狗牙根辐射诱变后代变异植株的形态特征比较和ISSR分析
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草坪园艺狗牙根辐射诱变后代变异植株的
形态特征比较和ISSR分析
王文恩,包满珠,张俊卫,刘国锋,宁国贵,尹少华
(华中农业大学园艺林学学院,湖北武汉430070)
摘要:对狗牙根Cynodondactylon‘Princess.77’辐射诱变后代中筛选的7个变异植株与其对照以及目前草坪工程中应用的‘Common’、‘Jackpot’、‘Ulma’、‘Nume×Sahara’、‘Tifway’、‘Tifgreen’等共14份材料进行表型性状比较和ISSR分析,结果表明:各变异植株与对照之间在节间长度方面均有显著差异;节间直径除HN016与对照差异不显著外,其他变异植株与对照之间差异均显著(P<0.05);变异植株HN015的绿期最长,平均270.3d,HN010的绿期最短,平均242.3d;从38个ISSR随机引物中筛选出10个引物,对这14个狗牙根材料的基因组DNA进行PCR扩增,并进行遗传相似系数与聚类分析,形态变异植株与其对照之间的遗传相似系数为0.585～0.776,遗传差异性比较明显。关键词:狗牙根;辐射诱变;变异植株;ISSR中图分类号:S543+19 文献标识码:A 文章编号:100120629(2009)1220139207
狗牙根Cynodondactylon为禾本科狗牙根属多年生草本植物。广泛分布于热带、亚热带和温带沿海等地,其中不少品种是十分重要的暖季型草坪草,已被广泛用于建植运动场、公园、墓地及固土护坡[1]。狗牙根育种最早始于美国[2],1936年著名育种专家Burton在佐治亚州的Tifton海滨实验站,通过狗牙根种内杂交育成世界上第1个狗牙根品种‘Tiflawn’,随后利用普通狗牙根和非洲狗牙根人工种间杂交育成‘Tiffine’、‘Tif2green’等。对于狗牙根而言,采用常规杂交育种方法不仅周期长,而且难度大。辐射育种具有简便、周期短及能创造新类型等特点,是植物改良和基因创新的重要手段,在草坪草上,利用辐射技术诱发突变往往产生矮化的植株,这种性状对于草坪草而言十分有益,目前,诱变育种方法已在杂交狗牙根、假俭草Eremochloaophiuroides、结缕草
Zoysiajaponica等育种中得到应用,并展现出良好的前景。ISSR(Intersimplesequencerepeats)是基于SSR发展起来的一种新型分子标记技术,它是根据基因组内广泛存在的微卫星序列设计单一引物,对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行扩增,然后进行电泳、染色,根据谱带的有无及相对位置,来分析不同样品间ISSR标记的多态性[122]。ISSR技术可以比RFLP、SSR、RAPD等技术更多地揭示基因组中的多态性,是一种很好的DNA指纹标记[324],因此,该技术在种质资源鉴定方面显示出比其他方法更高的优越性,目前ISSR标记已开始应用于植物种质资源鉴定的研究之中。研究利用60Co2γ射线辐射狗牙根‘Princess.77’干种子,并从辐射处理后代中筛选出变异植株7株,从形态特征和分子方面比较鉴定变异植株与其对照以及草坪工程中常用的6个狗牙根品种之间的差异性,为今后的育种工作提供参考依据。1 材料与方法
1.1材料 试验材料详细信息见表1。1.2方法
1.2.1形态指标测量 在参考众多草坪评价方法[526]的基础上结合实际,筛选以下指标进行测定。主要包括节间长度、叶长和叶宽、节间直径、26卷12期Vol.26.No.12草 业 科 学PRATACULTURALSCIENCE139-14512/2009
3收稿日期:2009203201基金项目:国家“十一五”科技支撑计划项目“优质抗逆专用狗牙根新品种选育”2006BAD01A192222作者简介:王文恩(19682),男,内蒙古察右前旗人,高级工程师,在职博士生。Email:wwe@mail.hzau.edu.cn通信作者:包满珠 Email:mzbao@mail.hzau.edu.cn表1 试验材料编号和来源
材料编号品种名称来源HN001CommonHN003JackpotHN005UlmaHN007Nume×SaharaHN009Princess.77湖北种子集团公司HN010HN011HN012HN013HN014HN015HN016HN009辐射后代筛选的变异株系
HN017TifgreenHN018Tifway华中农业大学花卉教学科研基地(匍匐茎无性繁殖)
自然高度、绿期。节间长度为从根茎向上记数的第5个节间的长度;叶长和叶宽为第5个节间上的叶片的测量数值。每个指标均选取3个枝条进行测量。自然高度为从植株根茎起,向上生长的最大自然高度,因筛选出的形态变异植株只有1株,无法进行3次重复测量,故植株的自然高度为单株1次测量值;绿期为春季返青(50%)到冬季枯黄(50%)所保持绿色的时间(目测法,2004-2007年3年观测的平均值)。1.2.2ISSR标记 2005年10月,采集供试植株的幼嫩叶片,液氮中浸置后放在-70℃冰箱中备用。叶片总DNA的提取是在SDS法[7]的基础上稍作改动。以材料HN018的基因组DNA为模板,通过20μL反应体系的扩增反应(10×buffer2μL;10mMdNTP0.4μL;MgCl21.2μL;ISSR引物1μL;Taq酶0.2μL;模板DNA2μL;ddH2O13.2μL,反应体积为20μL),从N10等38个ISSR引物(“优质抗逆专用狗牙根新品种选育”课题组设计,invitrogen公司合成)中筛选出10条重复性好、扩增性强、多态性高的稳定条带的ISSR引物,用这10个引物对14个DNA样品进行ISSR-PCR扩增。反应程序为95℃预变性2min;95℃30s,58℃45s,72℃90s,进行复性梯度降温,5个循环后,固定在95℃30s,53℃45s,72℃90s进行35个循环;最后72℃延伸6min,在2.0%琼脂糖凝胶中电泳3h,电泳液为1×TAE,在凝胶中加0.5μg/mL的EB。电泳后在紫外灯下观察照相。以上反应所用的药品及酶均为Fermentas公司生产。统计时将扩增条带的有无转换为数据“1”和“0”,用SPSS软件计算两两DNA间的相似系数,相似系数S=(2Nab/Na+Nb)×100%。公式中Na、Nb、Nab分别代表a种、b种和a、b2种共有的酶带数;对相似系数进行聚类分析,构建分子聚类图,聚类方法应用UPMGA法。用公式多态性=(总带数-共有带数)/总带数×100%计算各类群间(或类群内)的多态性。2 结果与分析
2.1形态指标比较
2.1.1变异植株与其对照之间的形态特征比较 从叶片宽度来看,除HN010、HN014、HN016与对照差异显著外,其他变异植株的叶片宽度与其对照差异均不显著;变异植株HN011、HN012的叶片长度与对照差异不显著,其他变异植株的叶片长度与对照均有显著差异,其中HN015的叶片长度最短,为1.50cm;变异植株的节间直径和节间长度与对照均有显著差异,其中节间直径均小于对照,HN015的节间长度最短,为0.97cm;从自然高度来看,HN014的高度最高,为40.72cm,HN015的高度最矮,为12.36cm;变异植株HN010、HN013、HN014的绿期与对照差异不显著,其他变异植株的绿期与对照均有显著差异,其中HN015的绿期最长,平均270.3d,比对照平均长24.6d(见图1)。2.1.214个供试材料之间的形态特征比较 由表2可知,14个狗牙根材料中,叶片最宽的是HN014,宽度为0.30cm,叶片最窄的是HN017,宽度为0.13cm;叶片长度最长的是HN003,长度为6.27cm,最短的是HN017,长度为1.10cm;从节间直径来看,最大的是HN005,直径为0.26cm,最小的为HN017,直径为0.11cm;在节间长度方面,节间最长的是HN003,长度为3.80cm,最短的是HN017,长度为0.67cm;植株的自然高度最高的为HN010
,高度为42.52041PRATACULTURALSCIENCE(Vol.26.No.12)12/2009
图1 辐射M1代形态变异植株与其对照盆栽
表2 14个狗牙根材料的形态指标比较
材料编号叶片宽度(cm)叶片长度(cm)节间直径(cm)节间长度(cm)自然高度(m)绿期(d
)
CommonHN0010.20c±0.003.80d±0.200.18c±0.012.40c±0.1935.40253.3c±2.88JackpotHN0030.20c±0.026.27a±0.090.22b±0.003.80a±0.2040.27253.0c±2.64UlmaHN0050.28a±0.013.77d±0.150.26a±0.022.70b±0.1235.17253.3c±2.88Nume×SaharaHN0070.20c±0.003.70d±0.180.22b±0.012.50bc±0.1235.83253.7c±3.21PrincessHN0090.20c±0.023.00e±0.250.17cd±0.001.37f±0.1423.03245.7gf±0.58HN0100.25b±0.025.87b±0.210.14efg±0.023.70a±0.1442.52242.3g±2.52HN0110.18cd±0.012.83e±0.170.10i±0.002.00d±0.2038.14250.3dce±2.52HN0120.20c±0.022.93e±0.180.15efg±0.021.90de±0.1922.17251.0dc±2.64HN0130.18cd±0.012.10f±0.090.13fgh±0.011.93d±0.1617.26247.7dfe±2.64HN0140.30a±0.024.47c±0.190.12ghi±0.002.40c±0.1140.72245.3gf±2.52HN0150.20c±0.031.50g±0.120.14efg±0.010.97g±0.1312.36270.3a±2.52HN0160.20d±0.021.90f±0.170.16cde±0.011.10g±0.1015.37263.3b±2.89TifgreenHN0170.13e±0.021.10h±0.160.11hi±0.020.67h±0.0511.25246.0gfe±1.73TifwayHN0180.20e±0.012.83e±0.120.12ghi±0.011.67e±0.0527.36251.0dc±3.49 注:表中数据为平均值±标准误,同列不同英文字母表示数据间存在显著差异(P<0.05)。cm,最矮的为HN017,高度为11.25cm;绿期最长的为HN015,平均270.3d,最短的为HN010,平均242.3d。14个狗牙根材料中,HN015和HN017的节间长度均小于1cm,自然高度低于13cm,叶片长度小于1.5cm,属于矮生型品种(株系)。2.2ISSR分析
2.2.1筛选的ISSR引物序列 从38个引物中筛14112/2009草 业 科 学(第26卷12期)选出10个多态性好的引物,其中2核苷酸重复序列9个,占90%;5核苷酸重复序列1个(N46)。2核苷酸重复序列中(AG)n较多,占60%,产生的多态性条带也最多,说明狗牙根基因组中含有丰富的AG/GA重复序列。所用引物的编号及序列见表3,其中R=(A,G),Y=(C,T)。2.2.2ISSR扩增结果分析 用筛选出的10个ISSR引物对14个狗牙根材料的基因组DNA分别进行PCR扩增,共扩增出98条带,不同引物扩增条带数7～15条,平均每个引物产生9.8条带,其中多态性条带共94条,多态性条带比率平均为95.92%(见表3)。ISSR反应扩增的DNA片段大小一般为250～2000bp。引物N13扩增出的条带数最多(15条),引物N46扩增出的条带数最少(7条)。
