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腺病毒载体操作手册中文版解析腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein V ector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
pAAV-‐hSyn-‐RFP编号 载体名称 北京华越洋VECT10040 pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐hSyn-‐RFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hSyn-‐RFP质粒类型: 腺病毒载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: human S ynapsin 1载体大小: 5909 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: SP6 5'ATTTAGGTGACACTATAG 3'载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 红色荧光蛋白DsRedExpress克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble宿主细胞（系）: 神经细胞备注: pAAV-‐hSyn-‐RFP载体含有human s ynapsin 1 启动子，适合在神经细胞中表达。
稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hSyn-‐RFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hSyn-‐RFP载体序列：ORIGIN1 G TGGATAACC G TATTACCGC C TTTGAGTGA G CTGATACCG C TCGCCGCAG C CGAACGACC61 G AGCGCAGCG A GTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT T GTAGTTAAT G ATTAACCCG C CATGCTACT T ATCTACGTA G CCATGCTCT181 A GAGGATCCT T CGAAAAGCT T CTGCAGAGG G CCCTGCGTA T GAGTGCAAG T GGGTTTTAG 241 G ACCAGGATG A GGCGGGGTG G GGGTGCCTA C CTGACGACC G ACCCCGACC C ACTGGACAA 301 G CACCCAACC C CCATTCCCC A AATTGCGCA T CCCCTATCA G AGAGGGGGA G GGGAAACAG 361 G ATGCGGCGA G GCGCGTGCG C ACTGCCAGC T TCAGCACCG C GGACAGTGC C TTCGCCCCC 421 G CCTGGCGGC G CGCGCCACC G CCGCCTCAG C ACTGAAGGC G CGCTGACGT C ACTCGCCGG 481 T CCCCCGCAA A CTCCCCTTC C CGGCCACCT T GGTCGCGTC C GCGCCGCCG C CGGCCCAGC541 C GGACCGCAC C ACGCGAGGC G CGAGATAGG G GGGCACGGG C GCGACCATC T GCGCTGCGG 601 C GCCGGCGAC T CAGCGCTGC C TCAGTCTGC G GTGGGCAGC G GAGGAGTCG T GTCGTGCCT 661 G AGAGCGCAG T CGAGGCGCG C CGAGCTCGG A TCCTGAGAA C TTCAGGGTG A GTCTATGGG 721 A CCCTTGATG T TTTCTTTCC C CTTCTTTTC T ATGGTTAAG T TCATGTCAT A GGAAGGGGA781 G AAGTAACAG G GTACACATA T TGACCAAAT C AGGGTAATT T TGCATTTGT A ATTTTAAAA841 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC901 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA961 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC1021 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA1081 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC1141 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT1201 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GCACGTGAA T TCGAAGATC T GGCCGCCTC1261 G GCCTCTAGA A CTAGTGGAT C CCCCGGGCT G CAGGAATTC G ATGCTACCG G TCGCCACCA1321 T GGCCTCCTC C GAGGACGTC A TCAAGGAGT T CATGCGCTT C AAGGTGCGC A TGGAGGGCT 1381 C CGTGAACGG C CACGAGTTC G AGATCGAGG G CGAGGGCGA G GGCCGCCCC T ACGAGGGCA 1441 C CCAGACCGC C AAGCTGAAG G TGACCAAGG G CGGCCCCCT G CCCTTCGCC T GGGACATCC 1501 T GTCCCCCCA G 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CCGCTTTTT T GCACAACAT G GGGGATCAT G TAACTCGCC 4681 T TGATCGTTG G GAACCGGAG C TGAATGAAG C CATACCAAA C GACGAGCGT G ACACCACGA 4741 T GCCTGTAGC A ATGGCAACA A CGTTGCGCA A ACTATTAAC T GGCGAACTA C TTACTCTAG 4801 C TTCCCGGCA A CAATTAATA G ACTGGATGG A GGCGGATAA A GTTGCAGGA C CACTTCTGC 4861 G CTCGGCCCT T CCGGCTGGC T GGTTTATTG C TGATAAATC T GGAGCCGGT G AGCGTGGGT 4921 C TCGCGGTAT C ATTGCAGCA C TGGGGCCAG A TGGTAAGCC C TCCCGTATC G TAGTTATCT 4981 A CACGACGGG G AGTCAGGCA A CTATGGATG A ACGAAATAG A CAGATCGCT G AGATAGGTG 5041 C CTCACTGAT T AAGCATTGG T AACTGTCAG A CCAAGTTTA C TCATATATA C TTTAGATTG5101 A TTTAAAACT T CATTTTTAA T TTAAAAGGA T CTAGGTGAA G ATCCTTTTT G ATAATCTCA5161 T GACCAAAAT C CCTTAACGT G AGTTTTCGT T CCACTGAGC G TCAGACCCC G TAGAAAAGA 5221 T CAAAGGATC T TCTTGAGAT C CTTTTTTTC T GCGCGTAAT C TGCTGCTTG C AAACAAAAA5281 A ACCACCGCT A CCAGCGGTG G TTTGTTTGC C GGATCAAGA G CTACCAACT C TTTTTCCGA5341 A GGTAACTGG C TTCAGCAGA G CGCAGATAC C AAATACTGT T CTTCTAGTG T AGCCGTAGT 5401 T AGGCCACCA C TTCAAGAAC T CTGTAGCAC C GCCTACATA C CTCGCTCTG C TAATCCTGT5461 T ACCAGTGGC T GCTGCCAGT G GCGATAAGT C GTGTCTTAC C GGGTTGGAC T CAAGACGAT 5521 A GTTACCGGA T AAGGCGCAG C GGTCGGGCT G AACGGGGGG T TCGTGCACA C AGCCCAGCT 5581 T GGAGCGAAC G ACCTACACC G AACTGAGAT A CCTACAGCG T GAGCTATGA G AAAGCGCCA 5641 C GCTTCCCGA A GGGAGAAAG G CGGACAGGT A TCCGGTAAG C GGCAGGGTC G GAACAGGAG 5701 A GCGCACGAG G GAGCTTCCA G GGGGAAACG C CTGGTATCT T TATAGTCCT G TCGGGTTTC 5761 G CCACCTCTG A CTTGAGCGT C GATTTTTGT G ATGCTCGTC A GGGGGGCGG A GCCTATGGA 5821 A AAACGCCAG C AACGCGGCC T TTTTACGGT T CCTGGCCTT T TGCTGGCCT T TTGCTCACA5881 T GTTCTTTCC T GCGTTATCC C CTGATTCT//pAAV-‐hSyn-‐RFP其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFPpAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFPpAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCSpShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMVpAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐FlucpAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐BpDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RCpAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐PurpAAV-‐minCMV-‐mCherry。
腺病毒载体AVV的作用
典型的腺病毒载体系统如：穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。
pCA13/的HCMV IE啟动子－多克隆位点－SV40 AN（poly A）构成外源基因的表达盒，该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失，但是保留其两端侧翼序列（左侧的1~3bp的ITR，右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力的蛋白IX的基因），也保留了腺病毒的包装信号φ（194~358bp）；pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分，但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距（mu）部分的E1区、77.5～86.2mu的E3区，293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚肾细胞系。
pBHG11因為缺失包装信号及E1区而不能复制，pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列，但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组，同样不能复制。
外源目的基因插入pCA13后，与pBHG11共转染，进入293细胞。
pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组，同时，293细胞提供E1蛋白，从而包装產生腺病毒颗粒。
该病毒的蛋白质外壳同野生型腺病毒相似，具有同样的感染力进入靶细胞的能力，但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代，即进入靶细胞后病毒不能复制，但可以表达目的蛋白。
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。
AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。
rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
腺病毒载体的分类及包装方法1.腺病毒载体分类第一代腺病毒载体：指E1或E3基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量为6.5-8Kb；(2)适用于大多数基因治疗，且容易获得高滴度的病毒；(3)可用于表达重组蛋白质或将外源基因导入对其他转染方法不敏感的细胞株中；(4)若未经纯化使用，容易引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用。
第二代腺病毒载体：指E2A或E4基因缺失的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量增加，可达14Kb；(2)病毒蛋白表达降低，引发机体的免疫反应比第一代弱；(3)外源基因表达时间较长；(4)病毒产量较低，且滴度降低。
第三代腺病毒载体：也称为空壳载体或辅助病毒载体，指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅可保留ITR和包装信号序列的腺病毒载体。
特点：(1)外源基因容量大幅度提高，可达37Kb；(2)无病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应，提高了安全性；(3)外源基因可长期稳定表达；(4)需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒；(5)可反复应用，无需考虑机体的抗腺病毒中和抗体的影响。
2.腺病毒载体包装方法传统的双质粒共转染法将插入了外源基因的穿梭载体质粒与携带腺病毒基因组的质粒共转染293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组（同源序列的DNA分子之间或者分子之内的重新组合），形成重组腺病毒载体基因组，并包装成病毒颗粒。
局限性：(1) 操作较复杂，因其易被亲代病毒污染，需经过多次纯化和鉴定；(2) 重组效率低，耗费时间较长。
注：此方法适用于临床。
(1)Ad-Easy法将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染RecA+细菌，在细菌RecA 重组酶的作用下，经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其酶切纯化后转染293细胞，包装成重组病毒颗粒。
特点：(1) 酶切和连接步骤少，操作简便；(2) 可选择的穿梭载体多；(3) 同源重组率达60%以上，效率相对较高；局限性：(1) 某些腺病毒基因容易发生突变；(2) 设备和技术要求较高。
腺相关病毒载体腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AA V)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。
其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。
AA V 不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。
腺相关病毒载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。
腺相关病毒（adeno-associated virus，AA V）是简单的非致病性单链DNA病毒，需要辅助病毒参与生活周期，辅助病毒通常为腺病毒（Ad）或者单纯疱疹病毒（HSV）。
基因组两端为末端反向重复序列（ITR），中间基因组编码两个蛋白：Cap和Rep。
ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。
Cap蛋白为病毒衣壳蛋白，Rep蛋白参与病毒的复制和整合。
AA V 能感染多种细胞。
Rep蛋白存在时，病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点：AA VS1位点。
这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒。
重组腺相关病毒载体（rAA V）源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
优点：以潜伏感染为主；AA V可以高效定点整合至人染色体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。
缺点：AA V载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；感染效率比逆转录病毒载体低。
在40%-80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。
AA V选择的条件1. 治疗基因的长度不能过大。
AA V的总容量4.7kb，还要包括AA V自身的ITR，启动区和RNA加尾信号；2. 基因需要持续表达，蛋白可以是分泌型，也可以是非分泌型；3. 长期表达目的基因，没毒副作用；4. 不需要目的基因立刻表达；5. 不需要基因高水平表达；6. AA V载体对靶细胞具有较高的转导效率。
pAAV-‐hrGFP编号 载体名称 北京华越洋VECT10048 pAAV-‐hrGFPpAAV-‐hrGFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hrGFP， pAAV h rGFP, p AAVhrGFP质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV载体大小: 5.3 k b3‘ 端测序引物: Beta-‐globin-‐F：ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC 5‘ 端测序引物: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hrGFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hrGFP其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFP pAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
产品——腺病毒产品（Adv）腺病毒载体质粒携带报告基因的腺病毒载体（Ad5、Ad5F35）携带治疗基因的腺病毒AdMax腺病毒载体包装系统腺病毒相关检测试剂腺病毒载体质粒在AdMax TM腺病毒载体包装系统中，Kit D为广大科研学者常选用的试剂盒之一。
为了方便研究者使用，本公司可单独提供该试剂盒中的pDC315、pDC316、pDC311、pDC312腺病毒载体质粒。
pDC315和pDC316的区别在于多克隆位点的差异，pDC311和pDC312与前两者的区别是无CMV和poly A，方便插入完整表达盒。
客户可根据质粒构建需要任意选择。
pDC315和pDC316载体质粒除了可以作为腺病毒包装的穿梭质粒外，还可以作为真核表达质粒。
pDC316-EGFP-U6 是siRNA通用腺病毒载体质粒。
它是以pDC316 质粒为骨架改造的，启动子是人U6 启动子，同时表达EGFP，便于示踪和估计转导效率。
请点击下面链接：>>> 腺病毒载体穿梭质粒pDC315（AdMax Kit D）说明书[pdf]>>> 腺病毒载体穿梭质粒pDC316（AdMax Kit D）说明书[pdf]>>> 腺病毒载体穿梭质粒pDC311（AdMax Kit D）说明书[pdf]>>> 腺病毒载体穿梭质粒pDC312（AdMax Kit D）说明书[pdf]>>> 腺病毒载体siRNA穿梭质粒pDC316-EGFP-U6说明书[pdf]目录号产品名称Promoter Poly A 浓度规格价格Ad0001 pDC316-EGFP-U6 hU6 --- 1ug/ul 10ul 4000.00PD-01-25 pDC311 无无1ug/ul 10ul 3000.00PD-01-26 pDC312 无无1ug/ul 10ul 3000.00PD-01-27 pDC315 mCMV SV40 1ug/ul 10ul 3000.00PD-01-28 pDC316 mCMV SV40 1ug/ul 10ul 3000.00携带报告基因的腺病毒载体（Ad5、Ad5F35）公司提供3种报告基因（EGFP，lacZ，Luc）和2种血清型（Ad5, Ad5F35)的腺病毒载体产品。
word腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原如此 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原如此5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1QBI-293A细胞的初始培养 8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 10 5.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最优重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern 杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA plementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication petent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的开展日趋复杂，一些治疗药物〔生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物〕和诊断性蛋白〔单克隆抗体〕的设计、开展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
pAAV-‐MCS编号 载体名称北京华越洋VECT10024 pAAV-‐MCSpAAV-‐MCS载体基本信息：载体名称: pAAVMCS， pAAV-‐MCS, p AAV M CS质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4650 b p5' 测序引物及序列: CMV-‐F: 5'-‐CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-‐3'3' 测序引物及序列: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐MCS载体质粒图谱和多克隆位点信息pAAV-‐MCS载体序列:ORIGIN1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCAAAG C CCGGGCGTC 61 G GGCGACCTT T GGTCGCCCG G CCTCAGTGA G CGAGCGAGC G CGCAGAGAG G GAGTGGCCA 121 A CTCCATCAC T AGGGGTTCC T GCGGCCGCA C GCGTGGAGC T AGTTATTAA T AGTAATCAA 181 T TACGGGGTC A TTAGTTCAT A GCCCATATA T GGAGTTCCG C GTTACATAA C TTACGGTAA 241 A TGGCCCGCC T GGCTGACCG C CCAACGACC C CCGCCCATT G ACGTCAATA A TGACGTATG 301 T TCCCATAGT A ACGTCAATA G GGACTTTCC A TTGACGTCA A TGGGTGGAG T ATTTACGGT 361 A AACTGCCCA C TTGGCAGTA C ATCAAGTGT A TCATATGCC A AGTACGCCC C CTATTGACG 421 T CAATGACGG T AAATGGCCC G CCTGGCATT A TGCCCAGTA C ATGACCTTA T GGGACTTTC 481 C TACTTGGCA G TACATCTAC G TATTAGTCA T CGCTATTAC C ATGGTGATG C GGTTTTGGC 541 A GTACATCAA T GGGCGTGGA T AGCGGTTTG A CTCACGGGG A TTTCCAAGT C TCCACCCCA 601 T TGACGTCAA T GGGAGTTTG T TTTGCACCA A AATCAACGG G ACTTTCCAA A ATGTCGTAA 661 C AACTCCGCC C CATTGACGC A AATGGGCGG T AGGCGTGTA C GGTGGGAGG T CTATATAAG 721 C AGAGCTCGT T TAGTGAACC G TCAGATCGC C TGGAGACGC C ATCCACGCT G TTTTGACCT 781 C CATAGAAGA C ACCGGGACC G ATCCAGCCT C CGCGGATTC G AATCCCGGC C GGGAACGGT 841 G CATTGGAAC G CGGATTCCC C GTGCCAAGA G TGACGTAAG T ACCGCCTAT A GAGTCTATA 901 G GCCCACAAA A AATGCTTTC T TCTTTTAAT A TACTTTTTT G TTTATCTTA T TTCTAATAC961 T TTCCCTAAT C TCTTTCTTT C AGGGCAATA A TGATACAAT G TATCATGCC T CTTTGCACC1021 A TTCTAAAGA A TAACAGTGA T AATTTCTGG G TTAAGGCAA T AGCAATATT T CTGCATATA 1081 A ATATTTCTG C ATATAAATT G TAACTGATG T AAGAGGTTT C ATATTGCTA A TAGCAGCTA 1141 C AATCCAGCT A CCATTCTGC T TTTATTTTA T GGTTGGGAT A AGGCTGGAT T ATTCTGAGT1201 C CAAGCTAGG C CCTTTTGCT A ATCATGTTC A TACCTCTTA T CTTCCTCCC A CAGCTCCTG1261 G GCAACGTGC T GGTCTGTGT G CTGGCCCAT C ACTTTGGCA A AGAATTGGG A TTCGAACAT 1321 C GATTGAATT C CCCGGGGAT C CTCTAGAGT C GACCTGCAG A AGCTTGCCT C GAGCAGCGC 1381 T GCTCGAGAG A TCTACGGGT G GCATCCCTG T GACCCCTCC C CAGTGCCTC T CCTGGCCCT 1441 G GAAGTTGCC A CTCCAGTGC C CACCAGCCT T GTCCTAATA A AATTAAGTT G CATCATTTT1501 G TCTGACTAG G TGTCCTTCT A TAATATTAT G GGGTGGAGG G GGGTGGTAT G GAGCAAGGG 1561 G CAAGTTGGG A AGACAACCT G TAGGGCCTG C GGGGTCTAT T GGGAACCAA G CTGGAGTGC 1621 A GTGGCACAA T CTTGGCTCA C TGCAATCTC C GCCTCCTGG G TTCAAGCGA T TCTCCTGCC1681 T CAGCCTCCC G AGTTGTTGG G ATTCCAGGC A TGCATGACC A GGCTCAGCT A ATTTTTGTT 1741 T TTTTGGTAG A GACGGGGTT T CACCATATT G GCCAGGCTG G TCTCCAACT C CTAATCTCA1801 G GTGATCTAC C CACCTTGGC C TCCCAAATT G CTGGGATTA C AGGCGTGAA C CACTGCTCC 1861 C TTCCCTGTC C TTCTGATTT T GTAGGTAAC C ACGTGCGGA C CGAGCGGCC G CAGGAACCC 1921 C TAGTGATGG A GTTGGCCAC T CCCTCTCTG C GCGCTCGCT C GCTCACTGA G GCCGGGCGA 1981 C CAAAGGTCG C CCGACGCCC G GGCTTTGCC C GGGCGGCCT C AGTGAGCGA G CGAGCGCGC 2041 A GCTGCCTGC A GGGGCGCCT G ATGCGGTAT T TTCTCCTTA C GCATCTGTG C GGTATTTCA 2101 C ACCGCATAC G TCAAAGCAA C CATAGTACG C GCCCTGTAG C GGCGCATTA A GCGCGGCGG 2161 G TGTGGTGGT T ACGCGCAGC G TGACCGCTA C ACTTGCCAG C GCCCTAGCG C CCGCTCCTT 2221 T CGCTTTCTT C CCTTCCTTT C TCGCCACGT T CGCCGGCTT T CCCCGTCAA G CTCTAAATC2281 G GGGGCTCCC T TTAGGGTTC C GATTTAGTG C TTTACGGCA C CTCGACCCC A AAAAACTTG 2341 A TTTGGGTGA T GGTTCACGT A GTGGGCCAT C GCCCTGATA G ACGGTTTTT C GCCCTTTGA 2401 C GTTGGAGTC C ACGTTCTTT A ATAGTGGAC T CTTGTTCCA A ACTGGAACA A CACTCAACC 2461 C TATCTCGGG C TATTCTTTT G ATTTATAAG G GATTTTGCC G ATTTCGGCC T ATTGGTTAA2521 A AAATGAGCT G ATTTAACAA A AATTTAACG C GAATTTTAA C AAAATATTA A CGTTTACAA2581 T TTTATGGTG C ACTCTCAGT A CAATCTGCT C TGATGCCGC A TAGTTAAGC C AGCCCCGAC2641 A CCCGCCAAC A CCCGCTGAC G CGCCCTGAC G GGCTTGTCT G CTCCCGGCA T CCGCTTACA2701 G ACAAGCTGT G ACCGTCTCC G GGAGCTGCA T GTGTCAGAG G TTTTCACCG T CATCACCGA 2761 A ACGCGCGAG A CGAAAGGGC C TCGTGATAC G CCTATTTTT A TAGGTTAAT G TCATGATAA 2821 T AATGGTTTC T TAGACGTCA G GTGGCACTT T TCGGGGAAA T GTGCGCGGA A 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pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
pAAV-‐CMV-‐iRFP编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV-‐CMV-‐iRFPpAAV-‐CMV-‐iRFP载体基本信息载体名称: pAAV-‐CMV-‐iRFP质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: CMV载体大小: 5603 b p5' 测序引物及序列: pCAX-‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC)3' 测序引物及序列: C-‐CMV-‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系备注: -‐-‐稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐CMV-‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息pAAV-‐CMV-‐iRFP载体序列:ORIGIN1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT2401 G CCACTCCAG T GCCCACCAG C CTTGTCCTA A TAAAATTAA G TTGCATCAT T TTGTCTGAC2461 T AGGTGTCCT T CTATAATAT T ATGGGGTGG A GGGGGGTGG T ATGGAGCAA G GGGCAAGTT 2521 G GGAAGACAA C CTGTAGGGC C TGCGGGGTC T ATTGGGAAC C AAGCTGGAG T GCAGTGGCA 2581 C AATCTTGGC T CACTGCAAT C TCCGCCTCC T GGGTTCAAG C GATTCTCCT G CCTCAGCCT2641 C CCGAGTTGT T GGGATTCCA G GCATGCATG A CCAGGCTCA G CTAATTTTT G TTTTTTTGG 2701 T AGAGACGGG G TTTCACCAT A TTGGCCAGG C TGGTCTCCA A CTCCTAATC T CAGGTGATC 2761 T ACCCACCTT G GCCTCCCAA A TTGCTGGGA T 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pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐FlucpAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐BpDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RCpAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐PurpAAV-‐minCMV-‐mCherry。
