槲皮素抗宫颈癌的机制研究
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微循环学杂志,2010,20(3):27~29 C 2010 CHINESE JOUR NAL OF MICR OC IR CU LA TION微循环学杂志2010年第20卷第3期基础与实验[作者单位] 武汉大学人民医院妇产科,邮政编码 武汉430060本文2010-05-24收到,2010-06-30修回,2010-07-08接受槲皮素抗宫颈癌的机制研究刘 昱 曹来英 张 蔚 殷金凤[中图分类号] R711.74 [文献标识码] A [文章编号] 1005-1740(2010)03-0027-03槲皮素(Quercetin)是自然界分布最广泛的天然黄酮类物质之一,存在于许多植物的花、叶及果实中,具有非常广泛的生理和药理活性,如扩张冠状血管、降血脂、抗血小板聚集、抗炎、抗病毒、抗多种肿瘤等。
槲皮素的相对分子质量为302.23,构效关系研究表明,槲皮素 环上的邻苯二酚和2,3位的双键,与其抗肿瘤作用具有明显相关性[1]。
但槲皮素抗宫颈癌的作用机制仍不清楚。
本文将槲皮素作用于宫颈癌H ela 细胞,通过流式细胞术观察H ela 细胞凋亡、细胞增殖周期和bcl 2蛋白表达的变化,探讨槲皮素抗人宫颈癌的作用机制。
1 材料与方法1.1 主要试剂槲皮素购自成都超人植化开发有限公司(批号:100418)。
以25mmo l/l 的NaOH 助溶槲皮素,10%的H cl 调pH 值在7.0左右。
NaOH 和H cl 均为国产分析纯。
根据预实验结果,确定用完全培养基配制浓度分别为0、20、40、80 mol/L 的槲皮素工作液。
胎牛血清购自杭州四季青公司,Annexin V/FIT C 为美国Bender M edsy stems 公司产品,碘化丙啶(PI)为美国Sig ma 公司产品,鼠抗人Bcl 2FIT C 为美国BD 公司产品,RPM I1640、0.25%胰酶和青 链霉素均购自美国Invitrog en 公司。
1.2 实验方法1.2.1 细胞培养:人宫颈癌H ela 细胞株购于武汉大学生命科学院细胞典藏中心,在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基(含青霉素100U /m l,链霉素0.1m g/m l)中,于37 、5%CO 2的孵育箱中培养。
1.2.2 细胞凋亡率的检测:取对数生长期的人宫颈癌H ela 细胞,按2!105/m l 、每孔100 l,接种于96孔板中培养,24h 后分别加入终浓度分别为20、40、80 mol/L 的槲皮素溶液200 l,对照组加等量完全培养基,每组设6个复孔,继续培养24、48、72h 后,用胰酶消化并收集细胞,各组细胞调密度为1!106/m l,加入1ml PBS 洗,1000r/min 离心5m in,弃上清后加入1∀4Buffer 195 l,Annex in V 5 l,避光孵育10min,再加入PBS 洗,1000r/m in 离心5min,弃上清后加入1:4Buffer 190 l,加入PI 10 l,200目尼龙网过滤细胞后,采用流式细胞仪和An nex in V PI 双标法检测分析H ela 细胞凋亡率。
1.2.3 细胞周期检测:取对数生长期H ela 细胞接种于12孔培养板中,24h 后分别加入终浓度分别为20、40、80 mol/L 的槲皮素溶液200 l,对照组加入完全培养基,每组设3个复孔。
继续培养48h 后,用胰酶消化细胞,1000r/m in 离心5m in,弃上清,PBS 漂洗并重悬。
70%冷乙醇4 固定过夜,400 g/ml PI 4 避光染色1h,用流式细胞仪进行细胞周期分析。
1.2.4 Bcl 2蛋白的检测:取对数生长期的人宫颈癌H ela 细胞按2!105/ml 、每孔100 l,接种于96孔板中培养,24h 后分别加入终浓度分别为20、40、80 m ol/L 的槲皮素溶液200 l,对照组加等量的完全培养基,每组设6个复孔,继续培养48h 后,用胰酶消化并收集细胞,各组细胞调密度为1!106/m l,1000r/min 离心5m in,弃上清,PBS 液漂洗,1000r/min 离心5m in,弃上清;加入M EDU M A 50ul,避光孵育1min,用1!Platelet Washing Rea g ent 洗,1000r/min 离心5m in,弃上清;加入M E DU M B 40 l,然后加入鼠抗人Bcl 2FITC 3 l,避光孵育20min,PBS 液漂洗1000r/min 离心5min,弃上清,用1%多聚甲醛200 l 固定,用流式细胞仪进行检测。
1.3 统计学处理实验数据均以均数#标准差( x #s )表示,应用SPSS17.0统计软件进行多组间方差分析,样本均数间两两比较采用q检验,P<0.05为有显著性差异。
2 结 果2.1 槲皮素对H ela细胞凋亡的促进作用不同浓度槲皮素作用H ela细胞24、48、72h的检测结果显示随槲皮素浓度的加大和作用时间的延长,细胞凋亡发生率明显升高,与对照组相比有显著性差异。
见表1。
2.2 槲皮素对H ela细胞周期的影响用不同浓度槲皮素作用H ela细胞48h的细胞周期分析结果显示,20 mol/L的槲皮素对细胞周期的影响不大,但随着槲皮素浓度的增加,G1期细胞所占百分比明显增加。
见表2。
2.3 槲皮素对H ela细胞Bcl 2蛋白表达的影响用不同浓度的槲皮素作用H ela细胞48h后, Bcl 2蛋白表达阳性率随药物浓度的增加而明显下降,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。
见表3。
表1 槲皮素对H ela细胞凋亡的影响(%,n均=6, x#s)培养时间(h)空白对照组不同槲皮素浓度组( mol/L)20408024 3.14#1.12 3.93#1.01 4.67#0.632)7.21#0.512)48 4.53#0.34 5.63#0.431)12.92#0.732)14.83#0.732)72 5.61#0.73 6.73#0.451)14.08#0.172)18.32#0.912)注:与同一时间空白对照组比较,1)P<0.05,2)P<0.01表2 槲皮素作用48h对H ela细胞周期的影响(%,n均=3, x#s)G1/G0G2/M S 空白对照组24.31#11.0118.06#7.6153.08#13.75不同槲皮素 2032.56#13.7318.04#8.5649.06#13.56浓度组 4057.09#18.751)15.06#7.3428.03#14.371) ( mol/L) 8073.09#15.751)2)14.08#6.9414.08#10.251)2)注:与空白对照组比较,1)P<0.05;与40 mol/L浓度的槲皮素组比较,2)P<0.05表3 槲皮素对Hela细胞Bcl 2蛋白表达的影响(%,n均=6, x#s)空白对照组不同槲皮素浓度组( mol/L)204080Bcl 2阳性率0.44#0.0160.30#0.0151)0.23#0.0171)2)0.17#0.0071)2)注:与空白对照组比较,1)P<0.05;与20 mol/L浓度的槲皮素组比较,2)P<0.05微循环学杂志2010年第20卷第3期基础与实验3 讨 论宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,严重威胁着全球女性的健康,每年约有51万例新发病例。
据不完全统计,中国每年有新发病例10万例,大约占世界宫颈癌新发病例的1/5,每2分钟就有1例宫颈癌发生。
其治疗以手术为主、放化疗为辅,但效果不理想、费用高。
小分子药物是当前抗肿瘤研究的热点[2]。
槲皮素是一个很经济的黄酮类药物,在我国有很丰富的资源,具有非常广泛的生理和药理活性。
研究发现,槲皮素对多种肿瘤有抑制作用[3,4]。
近年来,槲皮素在抗宫颈癌作用方面的研究结果引起了国内外许多学者越来越多的关注,但其作用机制目前仍不清楚。
研究表明,肿瘤的发生发展不仅是肿瘤细胞增殖和分化异常所致,而且还是肿瘤细胞异常凋亡的结果[5]。
细胞凋亡是当前肿瘤研究中的热点之一,很多抗癌药物的作用机制是通过诱导各自敏感的细胞发生凋亡来达到治疗目的。
因此,诱导肿瘤细胞凋亡,对临床治疗肿瘤有指导意义。
本研究应用流式细胞仪检测不同浓度的槲皮素在各个时间点作用于人宫颈癌H ela细胞后细胞凋亡率的变化,发现细胞凋亡率随着浓度的升高和时间的延长明显增加,表明槲皮素可以诱导人宫颈癌H ela细胞凋亡。
细胞的增殖依赖于细胞周期的顺利进行,在真核细胞周期中,G1期是唯一能接受外界信息刺激的时期,位于该时期的限制点是G1∃S转换的关键时28 刘 昱,曹来英,张 蔚,等点,该点的转换决定了细胞周期继续增殖还是停滞或死亡[6]。
本文数据显示,20 mol/L 的槲皮素对细胞周期的影响不大,但随着槲皮素浓度的增加,G1期细胞所占百分比明显增加,表明槲皮素可能通过阻断H ela 细胞于G1期,而后诱导细胞进入凋亡,从而抑制H ela 细胞的生长。
细胞凋亡是受基因调控的,Bcl 2原癌基因是迄今为止研究最为深入和广泛的凋亡调控基因之一。
研究表明,在许多肿瘤的发生过程中,Bcl 2蛋白表达率呈增加趋势,提示Bcl 2蛋白表达增加是肿瘤细胞凋亡受抑的重要机制之一。
近年来在对一些抗肿瘤药物进行研究时发现,这些药物可以通过下调Bcl 2蛋白表达,诱导肿瘤细胞凋亡[7]。
本实验结果显示,随槲皮素浓度的增加,Bcl 2蛋白表达减少。
表明槲皮素诱导宫颈癌H ela 细胞凋亡可能是通过下调Bcl 2蛋白表达水平,增加细胞对凋亡信号的易感性,最终诱导H ela 细胞发生凋亡。
综上所述,槲皮素可以诱导人宫颈癌H ela 细胞凋亡,其机制可能通过阻断H ela 细胞于G1期,下调Bcl 2蛋白表达水平而诱导其凋亡。
此结果为槲皮素用于宫颈癌临床治疗提供了理论依据。
本文第一作者简介:刘 昱(1987~),女,汉族,在读硕士研究生,主要从事宫颈疾病研究微循环学杂志2010年第20卷第3期基础与实验参考文献1 Okam oto T.Safety of quercetin of clinical application (Review ).M ol M ed,2005,16(2):275~278.2 Kawaii S,Lansky EP.Differenti ation promoting activity of pome granate (Punica granatum)fruit ex tracts in H L 60human p rom ye locytic leu kem ia cells.M ed Food,2004,7(1):13~18.3 贺兼斌,张贻秋,向 志等.槲皮素联合顺铂对肺腺癌小鼠移植瘤Bcl 2和Bax 表达的调控及意义.肿瘤,2008,5,28(5):386~389.4 周 进,方 丽,高 茜等.槲皮素对H ep G2细胞增殖及Cyclin D2基因表达影响的观察.中华肿瘤防治杂志,2009,1,16(1):6~9.5 Golstein P.Controlling cell death.Science.1997,275:1081~1082.6 司维柯,高利宏,刘 斌,等.苦参碱诱导人肝癌细胞凋亡细胞分化、凋亡时对G1细胞周期调节因子的调控.癌症,2001,20(8):848~851.7 王中林,蒋 平,谭映霞,等.苦参碱对NCI N87胃癌细胞增殖、凋亡及Bcl 2蛋白表达的影响.中华中医药学刊,2009,27(1):141~144.%信息栏%中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议通知中国病理生理学会第九届全国代表大会暨学术会议将于2010年11月1日至11月4日在南京国际会议中心举行。
