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重组腺病毒载体负载树突状细胞诱导乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞

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中华细胞与干细胞杂志(电子版) 2012年11月第2卷第4期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Nov 2012,Vol.2, No.4261重组腺病毒载体负载树突状细胞诱导乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞

陶然 李进 张克 马世武 姜维 李溢柔 周向军

•实验研究•

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2012.04.006作者单位：518057 深圳市源兴生物医药科技有限公司（陶然、李进、姜维、李溢柔、周向军）；广东省南方医科大学附属南方医院感染内科（张克、马世武）通讯作者：周向军，Email:joe@beike.cc

【摘要】　目的 本研究利用重组腺病毒载体将乙肝病毒基因导入树突状细胞（DC）内表达成内源性蛋白，探索DC体外抗原负载并诱导乙肝病毒（HBV）特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的有效方法。方法 分离外周血单个核细胞（PBMC）并诱导成DC。用HFP3肽辅助腺病毒载体进行抗原负载，检测DC细胞内乙肝核心抗原基因的表达，比较

成熟前后DC的表面分子，研究DC诱导的乙肝病毒核心抗原（HBcAg）特异性CTL的增殖。应用统计软件SPSS17.0进行统计分析，以P <0.05为差异有统计学意义。结果 重组腺病毒CHB3感染的DC能有效表达HBcAg蛋白。HFP3辅助感染能显著提高感染效率达3 ~ 10倍。腺病毒载体负载的DC表面CD80、CD86、CCR7的表达有所上调，但差异无统计学意义（平均荧光强度CHB3/iDC：CD80，46.2 ± 14.6 / 29.9 ± 7.9，P = 0.209；CD86，142.0 ± 12.9 / 113.3 ± 6.5，P = 0.430；CCR7，49.3 ± 3.0 / 36.4 ± 4.6，P = 0.054）。Cocktail促成熟

后，CD80、CD83、CD86、CCR7显著上调（平均荧光强度Cocktail-CHB3/iDC：CD80，97.1 ± 8.1 / 29.9 ± 7.9，P = 0.0019；CD83，75.4 ± 8.4 / 26.8 ± 1.5，P = 0.017；CD86，176.2 ± 14.8 / 

113.3 ± 6.5,P = 0.021；CCR7，75.3 ± 3.4 / 36.4 ± 4.6，P = 0.0016），HLA-DR分子维持高表达。

CHB3负载的DC与自体T细胞共培养，可检测到HBcAg特异性CTL比例明显增高（1例

由0.25﹪增至1.98﹪，另1例由0.19﹪增至1.37﹪）。结论 在优化的条件下，重组腺病毒载体CHB3能够有效地介导抗原蛋白HBcAg在DC内高水平表达，加入HFP3辅助感染能在较低的感染剂量下获得较高的感染效率，有利于维持DC的活性。重组腺病毒载体CHB3结合HFP3的抗原负载方案能有效地诱导HBcAg特异性CTL。

【关键词】　树突细胞； 腺病毒； 肝炎核心抗原,乙型； T淋巴细胞,细胞毒性  

Efficient induction of hepatitis B virus specific CTL through adenovirus infected human dendritic cells TAO Ran*, LI Jin, ZHANG Ke, MA Shi-wu, JIANG Wei, LI Yi-rou, ZHOU Xiang-

jun. *Tsinghua Yuanxing Bio-Pharm Science & Technology Co. Ltd, Shenzhen 518057, China

Corresponding author:ZHOU Xiang-jun, Email:joe@beike.cc【Abstract】 Objective This study investigated transduction and expression of HBV gene in dendritic cells by recombinant adenovirus vectors to establish a reliable methodology for the DC-antigen load in vitro and induction of HBV-specific CTL. Methods To address this issue, we optimized conditions for adenovirus infection using recombinant adenoviral vector rAd-GFP or CHB3 (rAd expressed HBcAg) and a small peptide (HFP3). We also assessed the efficiency of infection of DCs as well as the effect on cell surface marker expression and DC functions. The data in the study was analysed by statistical software SPSS17.0. The statistical significance was determined by Student’s t-test;P < 0.05 was considered statistically significant. Results Our results demonstrated that HFP3 significantly enhanced in vitro transduction of rAds into 中华细胞与干细胞杂志(电子版) 2012年11月第2卷第4期 Chin J Cell Stem Cell (Electronic Edition), Nov 2012,Vol.2, No.4262DCs. Enhancement of rAds infection efficiency by HFP3 is 3-10 times higher than the no-HFP3 control group. The up-regulation of CD80, CD86, CCR7 on the surface of CHB3/HFP3-loaded DCs was not significantly different (P = 0.209, P = 0.430, P = 0.054). But after these DCs were stimulated by a cocktail of cytokines, the expression of CD80, CD83, CD86, and CCR7 were significant increased (P < 0.05) and the expression of HLA-DR maintained at high level. More importantly, the percentage of HBcAg-specific CTL was obviously up-regulated after T cells were cocultured with CHB3/HFP3-loaded DCs. Conclusions Therefore, our study provides evidence that HFP3 might serve as promising strategy for rAd-mediated antigen loading of DCs. DCs transferred by the CHB3 and HFP3 could efficiently activate HBcAg-specific cytotoxic T cells.【Key words】 Dendritic cell； Adenovirus； Hepatitis B core antige； T 

lymphocyte, Cytotoxic

特异性细胞免疫反应是机体清除感染病毒和变异细胞的主要机制，体内特异性细胞免疫反应的启动需要抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APC），主要包括树突状细胞（dendritic cells，DC）对抗原的递呈[1-2]。慢性乙肝患者体内针对乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）的特异性免疫应答低下，DC功能障碍（如捕获抗原能力下降或成熟受阻等）被认为是主要原因之一[3-5]。本研究探索了用携带有HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）基因的重组腺病毒CHB3体外感染DC进行抗原负载的方法和效果，为慢性乙肝患者体内免疫反应低下提供解决方案。材料和方法一、实验材料1.研究标本：健康志愿者，知情告知并签署知情同意书，肝素钠抗凝管抽取外周静脉血50 ml。2.主要试剂：淋巴细胞分离液（美国Hyclone公司）；GM-CSF、IL-4、Cocktail、IL-2(美国PeproTech公司)；1640培养液，AIM-V培养液（美国Invitrogen公司）；PAA淋巴细胞培养液（德国PAA公司）；CD86- FITC、CD83- PE、CD80- PEcy5、HLA-DR-FITC、CD14-APC、CCR7-PE、FITC羊抗鼠荧光二抗（美国BD公司）；HBcAg-pentamer-PE检测试剂（美国Proimmune公司）。二、实验方法1.外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的分离及DC的体外培养：700 × g离心20 min分离血浆，剩余血应用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）1:3稀释后，淋巴细胞分离液分离PBMC，细胞

计数，用RPMI1640基培重悬细胞，调整细胞密度为5 × 106个/ml，接种于24孔板中，每孔接种1 ml，然后置于37℃、5﹪CO2培养箱内静置培

养，1.5 h后，在超净工作台内，吸除未贴壁细胞，并应用无菌杜氏磷酸缓冲液（dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS）液洗涤细胞3次，最后加

入rhGM-CSF( 800 U/ml）、rhIL-4( 400 U/ml）、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml，并分别用2﹪自体血浆（autologous plasma，AP）的RPMI1640完全培养基（或AIM-V）0.5 ml，37℃、5﹪CO2培养箱内培养。10 h后，吸除上清，并用RPMI1640基培洗涤细胞3次，最后应用上述加入细胞因子、抗生素和含有 2﹪AP的RPMI1640完全培养基（或AIM-V）1 ml，37℃、5﹪CO2培养箱内培养。体

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推荐指数 8 4 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
科研热词 推荐指数 nk细胞 3 肿瘤 2 细胞毒活性 2 生物学行为 2 增殖 2 减毒沙门菌 2 凋亡 2 pires2-egfp-4-1bbl质粒 2 骨髓t淋巴细胞 1 预测 1 足细胞 1 超抗原 1 表面抗原 1 表面增强拉曼光谱; 标记免疫检测; 1 多组分 血复生浸膏 1 肾小球疾病 1 细胞毒t细胞相关抗原4 1 生物信息学 1 放疗 1 抗原 1 分化决定簇28 1 再生障碍性贫血 1 二级结构 1 p1 1 mica 1 mhcⅰ类相关蛋白a 1 mhci数 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2013年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
免疫系统疾病及其药物治疗

免疫系统疾病及其药物治疗


TD抗原 + 辅佐细胞 T1抗原
初始Th细胞 提呈
活化Th细胞 辅 助
初始B细胞
效应 辅助
CTL Th1
靶细胞 细 胞 免
淋巴因子 疫
前体Th1、CTL
浆细胞
免疫球 蛋白
体液免疫
感应阶段
增殖分化阶段 效应阶段
1
先天性和适应性免疫
先天性免疫及天然免疫
初级的、不需要接触抗原 作用广泛，特异性差 效应器：补体、粒细胞、单核/巨噬细胞、自然杀伤细
多为小分子物质，单独作用时无免疫原性，但与蛋白质载体结合后可具有 免疫 原性，如大多数多糖、类脂、某些药物等
➢ 免疫耐受(immune tolerance)，耐受原(tolerogen) 抗原可诱导相应淋巴细胞克隆对该抗原表现为特异性无免疫 应答状态
➢ 超敏反应(hypersentivity)，变应原(allergen) 抗原引起机体发生病理性免疫应答
环孢素 (cyclosporine, CsA)
H3C
H
C
C
H3C
CH3
H CH 2
CH CH 2
H3C C H3 CH
C H3 HO HC C H3 CH
C
H H3
3C
CH
CH3
CH3
H3C N HC
H3C
CO
CO N
CH C N O
CH CO N H
CH C O
N CH 2 CO
CH CH 2 CH H3C H3C N
1
环孢素C2治疗窗浓度
C2: 1200 1400 ng/mL C2: 1000 1200 ng/mL C2: 800 1000 ng/mL
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53 54 55 56 57 58 59
ta-gvhd nk细胞 myd88 jagged1 foxp3 ctla4ig cd8+cd28-调节性t细胞
1 1 1 1 1 1 1
53 54 55 56
pd-l1 pd-1 foxp3 cd4+cd25+t细胞
推荐指数 3 3 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
科研热词 推荐指数 造血干细胞移植 5 移植物抗宿主病 5 骨髓移植 4 t淋巴细胞,调节性 3 转基因 2 皮肤移植 2 淋巴细胞输注 2 小鼠 2 高强度聚焦超声消融 1 髓母细胞瘤 1 预处理 1 预后 1 过继免疫治疗 1 过继 1 转化生长因子-β 1 1 调节性t细胞 1 荧光流式技术 1 肿瘤 1 移植物抗白血病效应 1 移植物抗白血病 1 移植 1 真核表达质粒 1 白血病 1 疗效 1 生存期 1 淋巴细胞计数 1 淋巴细胞 1 淋巴瘤,非霍奇金 1 氟达拉滨 1 树突状细胞 1 慢病毒 1 异种异体角膜移植 1 异基因造血干细胞移植 1 干细胞移植 1 巨细胞病毒 1 嵌合体 1 定量免疫检测 1 复发 1 嗜血细胞综合征 1 受体,肿瘤坏死因子,成员14 1 叉头转录因子类 1 单倍体造血干细胞 1 免疫耐受 1 免疫状态 1 免疫治疗 1 供者 1 体内诱导 1 flt3-l 1 cm-csf 1
慢病毒载体构建和包装操作手册

慢病毒载体构建和包装操作手册

慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3)操作病毒时特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。

4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

6)实验完毕用香皂清洗双手。

➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。

2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。

一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。

该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。