好的包埋块应放在带盖的小瓶里，存放在干燥器中，以防止包埋块吸潮变软影响切片。  618#树脂包埋剂配方是什么？ 618＃树脂 6ml DDSA 4ml DBP 0.3－0.8ml DMP－30 0.1—0.2ml  常用的脱水剂是什么？请回答具体步骤？脱水时要注意什么？ 乙醇和丙酮。彻底清洗样品 30分钟以上（中间换液数次） 50％乙醇或丙酮 10～15分钟 70％乙醇或丙酮 10～15分钟（如因工作安排关系，可置4℃冰箱内过夜） 80％乙醇或丙酮 10～15分 90％乙醇或丙酮 10～15分钟 100％乙醇或丙酮 2次，每次30分钟。游离和培养细胞的脱水时间可适当缩短。 注意：．脱水彻底，100％乙醇或丙酮应绝对保证无水（用无水硫酸钠、无水硫酸铜等吸水处理）。 2．当天完不成浸透、包埋时，将样品停留在4℃70％脱水剂中保存过夜，一般认为70％的浓度时所引起的组织块体积变化最小。高浓度的脱水剂中不可停留过夜、不仅引起组织内过多物质被抽提，而且会使组织块发脆造成切片困难。 3．脱水时，动作要尽量迅速，特别是100％脱水剂时，更要注意样品块不要在空气中停留时间过长，否则会造成样品干燥，使样品内产生小气泡致使包埋剂难以浸透。潮湿季节在空气中暴露时间过长也会吸水受潮。  常用的固定剂戊二醛与锇酸有什么优点与缺点？固定时要注意什么？ 戊二醛固定剂 优点：①对组织的渗透力比锇酸大，而且能保存组织内某些酶活性；②与蛋白质之间的反应较快，能较好地保存蛋白质的结构；③对细胞内的微管及滑面内质网、线粒体等膜性结构保存较好；④可以较好地固定和保存组织里的糖原；⑤能够较好的固定植物组织。缺点：①没有电子染色作用，单独用它固定的生物样品电子反差不好；②脂类及其他一些微细结构，在脱水时易被提取出来。 2

（戊二醛－俄酸双重固定法：固定法可充分发挥戊二醛与四氧化锇二固定剂的优点，有利于保存细胞内各种微细结构）  取材时的原则是什么？为什么要小？ 快、准、轻、小、低的原则 。因为液的穿透能力都比较弱，所以为了保持样品近于生活状态的微细结构，取材大小当然要与固定液的穿透速率相适应，一般以1mm3为宜。样品过大时内部固定不良，样品过小时观察的目标又会受到局限。  影响固定效果的因素有哪些？ 固定液 酸碱度（pH值） 渗透压 缓冲液 固定液的温度、时间 样品块的大小 组织 结构如表皮的腊质、细胞 壁等  超薄切片会有哪些缺陷？怎样产生？如何消除？ ①刀痕（垂直于刀刃的纹路），产生原因：a.刀刃上有细的锯齿b.刀刃上有脏物c.组织中有硬质材料，排除方法 ：选择无锯齿的刀刃；除去脏物；修去硬材料 。 ②震颤（平行于刀刃的周期性的疏密相间的纹路），产生原因：a.包埋块太软或太硬；b.切面、间隙角、切速太大；c.样品头或刀固定不紧；d.刀与样品块间发生一种原因不明的高频振动。排除方法：a.调整包埋剂配方，改变包埋块的切削性能；b.作适当的调整；c.挤紧所有可动部分；d.改变切片速度或调节微调进刀以破坏这种固有频率的振动 。 ③褶皱（切片挤压有不规则的褶叠），产生原因：a.包埋块太软；b.刀钝；c.切面太大；d.切片速度太快，排除方法：a.重新加温聚合或更换包埋块；b.换刀；c.缩小切面；d.降低切削速度 ④切片中有空洞，产生原因： a.包埋剂中有气泡、浸透不好；b.样品中有硬质材料，排除方法：a.消除气泡、使浸透完全；b.削去硬质材料 ⑤同一张切片上的厚度不均匀，产生原因：a.包埋介质与样品硬度不一致或样品本身有天然界面；b.刀刃锐度不一，钝的刀刃部分切片较厚；c.由于震颤造成周期性的厚度不均匀，排除方法： a.重新修块、尽量除去空白包埋介质：b.更换刀刃位置或换刀；c.消除产生震颤的原因。  电境下细胞膜呈什么结构？损伤时有什么表现？ 电镜下呈三层结构，总厚度为7.5-9纳米(nm)，其内外层均为嗜锇层，在电子染色下呈高电子密度；中间为非嗜锇性的双分子脂质层，电子染色下呈低电子密度。 细胞膜破损：膜上出现多少不一、大小不等的破孔或缺损。  细胞核发生超微病变时有哪些状况？ 细胞核的超微病变： a.外形的改变：正常：圆形、椭圆形，膜略有曲折；病理情况：核膜内陷，裂核(cleaved nucleus)、曲核、脑回状核(cerebriform nucleus)等。 b.核膜的变化：病理情况：增厚、复层化；核膜膨出；核内膜形成板层、小管、液泡；核突或核袋、核纤维板层等。 c.染色质的变化：病理情况：结块、边集、均匀化等。 d.核仁的变化：病理情况：增大或肥大、形状不规则、数目增多、边集、空泡、环形、纤维成分与颗粒成分分离等。  如何运用电镜分析植物籽粒各部的元素？这种方法有什么优缺点？ 扫描电镜，使用能谱仪进行元素分析，  能谱分析的原理是什么？ X光电子能谱分析的基本原理 一定能量的X光照射到样品表面，和待测物质发生作用，可以使待测物质原子中的电子脱离原子成为自由电子。 光电子能谱的基本原理 单电子过程——吸收一个光子发射一个光电子的光电离： M + hν→ M+ + e- （1）光电子能谱仪把不同动能的光电子区分开来。分别测出它们的数量。即测出光 3

电子按动能的分布，对光电子动能或电离能作图，即为光电子能谱图。  扫描电镜与透射电镜在成像原理上有什么差别？ 就原子之间的距离（≥1 Å）和原子核及周围电子的大小（10－5～10－6 Å ）而言， 物质本身实际是一个几乎完全空的空间，如果样品足够薄（小于0.1μm），那么入射电子就能够通过样品，将通过样品的电子叫作透射电子。入射电子在通过样品时，由于受到样品物质库仑场的作用不同，就带有样品内部不同的信息，将透射电子所带的信息转换成图像即透射电子像。 样品物质原子的核外电子受入射电子激发后，逸出样品表面时，就称为二次电子。二次电子可在距样品表面500 Å深度内产生，但由于样品的吸收等作用，只是在距表面100 Å深度内的二次电子才能逸出样品表面，成为二次电子信号。逸出的二次电子能量一般低于50eV。二次电子是扫描电镜观察样品表面形貌的主要信号，二次电子所携带的信息是通过显像管显示的。二次电子数量的多少决定显像管的亮度和反差，而二次电子数是由加速电压、照射电流、束斑直径、样品表面形态、样品成分、电子束入射方向等条件决定的，二次电子数量越多，图像质量越好。  高能电子与样品作用主要会产生什么信息？如何运用？ 透射电子（TE） 二次电子（SE） 俄歇电子（AE） 背散射电子（BSE ） 特征X-射线（Character x-rays ） 吸收电流 (略) 阴极荧光 (略) 利用透射电子进行分析的电镜即为透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope TEM)。 二次电子是扫描电镜观察样品表面形貌的主要信号，二次电子所携带的信息是通过显像管显示的。 因此可利用检测俄歇电子进行元素分析。利用俄歇电子讯号进行元素分析的仪器叫作俄歇电子谱仪。 利用背散射电子讯号可以观察样品表面形貌和成分差异的图像，分辨能力低于二次电于像。 分析表明有两种X-射线谱，一种是连续的；另一种是不连续的，它只有几条特殊的谱线，是样品物质原子的内层电子状态转变时所产生的辐射，对于不同的元素其能量不一样，也称为“特征X射线谱”。利用特征X-射线可以对样品进行元素的定性或定量分析，利用波长进行分析的仪器，是波长分散谱仪（WDX）；利用能量进行分析的仪器，能量分散谱仪（EDX）。用X射线进行样品成分分析时，特征X-射线多产生于样品深度为0.5～5μm范围内  影晌扫描电镜图像质量的因素有哪些？ 分辨率：决定的主要因素是：电子束的束斑直径、束流大小和电子波长；镜筒真空度；一次电子在样品中的扩散范围和产生；二次电子的范围。若束斑100 Å，则分辨率再高也达不到100 Å。要想提高分辨率，首先必须缩小束斑直径，为此要用2～3级聚光镜将电子枪发射出的30～50μm的交叉光斑缩小为3～10nm的探针。而场发射枪的束斑可缩小到1nm以下，探针的电流强度必须保证在10－12－10－11A以上。若电流太小，激发出的二次电子数量少，图像过暗，难以区分图像细节。电子束波长越短，分辨率越高。电子束波长一致才能避免色差。具有高而稳定的真空度，才能保证束电子不被散射。电子束射入样品之后，由于散射作用将向各方向扩散，其形状呈水滴状，其范围大小由入射电子本身所具有的能量、样品成分及性质决定。可采取低压观察薄样品的方法及增加样品导电性、喷镀重金属膜等方法缩小扩散范围。 焦深：焦深大是扫描电镜的最大特点，扫描电镜的焦深范围约在1mm至0.1μm。有些厂家可以做到10mm。清晰度也是衡量图像质量因素之一，除图像像素数目，精确聚焦和消像散，设立最佳观察条件等因素外，制备样品的方法和质量也对图像清晰度有较大影响。 亮度与对比度 扫描速度  怎样运用扫描电镜观察细菌？ a. 细胞壁：厚度因细菌不同而异，一般为15~30nm。 b. 细胞膜：是典型的单位膜结构，厚约8~10nm，外侧紧贴细胞壁。通常不形成内膜系统 。 C. 细胞质与核质体 ：没有核膜 ，DNA集中在细胞质中的低电子密度区，称核区或核质体（nuclear body）。细菌一般具有1-4个核质体，多的可达20余个。 d.鞭毛：是某些细菌的运动器官，由一种称为鞭毛蛋白（flagellin）弹性蛋白构成，结构上不同于真核