紫外分光光度法测定未知样含量
(含方案、公式、标准误吸收光谱图)
1.仪器
1.1紫外可见分光光度计(T6型)；
1.2石英吸收池(1cm)：2只；
1.3比色管（50mL）10支；
1.4吸量管5mL：2支。
2.试剂
2.1苯甲酸标准溶液(0.1mg/mL)；
2.2未知液：浓度约为40～60ug/mL。
3.实验操作
3.1吸收曲线的绘制
3.1.1标准苯甲酸吸收曲线绘制
在一支50mL比色管中由2.1配制成浓度为0～10ug/mL范围内的溶液，以水定容，并摇匀。于波长200～350nm范围内每间隔10nm测定一次吸光度，在最大吸收波长附近间隔5 nm测定一次测定吸光度，再次根据最大吸收波长，附近间隔1 nm测定一次吸光度，绘制吸收曲线，从曲线上确定苯甲酸的最大吸收波长（作为定量测定波长）。
附图：苯甲酸的吸收曲线。
3.1.2标准水杨酸吸收曲线绘制
在一支50mL比色管中由2.1配制成浓度为0～10ug/mL范围内的溶液，以水定容，并摇匀。于波长200～350nm范围内每间隔10nm测定一次吸光度，在最大吸收波长附近间隔5 nm测定一次吸光度，再次根据最大吸收波长附近，间隔1 nm测定一次吸光度，绘制吸收曲线，从曲线上确定水杨酸的最大吸收波长（作为定量测定波长）。
附图：水杨酸吸收曲线。
3.1.3未知液吸收曲线的绘制
准确吸取含苯甲酸的未知液若干体积（5mL）于一支50mL比色管中，以水定容并摇匀。以蒸馏水为参比，于波长200～350nm范围内每间隔10nm测定一次吸光度，在最大吸收波长附近间隔5 nm测定一次吸光度，再次根据最大吸收波长，附近间隔1 nm测定一次吸光度，绘制吸收曲线。（观察3.1.1和3.1.2各自所得吸收曲线有什么相同之处？这说明了什么问题？对于一个未知样品如何利用分光光度法进行定性？）附图：未知液的吸收曲线。
3.2吸收池配套性检查
石英吸收池装蒸馏水，于定量测定波长处，以一个吸收池为参比，测定并记录另一吸收池的吸光度（其偏差应小于0.5%，可配成一套使用，否则更换）作为校正值。
3.3校准曲线的绘制及未知样含量的测定
准确移取与未知样相同的物质的标准溶液若干体积于50mL比色管中，以水定容，制成一系列相同体积不同浓度的标准溶液（0～10ug/mL），在最大吸收波长处，以水为参比，测定各自吸光度。由实验数据计算回归方程及相关系数，以浓度（ρ/ ug·mL-1）为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标绘制校准曲线。
在相同条件下，测定样品稀释液（配制方法同3.1.2）的吸光度，代入回归方程计算出样品稀释液的浓度。试样平行测定三份。
4.结果计算
根据未知液的稀释倍数，求出未知溶液中水杨酸的含量。
【相关计算及公式】
1.校准曲线
由试验点经最小二乘法对试验数据进行回归计算，得出一元一次线性回归方程，并计算出该方程的相关系数。然后在坐标纸上画出该回归方程的直线。回归方程为：
;
/)()(;
/))((;
/)()(其中：2
2
22
2
2
∑∑∑∑∑∑∑∑∑∑-=
-=
-=--=-=
-=-==
+=n y y
y y L n y x xy y y x x L n x x x x L x b y a L L b bx
a y i
yy i i xy i xx xx
xy
2.相关系数
yy
xx xy L L L =
γ
3.相对标准偏差：按照未知稀释液的A 校正计算相对标准偏差RSD
%1001)(%1002
⨯--=⨯=
∑x
n x x
x
S
RSD i
4.未知稀释液含量：稀释后未知溶液中待测组分的浓度应由回归方程计算而得。
=-=-=
=b a
A b a y x 1111ρ =-=-==b a
A b a y x 222
2ρ =-=-==b a
A b a y x 333
3ρ 则：=++=
=3
3
21x x x x ρ 5.未知溶液中待测组分的含量：根据未知液的稀释倍数，可求出未知溶液中待测组分的含量。
附图1 维生素C吸收曲线
附图2 苯甲酸吸收曲线
附图3 水杨酸吸收曲线
