一株短蛸消化道产蛋白酶菌株的分离鉴定及其酶学性质研究

[5] 和豆芽汁 酵母培养基。 各培养 基均 用 VNSS 液 （九盐 溶液）
体重 300 g 左右， 试验前放置于水族箱内暂养 7 d， 水温 15 益，
配制。
器 将灭 菌的 九 盐溶 液 注 入并冲 洗 3 次 ， 分别 放 入玻璃 匀 浆 器中， 各加 1 ml 灭菌的九盐溶液后匀浆。 依次稀释到 10-1 和
剂法 测定其 酶 活 力。 先 取 0.5 %酪 蛋 白 溶液 1 ml， 加不同 梯 度 pH 值 的磷酸盐缓冲液 4 ml， 然后加 30 益水浴 5耀10 min， 入 1 ml 酶 液 ， 保 温 15 min， 加 入 3 ml 10 % 三 氯 乙 酸 终 止 反
分别取 0.1 ml 原液、 10-2， 10-1 和 10-2 稀释液涂布海水琼脂平
++ +
++
黄 色 Yellow 黄 色 Yellow
土 黄色 Khaki
SG21 SG22 对照 Control
小肠 Small intestine 芽孢 Spore
小肠 Small intestine 梭菌 Clostridium
+ ++
深 黄色 Dark yellow 浅 黄色 Light yellow
培养基 生长 Culture Growth medium 小肠 Small intestine 海水琼脂 + Seawater agar 盲囊 Blind sac 海水琼脂 + Seawater agar 分离部分 Isolated part ++ +
凸起 白色 ， White， processes 突起 橙 黄色， Orange yellow, processes 突起 土 黄色， Khaki, processes 土 黄色 Khaki 黄 色 Yellow 黄 色 Yellow 黄 色 Yellow 黄 色 Yellow 黄 色 Yellow 土 黄色 Khaki 土 黄色 Khaki 黄 色 Yellow 黄 色 Yellow

大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。

通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。

酸性蛋白酶高产菌株选育及酶学性质的研究张秀江;胡虹;范国歌;郜峰;谷立峰【摘要】The mutant strain Y06 capable of producing high-yield acid protease was obtained through ultraviolet light and nitrosoguanidine mutation of Aspergillus niger. The protease activity of strain Y06 was 36 134 U/g, which increased 46 times compared with wild-type strain of 768 U/g. The optimal pH value .temperature .water content , adding amount of nutrients and fermentation time of cultivation were detected for high yield of producing high-yield acid protease. The acid protease activity and stability in various conditions were also determined. This study provides important experiment basis of the production and use of acid protease.%采用紫外线和亚硝基胍联合诱变,得到酸性蛋白酶高产的黑曲霉菌株Y06,提高了其产酸性蛋白酶能力.结果表明,诱变后菌株的酶活由768 U/g提高到36 134 U/g,相对于出发菌株提高了46倍.为优化高产酸性蛋白酶的固体培养条件,检测了培养菌株最适pH值、温度、含水量、营养物质添加量及发酵时间等,并对所产酸性蛋白酶在各种条件下的酶活力和稳定性进行测定,为生产和利用酸性蛋白酶提供重要的实验基础.【期刊名称】《河南科学》【年(卷),期】2012(030)003【总页数】6页(P327-332)【关键词】酸性蛋白酶;黑曲霉;菌株选育;紫外线;亚硝基胍【作者】张秀江;胡虹;范国歌;郜峰;谷立峰【作者单位】河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008;河南省瑞特利生物技术有限公司,郑州450008;河南省瑞特利生物技术有限公司,郑州450008;河南心连心化肥有限公司,河南新乡453731;河南省科学院生物研究所有限责任公司,郑州450008【正文语种】中文【中图分类】Q939.96酸性蛋白酶是一种能在酸性（pH值2～5）条件下将大分子蛋白质迅速水解成肽类和部分游离氨基酸的酶类.它具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于酿造、食品、医药、皮革工艺以及胶原纤维工业中[1-4].酸性蛋白酶的来源主要通过微生物发酵，产酸性蛋白酶的微生物菌种有很多，如米曲霉、黑曲霉、芽孢杆菌等[5-7].在微生物发酵工业中，菌种性能对产量起决定作用.由于我国蛋白质饲料资源严重缺乏，需要寻求非常规蛋白资源，而动物对非常规蛋白饲料的利用效率很低.随着集约化畜禽生产的发展，提高饲料中蛋白类营养物质的利用效率，显得尤为重要.因此，酸性蛋白酶被作为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出巨大的潜在价值，越来越受到饲料、养殖和动物营养界的高度重视[8-9].本实验以黑曲霉为出发菌株，采用紫外线（UV）与亚硝基胍（NTG）联合诱变，筛选出酸性蛋白酶高产菌株——黑曲霉（Aspergillus niger-Y06），该菌株产酶能力得到显著提高，进一步节约了成本，推进酸性蛋白酶工业的发展.另外，发酵生产酸性蛋白酶采用固体发酵法的浅盘式发酵和厚层通风式发酵相结合的生产工艺，通过对黑曲霉产酸性蛋白酶生产工艺生产条件的试验研究，确定了酸性蛋白酶发酵生产的技术工艺，并对相关的技术参数进行了优化.1.1 试验材料1.1.1 出发菌株黑曲霉（Aspergillus niger）由中国工业微生物菌种保藏中心保藏的原始菌种，CICC编号：3.430 9.1.1.2 分离及斜面培养基斜面培养基为PDA培养基和察氏培养基（硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，加热溶解，自然pH，分装后121℃灭菌20 min），分离培养基是在察氏培养基中加入1%的酪蛋白.2.1 菌种的分离和纯化采用常规稀释分离法.2.2 发酵培养方法按要求配制发酵基质，调节初始含水量和pH后，取150 g分装于1 L三角瓶中，在0.1 MPa压力条件下灭菌30 min后，冷却接种，接种量为0.3%，于不同条件下发酵84 h，干燥后，进行酶活力的测定.2.3 紫外线诱变处理取0.1 mL稀释的孢子悬液涂布初筛平板，30℃培养4 h，紫外灯预热30 min后，将平皿置于距15 W紫外灯 30 cm 处分别照射 0 s（对照）、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min，每个处理各做 2组.随后在暗光条件下，用5 mL无菌生理盐水对平皿上的菌进行洗脱，适当稀释后，涂布于分离培养基，以黑布包裹30℃下避光培养3～4 d，根据长出菌落与其水解圈直径比的大小及菌落形态的变化，挑选所需菌种，编号并保存，同时根据平皿菌落数计算致死率，从而求得成活率. 式中：A为对照组平皿上的菌落数；B为诱变处理后平皿上的菌落数.2.4 亚硝基胍诱变处理取3 mL稀释的孢子悬液，加入等体积的亚硝基胍溶液，充分混合，于30℃振荡处理1 h（做2组），取出稀释涂分离培养基，30℃培养5 d，挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验，并编号保存.挑取一接种环生长在PDA斜面上的新鲜孢子接入装有50 g培养基的500 mL三角瓶中，培养温度为30℃，培养时间5 d，测定酶活.2.5 酶活测定1 g酶粉在40℃，pH值为3.0反应条件下，1 min内水解酪素产生1 μg酪氨酸为一个酶活力单位（U/g）.3.1 菌株选育结果3.1.1 紫外线诱变紫外线诱变的机理是能作用于嘧啶，形成嘧啶二聚体（主要是TT），影响DNA正常解链与碱基配对，从而引起基因突变，提高酶产量[10].为了改良生产菌，本试验采用紫外诱变的方法照射原菌，稀释分离后涂布在分离平皿.紫外照射孢子成活率结果如表1所示.为了筛选在固体培养条件下产酶高的菌株，经紫外线诱变处理后，得到100余株突变株.这些菌株在形态上有一定的差异，依照其菌落的形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度以及水解圈的大小，从中挑选出20株先经三角瓶液体发酵产酶测定，获得10个高产菌株再经三角瓶固体发酵培养复选，菌株产酸性蛋白酶活力如表2所示.其中z－10的酶活最高为9284 U/g（干基），比出发菌株（CK）提高了11.1倍.3.1.2 亚硝基胍诱变选择经紫外线诱变产酶最高的z－10菌株用亚硝基胍进行进一步诱变处理，由酪蛋白平板初筛得到菌株36株，经摇瓶复筛得到菌株10株，此10株再经三角瓶固体发酵复筛.酶活力超过2.5万U/g（干基）的菌株有4株，基中Y06株产酶，其最高酶活力为36 134 U/g，相对于出发菌株（CK）提高了46倍.经亚硝基胍诱变，选择酶活最高的菌株进行酸性蛋白酶生产性试验，结果如表3所示.3.2 影响酸性蛋白酶菌株（Aspergillus niger－Y06）产酶因子的研究3.2.1 固体培养条件对酸性蛋白酶菌株产酶的影响1）温度温度是固态发酵一个重要的可调节参数，它是影响微生物生长和繁殖的重要条件之一，另一方面由于固态发酵传热性差，如果不能迅速将发酵热移出，将会使发酵温度急剧上升，导致温度失控，进而使发酵反应无法进行.为寻求合适的发酵温度，本研究以酸性蛋白酶发酵培养基含水量为68%、pH值为6.5的条件下培养84 h，分别在27℃、30℃、33℃、36℃和39℃不同温度下进行发酵培养，并测定酶活力，图1证明了酸性蛋白酶菌株产酶最适温度发酵为33℃，结果见图1. 2）水分含量对于固态发酵来说，控制培养基的水分是固态发酵过程中的重要环节之一.适宜的含水量，使得培养基有合适的疏松度，颗粒间存在一定空隙，有助于菌体从培养基获得营养物质和氧的传递，从而促进生长繁殖.过高的含水量会导致培养基粘结成团，多孔性降低，影响氧的传递；含水量过低，则使基质膨胀程度降低，水的活度低，从而抑制菌体生长.含水量过高过低都对黑曲霉生长繁殖及孢子的形成不利，从而影响酸性蛋白酶活性.本研究将黑曲霉分别接种到初始pH值为6.5，含水量分别为60%、64%、68%、72%、76%和80%的固态发酵培养基上，在33℃下进行发酵培养试验，图2结果表明含水量68%时酸性蛋白酶高产菌株产酶达最高值.3）pH值为了研究发酵培养基的pH值对酸性蛋白酶菌株产酶活性的影响，根据固体培养基难以调节pH特点，我们利用缓冲溶液对培养基用水的pH值进行调整.本研究在培养基初始含水量为68%，温度为33℃条件下发酵84 h，观察发酵培养基pH值对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，黑曲霉固态发酵最适pH值为6.5，结果见图3.4）玉米粉添加量本研究按不同比例将玉米粉添加到基础培养基（由麸皮、豆粕和玉米淀粉组成）中，以补充碳源，于30℃、初始pH值为6.5和含水量为68%条件下发酵，观察添加玉米粉对酸性蛋白酶活性的影响，由图1可知，当添加玉米粉质量分数为2%时，酸性蛋白酶菌株产酶最大时，随着玉米淀粉添加量的增加，基质易结团而影响氧的传递，酸性蛋白酶活力急剧下降.5）豆粕添加量为了使菌株生长更好，并对菌株产酶进行诱导，本研究在培养基中添加豆粕粉作为补充氮源，于33℃、初始pH为6.5和含水量为68%条件下发酵，考察其对酶活产生的影响，从图2可以看出，在培养基中添加不同比例的豆粕粉，对酶活的产生都有促进作用，随着豆粕粉含量的增加，产品的酶活力有上升的趋势，在质量分数的9%时酶活力达到最高.6）不同浓度铵盐铵盐作为重要的无机氮源对酸性蛋白酶菌株产酶的生产有很重要的作用，生产中常常加入一些铵盐来促进黑曲霉菌的产酶，本研究分别加入不同浓度的氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵进行发酵试验，由图6可以看出少量的硫酸铵对产酶有促进作用，但随着浓度的增加产酶量有下降的趋势，另外，氯化铵的浓度对产酶基本没影响，碳酸氢铵随着浓度的增加对产酶有很大的阻遏作用.7）不同磷酸盐磷酸盐在酸性蛋白酶的生产很重要，在使用麸皮，米糠等有机磷含量丰富的原料时，添加一定的磷酸盐时会出现明显的促进效果.本研究对磷酸氢二铵、磷酸氢二钾进行实验.通过改变无机磷的种类和含量，在33℃、初始pH值为6.5和含水量为68%条件下发酵，研究不同浓度磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，结果见图7.添加磷酸盐有利于促进酸性蛋白酶菌株的产酶，且添加质量分数的0.2%的磷酸氢二钾对酸性蛋白酶菌株的产酶促进最大.3.2.2 酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线固体发酵采用基础培养基、含水量68%、初始pH值为6.5、添加质量分数的0.2%的磷酸氢二钾和硫酸铵在33℃进行发酵培养，研究发酵进程曲线，结果如图8所示.由酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线可以看出，0～24 h发酵产酶速度较缓；24～60 h酸性蛋白酶产酶迅速增加，发酵时间达到72 h后，进程曲线趋于平缓，84 h酶活力最高，其酸性蛋白酶活力（干基）达到36 500 U/g，为了缩短发酵周期，发酵最适时间为72 h.3.3 酸性蛋白酶酶活力稳定性研究黑曲霉产的酸性蛋白酶因其最佳反应pH较低，与畜禽体内消化系统基本一致，用于饲料添加剂中，可以有效的弥补畜禽肠道内源蛋白酶分泌不足，提高蛋白质消化率，降低畜禽代谢性腹泻的发生.酸性蛋白酶作为饲料添加剂，它不仅要经受饲料加工过程中的高温处理、动物胃肠道胃酸的影响，而且还受饲料中部分金属离子的影响，而这些过程中酶活极易受损，从而影响其作为饲料添加剂的效果.本项研究对黑曲霉菌株所产酸性蛋白酶在不同条件下的稳定性进行了研究.3.3.1 pH值对酸性蛋白酶稳定性的影响酸性蛋白酶在一定pH范围内酶活力比较稳定（如图9）.当反应环境pH为3.5，酸性蛋白酶相对酶活力可以达到85%，在pH为4.0时，相对酶活力最高达90%，可以确定酸性蛋白酶最适反应pH值为4.0.pH值过高或过低明显影响酶活力，在pH为5.0时，相对酶活力只有65%，在pH为2.5时，相对酶活力也只有70%.3.3.2 温度对酸性蛋白酶酶活力和稳定性的影响酸性蛋白酶在不同反应温度下酶活力有很大差异（如图10）.一方面是当温度升高时，酸性蛋白酶反应速率加快，另一方面由于随着温度的升高使酸性蛋白酶逐渐变性而失去活性，引起酶反应速率下降.酸性蛋白酶适宜的反应温度为35～40℃，在40℃相对酶活力表现出最高，在低于30℃或者高于45℃时，相对酶活力明显下降.因此认为40℃是酸性蛋白酶最适宜的温度.酶本身就是一种具有生物活性的蛋白质，一定温度必然引起蛋白质的变性从而使酶失活，随着温度的升高变性的时间越快，酶失活也就越迅速.如图11所示，酸性蛋白酶在70℃时，随着时间的延长酶活力开始下降.固体酶在烘箱中70℃保温至5 min保留有90%的相对酶活力，当时间延长至10 min时，剩余酶活有80%，30 min时，剩余酶活仍有19.8%.3.3.3 不同金属离子对酸性蛋白酶稳定性的影响金属离子对酸性蛋白酶活力影响较大，金属离子对酸性蛋白酶的调节作用是相对的，一种金属离子对其具有激活作用，而另一种则可能呈现抑制作用.离子浓度对酶活性也有着不同的影响，往往是低浓度起激活作用，而高浓度起抑制作用.图12表明，在5.0 mmol/L的浓度下，Mn2+和Cu2+对黑曲霉所产酸性蛋白酶有强烈的激活作用，分别达到对照酶活力的150%和120%，Fe3+对该酶表现出明显的抑制作用，处理后的酶活力为对照的58%，而Fe2+、Ag+、Zn2+、Ca2+、K+和Mg2+对酸性蛋白酶有一定的抑制作用.采用紫外线和亚硝基胍联合诱变筛选得到一株稳定、高产酸性蛋白酶的变异菌株Y06，结果表明，诱变后菌株的酶活由768 U/g提高到了36 134 U/g，相对于出发菌株提高了46倍.在研究酶的粗酶酶学性质中发现，该酸性蛋白酶的最适作用pH值为6.5，最适作用温度为33℃，最适含水量为68%，玉米粉最适添加量为2%，豆粕粉最适添加量在9%，发酵最适时间为72 h.菌株产酶稳定性试验结果表明该菌株产酶能力较稳定.【相关文献】［1］刘鑫，李佳，刘克武，等.黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应［J］.化学研究与应用，2004，16（4）：482－484.［2］张学峰，刘达玉，夏兵兵，等.酒用酸性蛋白酶在甜酒酿生产中的应用［J］.中国酿造，2009（3）：122－124.［3］俞从正，董新宽，王全杰，等.酸性蛋白酶537处理绵羊蓝湿革对皮革延伸性能影响的研究［J］.中国皮革，2006，35（9）：16－20.［4］王祥观，张爱琴，于丽萍，等.酸性蛋白酶在酱油酿造中的应用研究［J］.生物技术，1993，3（4）：26－29.［5］卢燕云，林建国，李明，等.复合诱变选育酸性蛋白酶高产菌株［J］.中国酿造，2009（1）：49－51.［6］罗跃中，李忠英，温拥军.黑曲霉固体发酵产酸性蛋白酶条件优化［J］.湖北农业科学，2010，49（1）：59－62.［7］沈玉洁，张明春，向苇，等.高产酸性蛋白酶菌株的筛选及发酵条件研究［J］.食品与发酵科技，2010，46（6）：32－35.［8］唐宝英，曹建民.酸性蛋白酶高产菌株的选育［J］.食品与发酵工业，1998，24（3）：16-19.［9］刘然，张淑芬.动物蛋白酶化技术［J］.饲料研究，1991（6）：7-9.［10］周德庆.微生物学教程［M］.北京：高等教育出版社，2002：212－217.。

一株新型产淀粉酶中度嗜热菌的分离鉴定及酶学性质研究王治宾;薛蓓;杜丽琴;庞宗文;黄日波;韦宇拓【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2011(41)5【摘要】用稀释分离法从广西象州温泉筛选分离到一株可水解淀粉的中度嗜热细菌GXS1,该茵株革兰氏染色为阳性,端生芽孢,细胞呈杆状,最适生长温度为60℃～65℃,最适生长pH为6.0～7.0.结合生理生化特征和16S rDNA序列分析,初步鉴定该茵株为Geobacillus sp.GXS1.对该茵所产高温淀粉酶的性质研究表明:酶的最适反应温度为80℃,在40℃～60℃范围内稳定,70℃保温30 min仍保留77%残余酶活,最适pH为7.0,稳定pH范围为4.0～10.0.产物经HPLC分析证明,该酶能水解淀粉产生麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物,对α-环糊精、β-环糊精不起作用.%Using dilution method, a moderately thermophilic amylase-generated bacterium GXS1 was isolated from the Xiangzhou hot spring of Guangxi in China. The cells of the strain GXS1 were gram-positive, sporulation and rod-shaped. Its optimum temperature for growth was between 60℃ and 65℃ , and its optimum pH for growth was between 6.0 and 7.0. The morphological, physiological characterization and 16S rDNA sequences analysis indicated that the strain GXS1 was relatively close to Geobacillus. Thus the strain GXS1 was preliminarily indentified as Geobacillus sp. GXS1. The characteristics of the thermostable amylase were also discussed. The optimum temperature and pH for the enzyme were determined at 80 t and7. 0 respectively. The stable temperature and pH range were 40 ℃ ～60℃ and 4. 0 ~ 10.0 respectively. The amylase exhibited well thermal-stability, retaining 77% activities after 30 min at 70 ℃. The results of HPLC of products from starch by the amylase demonstrated that the enzyme could be used to produce maltotriose, maltose and glucose from starch, but it could not catalyze a-cyclodextrin and β-cyclodextrin.【总页数】5页(P17-21)【作者】王治宾;薛蓓;杜丽琴;庞宗文;黄日波;韦宇拓【作者单位】广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西,南宁,530005;广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西,南宁,530005;广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西,南宁,530005;广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西,南宁,530005;广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西,南宁,530005;广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西,南宁,530005【正文语种】中文【相关文献】1.一株产纤维素酶放线菌的分离鉴定及酶学性质研究 [J], 任大明;赵钰;白炜琪;陈红漫;阚国仕;佡思涵;张聪2.一株嗜盐淀粉酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质研究 [J], 栗敏;刘洋;郭泽经;何艳;冯治翔;田永强3.一株产α-淀粉酶嗜热菌的分离鉴定及其产酶条件的优化 [J], 吕美云;刘紫英;耿丽媛4.一株嗜热嗜酸纤维素酶高产霉菌分离鉴定及其酶学性质研究 [J], 高建民;翁海波;席宇;袁明雪;韩绍印5.一株生淀粉酶产生菌的分离鉴定及酶学性质研究 [J], 李彧娜;石贵阳;王武;王正祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。