第10章吸光光度法基本内容1概述1.1吸光光度法的特点吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法,包括比色法,可见紫外吸光光度法和红外光谱法等。
1.1.1.光的基本性质：光是一种电磁波。
具有同一波长的光称为单色光，由不同波长组成的光称为复合光。
波长在200nm～400nm范围的光称为紫外光，人的眼睛能感到波长在400nm～750nm范围的光叫可见光。
白光是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种单色光按一定强度比例混合而成的。
实验证明：将适当的两种单色光按一定强度比例混合，也可得到白光，这两种单色光互称为互补色光。
1.1.2.物质对光的选择性吸收：溶液呈不同的颜色是由于溶液中的吸光质点选择性吸收了某种颜色的光所引起的。
当白光通过某一均匀的溶液时，若该溶液对可见光波段的光都不吸收，则溶液无色透明；若溶液对不同波长的光全部吸收，则溶液呈黑色；若溶液对各种波长的光呈选择性吸收，则溶液呈现的是与吸收光成互补色光的颜色。
如硫酸铜溶液呈蓝色是因为溶液吸收了白光中的黄色光，高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿光而呈紫色等。
1.1.3.光吸收曲线：任何一种溶液对不同波长的光的吸收程度不同，若将各种波长的单色光依次通过某一浓度的溶液，测量每一波长下溶液对光的吸收程度，以波长λ为横坐标，吸光度A为纵坐标绘画，所得曲线叫光吸收曲线。
由光吸收曲线可知：溶液对各种波长的单色光的吸收程度是不同的，在某一波长处有一最大吸收，这一波长称为最λ表示；不同浓度的同一种物质的溶液，光吸收曲线的形状相似，最大吸收波长，用max大吸收波长不变，只是相应的吸光度大小不同。
1.2光吸收的基本定律当一束平行的单色光通过含有吸光物质的溶液时，溶液的吸光度A与吸光物质的浓度c及液层厚度b成正比，即A=Kbc此式就是光吸收定律的数学表达式，也叫朗伯—比尔定律，K 为比例常数。
当溶液的浓度用物质的量浓度(mol·L -1)，吸收层厚度用cm 为单位时，则比例常数用ε表示，称为摩尔吸光系数，其单位为L·mol -1·cm -1。
ε反映了吸光物质对光的吸收能力，也反映了用吸光光度法测定吸光物质的灵敏度，是选择显色反应的重要依据。
朗伯—比尔定律常用的表达形式为εbc A =。
透光率为：t 0I I T =，吸光度与透光率的关系为：T1lg A =。
光度分析的灵敏度不但用摩尔吸光系数ε来表示，而且还常用桑德尔指数s 来表示。
它是仪器的检测限A=0.001时，在单位截面积液柱内能检测出物质的最低含量，单位为μg·cm -2。
桑德尔指数s 与摩尔吸光系数ε的关系为εM s =，式中M 为吸光物质的摩尔质量。
1.3比色法和吸光光度法及其仪器1.3.1.目视比色法：目视比色法是用眼晴观察比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。
此法是比较透过光强，优点是仪器简单，操作方便，可在白光下进行；缺点是准确度不高，标准系列不能久存，需要在测定时临时配制。
1.3.2.吸光光度法：吸光光度法是借助分光光度计来测定被测物质的吸光度，因其采用入射光为纯度较高的单色光，故准确度较高。
如果用滤光片产生的纯度较差的单色光来测定的方法叫光电比色法。
1.3.3.分光光度计及其基本部件：分光光度计型号虽然繁多，但其主要部件基本是相同的，有光源、单色器、吸收池、检测系统和信息显示系统五部分组成。
a.光源：紫外光区用氢灯或氘灯，发射185nm～400nm 的连续光谱；可见光区用钨灯，发射360nm～800nm 的连续光谱。
b.单色器：棱镜是根据光的折射原理而将复合光色散为不同波长的单色光。
光栅是根据光的衍射干涉原理将复合光色散为不同波长的单色光。
c.比色皿：比色皿也叫吸收池,主要是由无色透明的光学玻璃或石英制成。
d.检测器：检测器是一类光电转换元件，它将所接收到的光信息转变成电信息。
常用的有光电池、光电管和光电倍增管。
e.显示装置：显示装置的作用是放大电信号，并以吸收光度A 或透光率T 的方式显示或纪录下来。
2光度分析法的设计2.1显色反应测定某物质时，如果待测物质本身有较深的颜色，就可以进行直接测定，但大多数待测物质是无色或具有很浅的颜色，故需要选择适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定。
此反应称显色反应，所用的试剂称为显色剂。
2.1.1.显色反应的选择：按显色反应的类型来分，主要有氧化还原反应和络合反应两大类，而络合反应是最主要的。
对显色反应一般考虑以下因素：a.选择性好、干扰少、灵敏度高。
b.有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。
c.有色化合物的化学性质应足够稳定。
∆要大于60nm。
d.有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，一般对比度λ2.1.2.显色剂：显色剂有无机显色剂和有机显色剂。
由于无机显色剂生成的络合物不够稳定，灵敏度和选择也不够高，故在光度分析中应用较多的是有机显色剂。
2.1.3.多元络合物：多元络合物是由三种或三种以上的组分所形成的络合物。
目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元络合物。
三元络合物的几种重要类型如下：a.三元混配络合物；b.离子缔合物；c.金属离子—络合剂—表面活性剂体系；d.杂多酸。
2.2显色条件的选择2.2.1.溶液的酸度：酸度对显色反应的影响是多方面的：a.影响显色剂的平衡浓度和颜色；b.影响被测金属离子的存在状态；c.影响络合物的组成。
2.2.2.显色剂的用量：从化学平衡的角度来看，一般需要加入过量的显色剂，但加入太多会引起副反应，对测定不利。
故通常根据实验结果来确定显色剂的用量。
2.2.3.显色反应时间：由于反应速率不同，完成显色反应的时间也不同，因此应根据具体反应掌握适当的显色时间，在颜色稳定的时间范围内进行测定。
2.2.4.显色反应温度：通常显色反应大多是在室温下进行的。
但是不同的显色反应对温度有不同的要求。
因此，对于不同的显色反应，也需要通过实验的方法来确定适宜的显色反应温度。
2.2.5.溶剂的影响：有机溶剂常会降低有色化合物的离解度，提高显色反应的灵敏度，有机溶剂有时还会提高显色反应的速率，影响有色化合物的组成。
2.2.6.干扰及其消除方法：a.控制溶液酸度；b.加入掩蔽剂；c.利用氧化还原反应，改变干扰离子存在的价态；d.利用校正系数；e.利用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰；f.选择适当波长；g.当溶液中存在有耗显色剂的干扰离子时，可以通过增加显色剂的用量来消除干扰；h.分离。
2.3测量波长和吸光度范围的选择2.3.1.测量波长的选择：为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光，即“最大吸收原则”。
但是，如果在最大吸收波长处有共存组分的干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射波长，即“吸收最大，干扰最小”的原则。
2.3.2.吸光度范围的选择：从仪器测量误差的角度来看，为了使测量结果得到较高的准确度，一般应该把吸光度通过溶液的浓度或选择不同厚度的吸收池，控制吸光度A 在0.2～0.8的范围内。
2.4参比溶液的选择在进行光度测量时，利用参比溶液来调节仪器的零点，可以消除由于吸收池壁及溶液对入射光的反射和吸收带来的误差，并扣除干扰的影响。
选择的原则为：1.当试液及显色剂均无色时，可用纯溶剂作参比溶液。
2.显色剂无色，而被测试液中存在其他有色离子，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。
3.显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。
4.显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，把被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按测定步骤正常加入，以此溶液作参比溶液。
5.有时改变加入试剂的顺序，也可使被测组分不发生显色反应，故以此溶液作为参比溶液也可消除干扰。
2.5标准曲线的制作吸光度与吸光物质的含量成正比，这是吸光光度法进行定量的基础，标准曲线就是根据这一原理制作的。
在实际工作中，有时标准曲线不通过原点，造成这种情况的原因比较复杂，应针对具体情况进行分析，找出原因，加以避免。
3光度分析法的误差吸光光度法的误差主要来自两方面：一是偏离朗伯—比尔定律；二是吸光度测量引起的误差。
3.1对朗伯—比尔定律的偏离偏离朗伯—比尔定律的原因主要是仪器或溶液的实际条件与朗伯—比尔定律所要求的理想条件不一致所引起的。
主要有以下几个方面：1.非单色光引起的偏离。
2.介质不均匀引起的偏离。
3.溶液本身的化学反应引起的偏离：a.解离，b.络合，c.缔合。
3.2吸光度测量的误差在光度计中，透光率的标尺刻度是均匀的，因此光度计的透光率读数误差基本上为一定值。
但吸光度与透光率为负对数关系，故它的标尺刻度是不均匀的。
因此吸光度的读数误差ΔA 也是不均匀的。
根据朗伯—比尔定律：εbc A =，则εbdc dA =，可得T ΔT A ΔA c Δc ≠=，经推导得光度测量的相对误差公式为：TlgT 0.434Δ.c Δc =，由此式可知：cΔc 为浓度测量的相对误差，它不仅与光度计的透光率的读数误差ΔA 有关，而且还与溶液的透光率T 有关。
当36.8T%=或A=0.434时，c Δc 为最小。
所以为了使浓度测量的相对误差较小，通常控制：透光率为T%=15～65，即吸光度为A=0.8～0.2。
4其他吸光光度法和光度分析法的应用4.1示差吸光光度法4.1.1.示差吸光光度法的原理：吸光光度法一般只适用于微量组分的测定，当待测定组分浓度过高或过低时，由于吸光度超出了准确测量的读数范围，所以会产生较大的测量误差，需要采用示差吸光光度法。
目前，主要有高浓度示差吸光光度法、低浓度示差吸光光度法和使用两个参比溶液的精密示差吸光光度法。
它们的基本原理相同，而且以高浓度示差吸光光度法应用最多，所以在此只讨论高浓度示差吸光光度法。
高浓度示差吸光光度法与普通吸光光度法的主要区别在于它所采用的参比溶液不同。
在高浓度示差吸光光度法中，提高了入射光的强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液，使ΔA =0.2～0.8。
根据x x εbc A =和00εbc A =两式相减得0x A A ΔA −==()0x c c εb −=εbΔc 。
由测量的ΔA 求出Δc ，再由0x c c Δc −=求出待测试液的浓度x c ，这就是高浓度示差吸光光度法的基本原理。
4.1.2.高浓度示差吸光光度法的误差：用高浓度示差吸光光度法测定浓度过高的溶液，其准确度比普通吸光光度法要高。
例如：用试剂空白作参比溶液，测得待测试液的透光率%7T x =；若采用示差吸光光度法，用按普通吸光光度法测得透光率为%10T 0=的标准溶液作参比溶液，即透光率标尺由10%调至100%处，标尺放大了10倍，测得的透光率就为70%。
故读数落在了测量误差较小的区域，从而提高了测定的准确度。
