第 1 页 共 3 页 吸光光度法概述（一）
10.1.1吸光光度法概念 许多物质本身具有显然的色彩，例如，高锰酸钾溶液呈紫红色，硫酸铜溶液呈蓝色。有些物质本身无色或是浅色，但碰到某些试剂后，变成了有色物质，如淡黄色的Fe3+与SCN-反应生成血红色的协作物，淡绿色的Fe2+与邻二氮菲作用生成橙红色的协作物等。物质展现不同的色彩是因为物质对不同波长的光挑选性汲取的结果，而色彩的深浅是山于物质对光的汲取程度不同而引起的。基于物质对光的挑选性汲取而建立起来的分析办法称为吸光光度法。对于有色溶液来说，溶液色彩的深浅在一定条件下与溶液中有色物质的含量成正比关系。吸光光度法利用这一关系，通过分光光度计测得溶液中有色物质对光的汲取程度而对物质举行定性和定量分析。 与经典化学分析办法相比，吸光光度法的特点有： ①敏捷度高。吸光光度法适用于测定微量物质，被测组分的最低浓度为10-5～10-6mol/L。 ②精确
度高。吸光光度法的相对误差通常为2％～5％，常量组分的精确 度的确不如滴定分析法和分量分析法高，但对微量组分，化学分析法是无法举行的，而吸光光度法则彻低能满足要求。 ③操作简便。吸光光度法的仪器设备容易，操作简便。若采纳敏捷度高、挑选性好的显色剂，再采纳相宜的掩蔽剂消退于扰，有的样品可不经分别挺直测定。完成一个样品的测定普通只需要几分钟到十几分钟，有的甚至更短。
④应用范围广泛。几乎全部的无机离子和许多有机化合物均可挺直或间接地用吸光光度法测定。吸光光度法已经成为生产、科研、环境监测等部门的一种不行缺少的测试手段。 通常状况下，吸光光度法可以分为以下几种： ①可见吸光光度法。基于物质对420～760 nm可见光区的挑选性汲取而建立的分析办法，也称为可见分光光度法，是微量分析的简便而通用的办法。 ②红外吸光光度法。利用物质对0.78～1000um红外光区电磁辐射的挑选性汲取的特性来举行结构分析、定性分析和定量分析的一种分析办法，又称为红外汲取光谱法和红外分光光度法。 ③紫外吸光光度法。基干物质对紫外光挑选性汲取来举行分 第 2 页 共 3 页 析的办法，也称为紫外汲取光谱法和紫外分光光度法。 ④比色分析法。通过比较有色物质溶液色彩深浅来测定物质含量的分析办法。比色分析法有目视比色法和光电比色法。 10.1.2吸光光度分析法 10.1.2.1目视比色法 (1)目视比色法 目视比色法是指用眼睛观看比较溶液色彩的深浅，以确定物质含量的分析办法。常用的目视比色法是标准系列法，也叫标准色阶法。该办法用法一套由同种材料制成、大小外形相同的平底玻璃管，即奈氏比色管，在试验条件相同的状况下分离加入不同量的标准溶液和待测溶液，再加入等量的显色剂和其他试剂，稀释至一定刻度后从管口垂直向下观看，比较待测溶液与标准溶液色彩的深浅。当待测溶液与某标准溶液色彩全都时解释两者浓度相等，若介于两标准溶液之间，则取其算术平均值作为待测溶液的浓度。 目视比色法的仪器容易、操作简便、成本低廉。另外，因为是在白光下举行测定的，所以某些显色反应不符合朗伯-比尔定律时，仍可用该法举行测定。但此法的精确 度不高，主观误差较大。另外，标准系列不能久存，需要在测定时暂时配制。该办法可用于精确 度要求不高的半定量分析中，如土壤和植株中氮、磷、钾的速测等。 (2)吸光光度法 吸光光度法目前应用得十分广泛。吸光光度法是比较有色溶液对某一波长光的汲取状况，而目视比色法则是比较透过光的强度。例如，测定溶液中KMnO4的含量时，吸光光度法测量的是KMnO4溶液对黄绿色光的汲取状况，目视比色法则是比较KMnO4溶液透过红紫色光的强度。
第九章吸光光度法知识点
吸光光度法是基于分子对光的选择性吸收而建立的一种分析方法，包括比色法、紫外一可见吸光光度法、红外光谱法等。
1．吸光光度法的基本原理
①物质对光的选择性吸收：当光照射到物质上时，会产生反射、散射、吸收或透射。若被照射的物质为溶液，光的散射可以忽略。当一束白光照射某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过，溶液的颜色由透射光的波长所决定。吸收光与透射光互为补色光(它们混合在一起可组成白光)。
分子与原子、离子一样，都具有不连续的量子化能级，在一般情况下分子处于最低能态(基态)。当入射光照射物质时，分子会选择性地吸收某些频率的光子的能量，由基态跃迁到激发态(较高能级)，其能级差E激发态一E基态与选择性吸收的光子能量hv的关系为
Hv=E激发态一E基态
分子运动包括分子的转动、分子的振动和电子的运动。
分子转动、振动能级间隔一般小于1 eV，其光谱处于红外和远红外区。
电子能级间的能量差一般为1～20 eV，由电子能级跃迁而产生的吸收光谱位于紫外及可见光区，其实验方法为比色法和可见-紫外吸光光度法。
②吸收曲线：以波长为横坐标，以吸收光的强度为纵坐标绘制的曲线，称为吸收光谱图，也称吸收曲线。它能清楚地描述物质对不同波长的光的吸收情况。
③光的吸收定律——朗伯一比尔定律：当一束平行单色光垂直通过一厚度为b、非散射的均匀吸光物质溶液时，吸光物质吸收光能，致使透射光强度减弱。
若用I。表示入射光强度，It表示透射光强度，I。与It之比称为透光率或透光度T，T=I。/It，吸光物质对光的吸收程度，还常用吸光度A表示，A=lgT=log I。/It。
实验证明，当一束平行单色光垂直照射某一均匀的非散射吸光物质溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度c和液层厚度b的乘积成正比，此即朗伯一比尔定律，其数学表达式为
A=lgT=log I。/It =abc
简述吸光光度法测量条件
光度分析中，为使测得的吸光度有较高的灵敏度和准确度，还必须选择合适的测量条件。
1. 入射光波长的选择一般以λmax作为入射光波长。如有干扰，则根据干扰最小而吸光度尽可能大的原则选择入射光波长。
2. 参比溶液的选择
参比溶液主要是用来消除由于吸收皿壁及试剂或溶剂等对入射光的反射和吸收带来的误差。应视具体情况，分别选用纯溶剂空白、试剂空白、试液空白作参比溶液。
3.
吸光度读数范围的选择吸光光度分析所用的仪器为分光光度计，测量误差不仅与仪器质量有关，还与被测溶液的吸光度大小有关。由下式可计算在不同吸光度或透光度读数范围引起的浓度的相对误差。
若分光光度计的读数误差DT 为5%, 当 T = 65-20%，（或A
=0.19-0.70），则测量误差 。通常应控制溶液吸光度A在0.2-0.7之间，此范围是最适读数范围。通过调节溶液的浓度或比色皿的厚度可以将吸光度调节到最适范围内。当T%=36.8或A=0.434时，由于读数误差引起的浓度测量相对误差最小。
在吸光度法中，影响显色反应的主要因素有哪些？
⒈确定适宜的条件的原因：在可见光分光光度法的测定中，通常是将被测物与显色剂反应，使之生成有色物质，然后测其吸光度，进而求得被测物质的含量。
因此，显色条件的完全程度和吸光度的测量条件都会影响到测量结果的准确性。 为了使测定有较高的灵敏度和准确性，必须选择适宜的显色反应条件和仪器测量条件。
通常所研究的显色反应条件有显色温度和时间，显色剂用量，显色液酸度，干扰物质的影响因素及消除等，但主要是测量波长和参比溶液的选择。
对显色剂用量和测量波长的选择是该实验的内容。
⒉如何确定适宜的条件：条件试验的一般步骤为改变其中一个因素，暂时固定其他因素，显色后测量相应溶液吸光度，通过吸光度与变化因素的曲线来确定适宜的条件⒈确定适宜的条件的原因：在可见光分光光度法的测定中，通常是将被测物与显色剂反应，使之生成有色物质，然后测其吸光度，进而求得被测物质的含量。
荧光分光光度法与吸光光度法的异同
荧光分光光度法和吸光光度法都是基于物质对光的吸收或发射来进行分析的方法，但它们之间也存在一些区别。
1. 原理不同：吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收来进行分析的方法，而荧光分光光度法是基于物质被激发后发出荧光的特性来进行分析的方法。
2. 光源不同：吸光光度法通常使用可见光或紫外光作为光源，而荧光分光光度法需要使用能够激发荧光的光源，通常是紫外线或短波长的可见光。
3. 灵敏度不同：荧光分光光度法的灵敏度通常比吸光光度法高，因为荧光的强度与物质的浓度成正比，而且荧光信号比吸光信号更容易检测。
4. 应用范围不同：吸光光度法适用于测定溶液中物质的浓度、纯度等，而荧光分光光度法更适用于分析低浓度、微量的物质，如生物样本中的蛋白质、核酸等。
5. 干扰因素不同：吸光光度法容易受到其他物质的干扰，因为其他物质也可能吸收光源的能量。而荧光分光光度法的干扰相对较小，因为只有被激发的物质会发出荧光。
6. 仪器设备不同：荧光分光光度法需要特殊的荧光分光光度计，而吸光光度法则通常使用普通的分光光度计。
总之，荧光分光光度法和吸光光度法在原理、光源、灵敏度、应用范围、干扰因素和仪器设备等方面都存在一定的差异。选择哪种方法取决于分析的具体需求和样品的特性。
