脂肪间充质干细胞对博来霉素诱导的硬皮病小鼠模型的治疗作用

・９７０・　北京大学学报　（　医学版　）　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＰＥＫＩＮＧ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＨＥＡＬＴＨ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ）　Ｖｏ１．４８　Ｎｏ．６　Ｄｅｃ．２０１６　

・论著・　

脂肪问充质干细胞对博来霉素诱导的硬皮病小鼠　

模型的治疗作用　

窦晶莉　，白　力　，庞春艳　，张文兰　，张伟　，王永福　，。　

（１．包头医学院第一附属医院风湿免疫科，内蒙古自治区包头０１４０１０；２．内蒙古自治区自体免疫学重点实验　室，内蒙古自治区包头０１４０１０）　

［摘要］目的：研究脂肪问充质干细胞（ａｄｉｐｏｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ＡＤＳＣｓ）对博来霉素（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ，ＢＬＭ）诱导　的硬皮病小鼠的治疗效果及其可能的作用机制。方法：选取Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性小鼠２４只，采用皮下注射ＢＬＭ［２　ｍｇ／（ｋｇ・ｄ）］建立硬皮病小鼠模型，随机分为正常对照组、ＢＬＭ组、ＡＤＳＣｓ（皮下）组和ＡＤＳＣｓ（静脉）组，每组６　只，正常对照组给予生理盐水２　ｍＬ／（ｋｇ・ｄ）皮下注射，其余３组分别给予ＢＬＭ皮下注射，连续３周，然后，ＡＤＳＣｓ　皮下和尾静脉注射组分别给予皮下和尾静脉注射ＡＤＳＣｓ（２×１０　个细胞）治疗，每４天１次，共３次。流式细胞术　检测小鼠脾细胞中的辅助Ｔ细胞１７（Ｔ—ｈｅｌｐｅｒ　１７，ＴＨ１７）及调节性Ｔ细胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ，Ｔｒｅｇ），实时荧光定量聚　合酶联反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）法检测小鼠肺组织中相关细胞因子的表达水平，酶联免疫吸附法　（ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏ　ｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）检测小鼠血清中白介素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ，ＩＬ）－６、转化生长因子Ｂ（ｔｒａｎｓｆｏｒ—　ｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－Ｂ，ＴＧＦ—Ｂ）的含量，苏木精一伊红染色（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ　ｅｏｓｉｎ　ｓｔａｉｎｉｎｇ，ＨＥ）观察小鼠的皮肤和肺组织　病理学改变。结果：流式细胞术结果显示，ＢＬＭ组较正常对照组小鼠脾细胞中ＴＨ１７和Ｔｒｅｇ所占比例升高　（１５．３０％±１．２９％ｙｓ．４．３２％±０．７９％；９．９０％±１．９５％ｙｓ．５．１８％±１．３５％，Ｐ均＜０．０５），经ＡＤＳＣｓ治疗后，　ＴＨ１７所占比例降低（５．０２％－４－０．８３％，６．００％±０．８２％　．１５．３０％±１．２９％，Ｐ均＜０．０５），而Ｔｒｅｇ所占比例升高　（１４．３２％±１．５９％，１１．０９％±４．３１％ｕｓ．９．９０％±１．９５％，Ｐ均＜０．０５）。与正常对照组相比，ＢＬＭ组小鼠肺组织　中ＩＬ一１７、ＩＬ－６、肿瘤坏死因子ｏ／．（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ—　，ＴＮＦ—ｄ）的ｍＲＮＡ表达水平及血清中ＩＬ一６的含量均升高　［３．５４±０．３０，１０．６５±０．６６，５．３７　４－０．５２　．１．００±０．００；（２１．２±１．７４）ｎｇ／Ｌ　．（１６．８７±１．０９）ｎｇ／Ｌ，Ｐ±句＜　０．０５］，ＡＤＳＣｓ治疗后，其表达量下降［１．６３±０．４５，１．５０－４－０．２９　ｖｓ．３．５４－４－０．３０；３．１１±０．８５，２．９８－４－０．７６　ｖｓ．１０．６５±　０．６６；１．４５±０．４７，１．５９±０．４１　ｖｓ．５．３７±０．５２；（１７．８７±１．４５）ｎｇ／Ｌ，（１７．６１±１．１６）ｎ＃Ｌ　ｖｓ．（２１．２±１．７４）ｎｇ／　Ｌ，Ｐ均＜０．０５］，ＡＤＳＣｓ（皮下）组和ＡＤＳＣｓ（静脉）组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。ＢＬＭ组小鼠血清中ＴＧＦ—　ｐ的含量较正常对照组升高［（３３．９５±２．４９）ｎｇ／Ｌ　ｖｓ．（２８．８±２．２９）ｎｇ／Ｌ，Ｐ＜０．０５］，但小鼠肺组织中ＴＧＦ—ｐ　ｍＲＮＡ的表达水平与正常对照组之间差异无统计学意义（１．１７±０．１１　ｖ３．１．００±０．００，Ｐ＞０．０５），经ＡＤＳＣｓ治疗　后ＴＧＦ—Ｂ基因和蛋白的表达无明显变化［１．２５±０．１１，１．２６±０．１２　１．１７±０．１１；（３１．８４±２．０４）ｎｇ／Ｌ，　（３１．２５±２．３６）ｎｇ／Ｌ　ｕｓ．（３３．９５±２．４９）ｎｇ／Ｌ，Ｐ＞０．０５］。ＨＥ染色结果显示，ＢＬＭ组与正常对照组相比，肺组织　有大量炎性细胞浸润，肺泡间隔断裂或消失；皮肤真皮层增厚，有大量的胶原纤维积聚，经ＡＤＳＣｓ治疗后小鼠肺组　织炎症有所改善，皮肤的真皮层变薄，胶原纤维积聚减少。结论：ＡＤＳＣｓ可以有效缓解硬皮病小鼠肺的炎症和皮　肤的纤维化症状，其抗炎和抗纤维化作用与其免疫调节功能有关。　［关键词］干细胞，间充质；硬皮病；免疫调节；细胞因子类　［中图分类号］Ｒ５９３．２５　［文献标志码］Ａ　［文章编号］１６７１—１６７Ｘ（２０１６）０６－０９７０－０７　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７ｌ一１６７Ｘ．２０１６．０６．００９　

Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａｄｉｐｏｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ－－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　Ｏｉｌ　ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｉｃｅ　ｏｆ　ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ　

ＤＯＵ　Ｊｉｎｇ．１ｉ　＇。，ＢＡＩ　Ｌｉ　，ＰＡＮＧ　Ｃｈｕｎ—ｙａｎ　，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｎ．１ａｎ　，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｉ　，ＷＡＮＧ　Ｙｏｎｇ　ｆｕ　＇　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｂａｏｔｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂａｏｔｏｕ　０１４０１０，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｏｆ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ，Ｂａｏｔｏｕ　０１４０１０，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ，Ｃｈｉｎａ）　

ＡＢＳＴＲＡＣＴ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ａｄｉｐｏｓｅ—ｄｅｒｉｖｅｄ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　（ＡＤＳＣｓ）ｏｎ　ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ｍｉｃｅ　ｏｆ　ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ，２４　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ　ｆｅｍａｌｅ　

基金项目：国家自然科学基金项目（８１３６０４６４）和内蒙古自然科学基金项目（２０１６ＭＳ０８１０９）资助Ｓｕｐｐｏｓｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ（８１３６０４６４）ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｐｒ￣ｅｃｔｓ（２０１６ＭＳ０８１０９）　△Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ’Ｓ　ｅ—ｍａｉｌ．ｗｙｆＳ１６８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｎ　网络出版时间：２０１６—１０－３１　１６：０４：１７网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｅｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／ｌ１．４６９１．Ｒ．２０１６１０３１．１６０４．００４．ｈｔｍｌ

　窦晶莉，等脂肪间充质干细胞对博来霉素诱导的硬皮病小鼠模型的治疗作用　・９７１・　

ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｃｏｎｔｒｏＩ　ｇｒｏｕｐ．ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ（ＢＬＭ）ｇｒｏｕｐ，ＡＤＳＣｓ（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ＡＤＳＣｓ（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）ｇｒｏｕｐ．ＢＬＭ［２　ｍｇ／（ｋｇ・ｄ）］ｗａｓ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　６　ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｉｎｉｅｃ．　ｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏｒｍａｌ　ｓａｌｉｎｅ　２　ｍＬ／（ｋｇ・ｄ）ｂｙ　ｓｕｂｃｕｔａｎｅ０ｕｓｌｖ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＢＬＭ．ＡＤＳＣｓ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡＤＳＣｓ（２×１０　）ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｖ　ａｎｄ　ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ．　１ｙ．Ｔ．ｈｅｌｐｅｒ　１７　ｆ　Ｔｈ１７）ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ（Ｔｒｅｇ　ｃｅｌ１）ｏｆ　ｓｐｌｅｅｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅ．　ｔｒｙ．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　１ｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｒｃａ１．ｔｉｍｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ．１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏ　ｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　（ＥＬＩＳＡ）．　ｒｈｅ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｓｋｉｎ　ａｎｄ　ｌｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ　ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）ｓｔａｉ．　ｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏ￣ｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｈ１７　ａｎｄ　Ｔｒｅｇ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ＢＬＭ　ｇｒｏｕｐ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　（１５．３０％±１．２９％ｕｓ．４．３２％±０．７９％：９．９０％±１．９５％　．５．１８％±１．３５％．Ｐ＜０．０５），ｔｈｅ　ｅｘ—　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｈｌ７　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ（５．０２％±０．８３％．６．００％±０．８２％　ｓ．１５．３０％±１．２９％，　Ｐ＜０．０５）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒｅｇ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ＡＤＳＣｓ　ｔｈｅｒａｐｙ（１４．３２％±１．５９％，　１１．０９％±４．３１％ｖｓ．９．９Ｏ％４－１．９５％．Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ＩＬ．１７。ＩＬ．６，ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏ—　ｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ．　（ＴＮＦ．　）ｍＲＮＡ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　ＩＬ－６　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ＢＬＭ　ｇｒｏｕｐ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｆ　３．５４　４－０．３０，ｌＯ．６５　４－０．６６。５．３７±０．５２　ｓ．１．００±０．Ｏ０；（２１．２　４－１．７４）ｎｇ／Ｌ　ｕｓ．　（１６．８７　４－１．０９）ｎ　Ｌ，Ｐ＜０．０５｝．　ｒｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ＡＤ—　ＳＣｓ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｌ　１．６３±０．４５，１．５０　４－０．２９　ｖｓ．３．５４　４－０．３０；３．１１　４－０．８５。２．９８±０．７６　ｕｓ．１０．６５　４－０．６６；　１．４５　４－０．４７，１．５９　４－０．４１＇ＢＳ．５．３７　４－０．５２；（１７．８７±１．４５）ｎ　Ｌ，（１７．６１±１．１６）ｎ　Ｌ　ｖｓ．　（２１．２±１．７４）ｎ　Ｌ，Ｐ＜０．０５　ｆ．Ｂｕｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＡＤＳＣｓ（ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｃ　ｉｎ．　ｉｅｃｔｉｏｎ）ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ＡＤＳＣｓ（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）ｇｒｏｕｐ（尸＞０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＦ．Ｂ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ＢＬＭ　ｇｒｏｕｐ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐｌ（３３．９５　４－２．４９）ｎｇ／Ｌ哪．（２８．８　４－２．２９）ｎ　Ｌ，　Ｐ＜０．０５　ｌ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＦ．Ｂ　ｍＲＮＡ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（１．１７　４－０．１１　ｕｓ．１．００　４－０．Ｏ０，Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＦ．Ｂ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ＢＬＭ　ｇｒｏｕｐ　Ｉ　１．２５±０．１１，１．２６　４－０．１２　．１．１７±０．１１：（３１．８４　４－　２．０４）ｎｇ／Ｌ，（３１．２５　４－２．３６）ｎｇ／Ｌ　．（３３．９５±２．４９）ｎ　Ｌ，Ｐ＞０．０５　１．ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｕｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ　ｗａｓ　ｒｅｌｉｅｖｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｒｍａｌ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ　ａｎｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅ—　ｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ＡＤＳＣｓ　ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＡＤＳＣｓ　ｃｏｕｌｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｌｌｅｖｉａｔｅ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｕｎｇｓ　ａｎｄ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｏｆ　ｓｋｉｎ：ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｎｔｉ．ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｎｄ　ａｎｔｉ—ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ．　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ，ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａＩ：Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ；Ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ