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人脂肪干细胞的分离、培养及鉴定李玉秋;张雷雷;黄飞【摘要】目的:探讨胶原酶消化法从人脂肪组织中提取脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的可行性.方法:采用胶原酶消化法将真空抽脂术抽取的新鲜脂肪组织进行消化分离,获取ADSCs并进行培养,用流式细胞术鉴定ADSCs的表面特异性标志物CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果:利用胶原酶消化法可成功提取ADSCs,其标志物CD44和CD105表达阳性,CD34为低表达,CD45表达为阴性.结论:通过胶原酶法可成功提取人ADSCs.【期刊名称】《沈阳医学院学报》【年(卷),期】2018(020)006【总页数】4页(P495-498)【关键词】人脂肪干细胞;细胞分离;细胞培养;细胞鉴定【作者】李玉秋;张雷雷;黄飞【作者单位】山东华思生物科技有限公司,山东烟台 264003;山东华思生物科技有限公司,山东烟台 264003;山东华思生物科技有限公司,山东烟台 264003【正文语种】中文【中图分类】R329.2脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是2001年Zuk等［1］从真空吸脂术抽出的脂肪中发现的一种间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），其含量约占脂肪组织的10%～20%［2］。
ADSCs同其他MSCs一样，具有自我更新和多向分化的潜能，是成体干细胞的一种，在疾病治疗领域有巨大的潜力。
但ADSCs较骨髓干细胞有更高的提取率，其提取率可高达1%～2%，是骨髓干细胞的1 000倍［3］。
ADSCs已成为研究者们青睐的种子细胞，本文就ADSCs的提取、培养和鉴定进行研究。
1 材料与方法1．1 材料1．1．1 脂肪组织选取滨州医学院附属医院产科剖宫产产妇皮下脂肪组织，产妇无其他基础疾病，未经过特殊药物治疗，取材前均获得医院伦理委员会批准和产妇知情同意。
一、脂肪干细胞（ASCs）的提取及鉴定1、实验技术及原理：运用细胞培养技术、流式细胞术（体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化），差异离心术（可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态）。
取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化（37℃，30分钟）以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心（1200g,10分钟），去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L 氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。
镜下计数，孵箱培养，24小时后第一次换液，按10⒋个细胞/ml种植在培养瓶中，37℃5%CO2以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。
细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴定。
2、实验用品：2.1 材料：C57BL／6 WT小鼠2.2 试剂：PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DMEM2.3 仪器设备：超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子（尖头、平头和有沟镊）、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗3、细胞培养的方法与步骤：3.1无菌操作的要领和要求。
3.2细胞原代培养：3.2.1操作步骤a．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
b. 取材：取C57BL／6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液。
脂肪间充质干细胞提取方法脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）是一种广泛存在于人体脂肪组织中的多潜能干细胞。
由于其易于获取、丰富来源以及多向分化潜能等优势，ADMSCs在再生医学和组织工程领域备受关注。
提取脂肪间充质干细胞的方法有多种，常用的包括机械消化法、酶消化法以及分离培养法。
本文将对这些方法进行介绍和比较。
1. 机械消化法机械消化法是一种较为简单直接的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用机械切割或研磨的方法将脂肪组织分解成小块。
接下来，使用胶原酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
2. 酶消化法酶消化法是一种常用的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，使用胰蛋白酶等酶类物质对脂肪组织进行消化。
消化过程中，酶能溶解脂肪细胞膜，并释放出脂肪间充质干细胞。
最后，通过离心等方法将脂肪间充质干细胞与其他细胞分离开来。
3. 分离培养法分离培养法是一种较为复杂但效果较好的提取脂肪间充质干细胞的方法。
首先，将脂肪组织从捐赠者身体中获取，并去除血管和结缔组织。
然后，将脂肪组织切成小块，并加入胶原酶等酶类物质进行消化。
消化后，将细胞悬液进行离心分离，得到含有脂肪间充质干细胞的细胞沉淀。
接下来，将细胞沉淀进行过滤和洗涤，去除其他细胞和残留酶类物质。
最后，将脂肪间充质干细胞进行培养，促进其增殖和分化。
以上提取方法各有优劣。
机械消化法操作简单，但提取效率较低，且存在细胞破损的风险；酶消化法提取效率较高，但对酶的质量和浓度要求较高，且酶消化过程可能影响细胞活力；分离培养法提取效率较高，且可以得到纯度较高的脂肪间充质干细胞，但操作复杂且耗时较长。
为了获得高质量的脂肪间充质干细胞，提取过程中的无菌操作非常重要。
人脂肪来源间充质干细胞的制备及其质量检验方法陈冲;闫俊灵;李梁;徐潇;丁红;汤苏阳【摘要】目的：研究人脂肪来源间充质干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）的制备及其质量检验方法，为临床研究提供安全合格的干细胞。
方法取50例人吸脂术抽取的脂肪，剪碎，用胰酶和胶原酶消化、分离、培养，并按照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》对其进行细胞形态、数量、活率、无菌、支原体、人源特定病毒及猪源病毒、内毒素、免疫抑制活性、分化能力、免疫表型等检测及染色体核型。
结果50例hADSCs；细菌、内毒素检测阴性，无内外源致病菌；干细胞免疫表型检测CD90、CD105表达阳性，阳性率＞95％，CD34、CD45和HLA-DR表达阴性，阳性率＜2％；具有成骨、成脂分化潜能；能抑制异体淋巴细胞的增殖。
间充质干细胞活性冻存前≥92％，冻存复苏后≥82％。
结论按照本工艺及标准制备的hADSCs符合质量控制标准，为同类干细胞制备及其检定过程标准化提供了试验依据。
%Objective To study the human adipose derived mesenchymal stem cells in vitro amplification and quality inspec-tion methods and provide safe and qualified stem cells for clinical research .Methods Fifty human source liposuctioned fat , sheared, underwent trypsin and collagenase digestion , separation, culture, and according to the “stem cell-based medicinal product quality con-trol of pre clinical research guidi ng principle” to detect the cell morphology , quantity, live rate, sterilization, mycoplasma, human source specific virus and swine virus , endotoxin , immunosuppressive activity , differentiation ability , immunophenotype detection and chromosome karyotype .Results Human adipose derived mesenchymal stem cell activity beforecryopreservation is ≥92%, after re-vival≥82%;bacteria and endotoxin test negative , no internal and external source pathogenic bacteria;stem cell immunophenotype de-tection of CD90, CD105 positive, the positiverate >95%, CD34, CD45 and HLA-DR negative expression , the positive rate <2%;with osteogenic and adipogenic differentiation proficiency ,it can inhibit the proliferation of allogeneic lymphocytes .Conclusions The preparation process and the standard of human adipose derived mesenchymal stem cell line according to the quality control standardof“stem cell-based medicinal product quality control of pre clinical research guiding principle ”, it provides the experimental basis for the similar stem cell preparation and standardizing verification process .【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】5页(P170-174)【关键词】脂肪干细胞;间充质干细胞;质量控制;免疫表型;分化潜能;染色体核型分析【作者】陈冲;闫俊灵;李梁;徐潇;丁红;汤苏阳【作者单位】100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科;100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科;100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科;100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科;100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科;100039 北京，武警总医院皮肤再生医学科【正文语种】中文【中图分类】R329.2人脂肪来源间充质干细胞(human adipose-derived stem cells, hADSCs)，是从脂肪组织中分离获得的一种具有自我更新及多向分化潜能的干细胞[1]，是极具前景的组织工程和基因治疗的种子细胞。
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为了确保其在临床应用和科研中的质量和安全，制定了一系列的质量检定标准。
下面将介绍的相关内容。
1. 细胞来源和提取。
细胞来源鉴定。
确保细胞来源的准确性和可追溯性，包括供体的信息、采集过程的规范性等。
提取和分离方法。
《人脂肪干细胞（ADSCs）的分离培养及多向分化潜能研究》篇一一、引言人脂肪干细胞（ADSCs）作为一种重要的细胞资源，近年来在医学和生物学领域中引起了广泛关注。
这种细胞类型不仅在临床医学上被广泛应用于治疗各种疾病，同时在科学研究领域，它的多向分化潜能及生物机制也是备受瞩目的研究方向。
本文就人脂肪干细胞的分离培养方法和多向分化潜能的研究进行了系统性的探讨。
二、人脂肪干细胞的分离培养1. 分离方法人脂肪干细胞的分离主要依赖于酶解法。
首先，从供体脂肪组织中获取足够的细胞，通过使用含有特定酶的溶液（如胶原酶）来分解脂肪组织，使ADSCs得以释放。
随后，通过离心和筛选过程，获取纯度较高的ADSCs。
2. 培养方法ADSCs的体外培养通常使用含有生长因子和营养物质的特殊培养基。
这些培养基提供了细胞生长所需的营养和环境条件。
在培养过程中，应定期更换培养基，以确保细胞持续得到所需的营养供给。
同时，也需要关注细胞的生长状况和活力。
三、多向分化潜能研究1. 分化为成骨细胞ADSCs具有分化为成骨细胞的能力，这一过程可以通过添加适当的诱导剂和调节生长因子来实现。
在分化过程中，可以通过观察细胞的形态变化和特定基因的表达情况来评估其分化的程度和效果。
2. 分化为成脂细胞ADSCs还可以分化为成脂细胞，这一过程可以通过调整培养基中的营养成分和生长因子来实现。
成脂细胞的分化可以通过观察细胞的脂滴形成和特定基因的表达情况来评估。
3. 分化为神经细胞除了成骨细胞和成脂细胞外，ADSCs还具有向神经细胞分化的潜能。
这一过程可以通过特定的诱导剂和培养条件来实现。
对分化后的神经细胞进行功能测试和基因表达分析，可以评估其分化的效果和潜能。
四、结论通过对人脂肪干细胞的分离培养和多向分化潜能的研究，我们可以更好地了解这种细胞的特性和功能。
ADSCs的分离培养方法已经相对成熟，使得我们可以获取大量的细胞进行后续研究。
同时，ADSCs的多向分化潜能也为临床治疗提供了新的可能性和思路。
AdvCell®原代人脂肪干细胞
★产品简介
AdvCell®原代人脂肪干细胞是从正常成人脂肪组织中经过最小代数的放大在GMP洁净条件下精心分离获得的，无微生物及病原体污染。
★产品号
Cat No : MAC0001
★产品规格
≥105个细胞/管（lmg/管）
★保存条件
液氮或干冰（-80℃）
★使用说明
1、
传代培养原理：传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。
所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
2、
传代培养的步骤:拿到的细胞，如果是冻存的，首先要复苏，步骤是，取出立刻用37摄氏度水浴溶解，然后离心去冻存液，加入十倍体积的培养液，悬浮，离心去培养液，再加入培养液，转入培养瓶培养即可。
关键是快速解冻。
传代是细胞在培养瓶中长满后，去培养液，胰酶消化使细胞脱壁，转入离心管离心，去消化液，用培养液悬浮，取部分细胞悬液(按需要)接入新的培养瓶，加入足够的培养液培养即可。
培养几天换液:取决于细胞类型或者说生长/新陈代谢的速度，一般哺乳动物细胞在2-4天换液的比较常见。
13BIOTECHWORLD 生物技术世界1 前言间充质干细胞是由一组不同分化潜能的细胞组成的。
MSC存在于多种组织,主要包括骨髓、脂肪组织、骨骼肌、肝脏、皮肤结缔组织、胚胎组织、脐带、脐血及外周血等。
由于MSC具有多向分化潜能,在一定实验条件诱导下可向不同胚层的细胞分化[1]。
2001年,Zuk [2]等从抽脂术废弃的脂肪组织中,分离出脂肪干细胞,并证明这种丰富且能再生的组织可作为未来组织工程的细胞来源。
体外实验显示在特定培养条件下,MSC可分化为中胚层起源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞等。
本文通过体外培养的方法从脂肪组织中筛选出ADSCs [3],进一步研究脂肪干细胞体外分离培养的方法,并进行染色和表面抗原鉴定,为ADSCs 相关研究提供参考。
2 材料与方法:2.1 样品来源:人腹部抽脂50ml 2.2 试剂PBS(磷酸盐缓冲液),Hyclone;DMEM/F-12 1:1,Hyclone;0.1% I型胶原酶;Ul troser-G,PALL;L-Glu ,GIBCO;0.25%胰酶,Life;地塞米松, SIGMA;IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤);油红O;异丙醇;75%酒精。
2.3 ADSCs 分离和培养收集脂肪组织后,加入等体积的PBS,2000rpm,5min离心,吸弃中间盐水层,保留上层脂肪层和下层沉淀,重复离心2遍,保留上层脂肪层和下层沉淀细胞。
向含有脂肪层的离心管中加入等体积的0.1%I型胶原酶,37℃,水浴8min,加入等体积PBS 终止消化,2000rpm,5min离心,吸弃中间盐水层,保留上层脂肪层和下层沉淀,重复消化离心3遍,最后弃去上层脂肪层。
将两次收集到的沉淀合并,用PBS洗一次,离心弃上清。
用注射用水裂解红细胞,离心收集沉淀。
取3×106个细胞接种到T175 cm 2 细胞培养瓶中,用含有2% Ul troser-G和1% L-Glu的DMEN/F-12培养,24h,次日收集细胞液,下层贴壁细胞为成纤维细胞,将细胞液重新接种到新的T175 cm 2 细胞培养瓶中,隔三天换液一次,培养期间根据细胞生长情况传代,培养到第14天时收获细胞[4]。
人脂肪干细胞的培养及鉴定尚志刚;郭琼;李甜;白生宾;钟近洁;秦纹;冯树梅【摘要】Objective To establish an effective method on isolating and identifying Human adipose stem cells(hADSCs). Methods Collagenase digestion was adopted to isolate stem cells from human adipose tissue.These isolated cells were subcultured and passaged in vitro,the morphology and cell growth curve were characterized subsequently.Moreover,flow cytometry and multi-lineage differentia⁃tion ability were identified. Results The obtained cells with spindle-shape were adherent monolayer cells,and were arranged in whirlpool or radiation.The cell growth curve was a typical“S”shape ,indi⁃cating a 26h of doubling generation time.These cells are positive for CD29,CD105,CD44,negative for CD45 showed by Flow cytometry.The positive results of oil red and alizarin red staining also indicated that the obtained cells were pluripotent. Conclusion HADSCs could be obtained from human abode⁃men adipose tissue through a series of isolation and identified methods.%目的：探讨人脂肪干细胞的分离、培养并鉴定。
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。
Zuk等[1]从吸脂术抽取的脂肪组织悬液中最先分离培养出多向分化潜能的干细胞。
研究发现，ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。
人ADSCs主要来源于吸脂术得到的脂肪组织，随着整形美容业的迅猛发展，重睑手术所得的眶隔脂肪组织也随之增多，给ADSCs的取材提供了新的路径。
本研究主要探讨人上睑眶隔脂肪来源的脂肪提取ADSCs的可行性。
1材料与方法1.1脂肪组织来源本研究所用脂肪组织来自于潍坊医学院整形外科医院重睑手术者，均为女性，年龄18~30岁。
1.2主要试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基（Gibco公司，美国），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Hyclone公司）等。
1.3ADSCs的分离培养及传代将取出的脂肪组织放于无菌盘中，用PBS冲洗3遍，然后用无菌眼科剪刀剔除血管、筋膜等组织，再用PBS冲洗3遍。
把修剪好的脂肪组织放入盛有高糖DMEM（无血清）的无菌培养皿中，用眼科剪刀将脂肪剪成糊状，置于离心管中。
室温下离心（1200r/min）10min。
离心后可见离心管中液体分层：上层为白色泡沫，中层为清液，下层为黄色脂肪。
吸取上、中层丢弃。
加入3~5倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶和胰酶混合液（1∶1），将沉积于离心管底部的脂肪组织振荡打散，拧紧离心管后，用封口膜包裹，放入37℃恒温摇床中振荡（190r/min）消化30min。
将离心管自摇床中取出，肉眼观察可见无明显脂肪颗粒、白色泡沫贴壁，将液体用200目筛网过滤，滤液离心（1200r/ min）10min。
弃上清液，用PBS冲洗3遍，加入含有10％FBS的高糖DMEM培养基，轻轻吹打成细胞悬液，用细胞计数板计数，调整细胞密度1.0×105mL-1接种于培养瓶中，在5%CO2、37℃标准环境下培养。
