(54)发明名称
HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒
(57)摘要
本发明公开了一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法。该检测方法是根据GenBank公布的HIV病毒序列的保守区域设计HIV RT-LAMP-LFD反应系统所需引物与探针;采用本发明人配制的RNA提取试剂提取HIV病毒RNA，使用本发明建立的RT-LAMP反应体系进行检测，依据反应体系加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果。同现在HIV病毒的常用检测技术相比，本发明有助于实现早期诊断，避免漏检，有助于提高检测的灵敏性、缩短检测时间，是HIV诊断方法持续发展的主要方向。
1.一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法，其特征在于包括如下步骤:
（HIV病毒）RNA的提取:
(1)取20-35mg含有HIV病毒的血液组织，加入300-500u L裂解液匀浆，离心;
(2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻
璃纤维素膜结合;
(3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜;
(4)用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA;
(5)配制预反应液，所述预反应液体积为15-20u L，包括:1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20u mol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L. pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV,5-15U BstDNA聚合酶大片段引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE 序列见SEQ ID N0 :5
(6)在16-25 u L预反应液中加入4-10 u L步骤（4）所得RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25u L然后在温度为60-65°C，反应15-65min；
LFD试纸检测:
(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在
点样处前端滴上60-100 uL缓冲液，5-20分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。
2.根据权利要求1所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L的pH7.3-7. 6的Tris-HCl，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol /L.EDTA.
3.根据权利要求1所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7. 6 Tri s-HCl，浓度为0. 4-0. 6mol /L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%的无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针MIV-FITC-PROBE为5'端FITC标记探针:
6. 一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括RT- LAMP扩增反应液，16-20u L的RT- LAMP扩增反应液包括:1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20u mol /L探针
HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L. pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV,5-15U BstDNA聚合酶大片段，其余为RNase firee water.
引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5
7.根据权利要求6所述的HIV RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于: 引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5
8.根据权利要求6所述的HIV RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于:HIV病毒LAMP-LFD 检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1xTAE缓冲液，阳性对照样品为HIV基因组病毒RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase firee water
HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒
技术领域
[000l] 本发明涉及哺乳动物病毒检测领域，特别涉及一种人体HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒。
背景技术
[0002]HIV即人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV），顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）
[0003]研究表明，人类免疫缺陷病毒直径约120纳米，大致呈球形。病毒外膜是类脂包膜，来自宿主细胞，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41；gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成的球形基质（Matrix），以及蛋白p24形成的半锥形衣壳（Capsid），衣壳在电镜下呈高电子密度。衣壳内含有病毒的RNA基因组、酶（逆转录酶、整合酶、蛋白酶）以及其他来自宿主细胞的成分。其序列已测定并在GenBank 上登录(登录号分别为AY222839, AY222840)。目前该病毒的检测方法有电镜法、RT-PCR检测法、TAS-FLTSA检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题:一是灵敏度小，无法检测到潜伏感毒样品;二是容易产生假阳性，对模板质量要求高;三是操作繁琐，对实验条件要求高。
[0004] RT-LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶和AMV逆转录酶的同时作用下，使RT和LAMP反应在同管中同时进行，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。
[0005]侧向流层析试纸(lateral flow dipstick, LFD)是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题.LFD检测相对于其他检测手段，有操作简便且安全的特点。LAMP-LFD反应结果可以直接肉眼观察。LFD试纸上有质控带
和检测带，两条带都显色表示阳性，只有质控带而检测带未显色表明检测结果为阴性。该方法具有安个、快捷、高效、高灵敏度且无高的实验条件要求，适合应用推广。目
前，该技术在艾滋病病毒(HIV)的检测中未见报道。
发明内容
[0006]本发明的目的在于是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱侧向层析试纸
来检测艾滋病病毒(HIV)的方法，特异性强，敏感率高。
[0007]本发明另一目的在于提供一种用于上述方法的检测试剂盒，该试剂盒特异性强，
敏感率高，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在检查中直接应用的问题，适合艾滋病病毒(HIV)的筛查与预防。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种艾滋病病毒(HIV)RT-LAMP-LFD检测方法，包括如下步骤:
病毒RNA的提取:
(1)取20-35mg含有HIV病毒的血液组织，加入300-500裂解液匀浆，离心;
(2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻
璃纤维素膜结合;
(3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜;
(4)用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA;
所述预反应液体积为15-20u L，包括:1.5-2.0mmol /L引
物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20u mol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L. pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV,5-15U BstDNA聚合酶大片段引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE 序列见SEQ ID N0 :5
(6)在16-25 u L预反应液中加入4-10 u L步骤（4）所得RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25u L然后在温度为60-65°C，反应15-65min；
LFD试纸检测:
(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在
点样处前端滴上60-100 uL缓冲液，5-20分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。[0009]本发明的检测方法是根据GenHank公布的艾滋病病毒(HIV)序列的保守区域设计了HIV病毒RT-LAMP-LFD反应系统所需引物与探针;病毒RNA提取病毒RNA，使用本发明建立的RT-LAMP-LFD反应体系进行检测，依据反应体系中加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果，结果显示在61℃30min, HIV病毒RNA获得了高效特异性扩增。同现在HIV病毒的常用检测技术相比，本发明有助于实现早期诊断，避免漏检，有助于提高检测的灵敏性、缩短检测时间，是HIV诊断方法持续发展的主要方向。[0010]作为优选，所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L的pH7.3-7. 6的Tris-HCl，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol /L.EDTA.
[0011]作为优选，所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7. 6 Tri s-HCl，浓度为0. 4-0. 6mol /L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%的无水乙醇。
[0012]作为优选，所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。
[0013]作为优选，引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针HIV-FTIC-PROBE为5'
端FTIC标记探针。
[0014]一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括RT- LAMP扩增反应液，16-20u L的RT- LAMP扩增反应液包括:1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20u mol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L. pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV,5-15U BstDNA聚合酶大片段，其余为RNase firee watero 引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5
[0015]作为优选，引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针HIV-FTIC-PROBE为5'端FTIC 标记探针。
[0016]作为优选，HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1 x TAE缓冲液，阳性对照样品为HIV 病毒基因组RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase firee water
[0017]本发明的有益效果是:
1、本发明所采用引物组是根据HIV衣壳蛋白基因的六个不同区域设计的，又有RNA的特异性探针相结合，特异性比常规PCR强。
[0018] 2、本发明的检测试剂盒检测灵敏度高，是常规PCR的102-103倍。
[0019] 3、本发明的检测试剂盒检测时间短，可以在30-60min内获得检测结果，比常规PCR节约3.5-4.5小时。
[0020] 4、本发明的检测试剂盒对仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统。
[0021] 5、本发明中的病毒RNA提取方法简单快捷，而且不用到氯仿、巯基乙醇等有害物质。
[0022] 6、本发明的检测试剂盒操作步骤简单，结果直观易判定。
[0023] 7、本发明的检测试剂盒对人和环境较安，整个过程不使用有毒物质。
[0024] 附图说明
[0025] 图1为扩增温度对RT-LAMP反应的影响图。M:100bp DNA Ladder Marker(TaKaRa 公司);泳道1:61℃恒温条件下扩增结果;泳道2 :63℃温度条件下扩增结果;泳道3:65℃温度条件下扩增结果。
[0026] 图2为MrNV RT-LAMP特异性实验结果。M:l00bp DNA Ladder Marker(TaKaRa 公.d);泳道1:罗氏沼虾野田村病毒;泳道2:南美白对虾白斑综合症病毒（WSSV);泳道3:
草鱼呼肠孤病毒（GORV};泳道4:对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV};泳道5:对虾桃拉病毒(TSV);泳道6:阴性对照。
[0027] 图3为本发明的检测方法检测感染MrNV样品实验结果图。M :100bp DNA ladder Marker(TaKaRa公司);左侧泳道1：MrNV样品RT-LAMP反应:30min。检测结果;左侧泳道2:MrNV样品RT-LAMP反应45min检测结果;NT:为阴性对照样品检测结果:右侧为LFD 试纸检测显色结果。
[0028] 图4为本发明的检测方法检测MrNV的灵敏度比较图和LFD试纸显色对比图。M：100bp DNA ladder Marker(TaKaRa公司);左侧泳道1-6:模板分别为10-1,10-2,10-3,10-4,105,106倍稀释的基因组RNA;泳道7:无模板;右侧1-7:为左侧实验结果的LFD试纸检测图。
具体实施方式
[0029] 下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。[0030] 本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0031]本发明实施如下:
一种艾滋病病毒HIV-RT-LAMP-LFD检测方法，包括如下步骤:病毒RNA的提取:
(1) 取20-35mg含有HIV病毒的血液组织，加入300-500u L裂解液匀浆，离心; (12000rpm离心1-2min)
[0032] 所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L的pH7.3-7. 6的Tris-HCl，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol /L.EDTA.其余为RNase free water。
[0033] (2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液
与玻璃纤维素膜结合;将混合液与玻璃纤维素膜结合具体操作为:将混合液转入带有玻璃
纤维素膜的吸附柱中，12000rpm离心1-2min,弃掉废液，这样混合液与玻璃纤维素膜就结合。
[0034] （3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜。
[0035] 去蛋白液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为:向吸附柱中加入400-600 u L去蛋白液，室温静1-2min,12000rpm离心30-60s，弃掉废液。
[0036] 所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7. 6 Tri s-HCl，浓度为0. 4-0. 6mol /L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%的无水乙醇。
[0037] 漂洗液洗涤玻璃纤维素膜具体操作为:向吸附柱中加入400-600 u L漂洗液，12000rpm离心30-60s，弃掉废液，重复该步骤一次。
[0038] 所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。
[0039] (4)用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA，具体操作为:在吸附柱
中加入30-50u L RNase free water(市售)，室温放置1-2min,12000rpm离心1-2min重复该步骤一次，增加RNA洗脱量。
[0040] RT- LAMP扩增反应:
(5)配制预反应液，所述预反应液体积为15-20u L，包括:1.5-2.0mmol /L引
物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20u mol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L. pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV,5-15U BstDNA聚合酶大片段
[0041] 引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE 序列见SEQ ID N0 :5
[0042] HIV-RT-LAMP引物、探针设计与筛选
本发明所述的引物是根据GenBank公布的RNA2序列，由在线软件PrimerExplorer
V4 (http: primerexplorer.jp/e/)设计和手工修改后获得，利用不同引物的反应结果进行筛选，由其中选出两对引物和一条探针。
[0043]引物HIV-F3（SEQ ID N0:3):GATACAACAACTATTCCA TTGATTG
[0044]引物HIV-B3（SEQ ID N0:4)TGTAGGATTAA TTTGTGGCATG
[0045]引物HIV-FIP（SEQ ID NO :1):
GCAAGAGGTAAAATACACCCTGTT-TACTATACTGGTCAAGATAAAGAGA [0046]引物HIV-BIP（SEQ ID NO :2):
AGTGGTGAAGCCATTACAAA TGA-GAAAA TCCACAGACCCAATC
[0047]探针HIV-FITC-PROBE (SEQ ID N0 :5):
CTCTTGCAAGTGACTACACTACTTAA
[0048]其中HIV-FIP为5'端生物素(biotin)标记引物;HIV-FITC-PROBE为5'端FITC
标记探针。
[0049] (6)在16-25 u L预反应液中加入4-10 u L步骤（4）所得RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25u L然后在温度为60-65°C，反应15-65min；
[0050] LFD试纸检测:
(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上60-100 uL缓冲液，5-20分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。当仅出现质控带时表明反应结果为阴性，当质控带和检测带同时出现时，表明
反应结果为阳性。
[0051] 一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括RT- LAMP扩增反应液，16-20u L的RT- LAMP扩增反应液包括: 1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20u mol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L. pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV,5-15U BstDNA聚合酶大片段，其余为RNase firee water.
[0052] 引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5
[0053] RT- LAMP扩增反应液装于RT-LAMP核酸反应管中，RT-LAMP核酸反应管中添加有稳定液，稳定液为液体石蜡油。稳定液滴加在RT-LAMP核酸反应管中，用于液封，稳定液用量在5-10 u L。
[0054] 检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD 试纸用的缓冲液为1x TAE缓冲液，阳性对照样品为HIV病毒基因组RNA,阴性对照样品为无核酸的RNase free water
[0055]本发明的上述方案在其范围内都是可以实施的，以下以一个典型实施方案来具体
说明本发明的具体操作步骤。
[0056]典型实施方案:
1、材料
被感染的人体HIV病毒细胞采集自宁波第一医院;所用引物与探针由上海生工生物公司合成;Bst DNA聚合酶大片段购自New England BIPolabs公司:;逆转录酶AMV, dNTP购自takara公司;甜菜碱、硫酸镁等购自sigma公司。
[0057] 2、罗氏沼虾样品病毒RNA的提取:
(1）取20mg被感染的人体HIV病毒细胞组织，加入500 u L裂解液后用一次性研磨棒研磨，等彻底匀浆后,12000rpm离心2min，吸取上清液至新的离心管;
(2）向装有上清液的新的离心管中加入等体积(与上清液等体积)的70%无水乙醇后，混合均匀;
（3）将混合液体转入带有玻璃纤维素膜的吸附柱中，吸附柱置于收集管中，12000rpm 离心l min，弃掉废液;
（4）向吸附柱中加入550 u L去蛋白液，室温静置1min,12000rpm离心30s，弃掉废液;
（5）加入600 u L漂洗液,12000rpm离心30s，弃掉废液;重复该步骤一次。
[0058]（6）将吸附柱置于新的无RNase的离心管中，在吸附柱中加入50 u L RNase free water，室温放置1min,12000rpm离心lmin。使用第一次的洗脱液重复该步骤一次，增加RNA 洗脱量。
[0059]（7）取5 u L RNA洗脱液进行10-1一10-7的逐步梯度稀释，-80℃保存备用。[0060] 3、HIV病毒RT-LAMP恒温扩增:
(1)根据待检样品数，配制相应倍数的核酸检测的预反应液:
1.5mmol/L引物HIV-FIP, 1. 5mmol /L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/L 引物HIV-B3, 0.05u mol /L探针HIV-FITC-PROBE,14mmol/l, pH8.0-9.0的Tris-HCl，l0mmol/1氯化钾，13 mmol/L硫酸铵，6mmo1/L 硫酸镁，0.1% TritonX-100,0. 6mol /L甜菜碱，7.4mmol/L dNTP,1U逆转录酶AMV, 8U Bst DNA聚合酶大片段，其余为RNase free water每管检测预反应液体积为26 uL。
[0061] (2)分别吸取5u L小同浓度的待检样品RNA加入核酸检测反应管中，混合均匀。[0062] (3)标记清楚后，将检测反应管置于61℃水浴锅中，反应30min
[0063] 4、HIV病毒RT-LAMP扩增产物进行凝胶电泳:
(1)配置2%的琼脂糖凝胶，每个加样孔加入5uL的反应产物;
(2)电泳30分钟后凝胶成像，结果见图3和图4左侧图。
[0064] 5、RT-LAMP扩增产物的LFD试纸检测:
(1)取HIV病毒RT-LAMP扩增产物5u L,置于LFD试纸加样孔;
（2）在LFD试纸加样孔一端，滴加50uL缓冲液(1xTAE缓冲液)，待缓冲液移动基本结束，判断RT-LAMP-LFD检测结果，见图3与图4右侧图。
[0065]利用本发明所述的检测试剂盒和检测方法检测人体HIV病毒，经过凝胶电
泳，由图3左侧图可见阶梯状的扩增条带;再利用LFD检测试纸条检验扩增产物，由图3右侧图可见与电泳结果吻合。而图2特异性实验结果和图4灵敏度检测结果表明本检测方法具有较好的特异性和灵敏度。其中图1为筛选本体系最佳的反应温度，如图所示温度61℃较佳。
[0066]根据以上实验结果表明，HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒和检测方
法可以为艾滋病病毒HIV提供快速、简便、灵敏的现场检测。
[0067]以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的
限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
附件 水肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、 48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所 产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有0.1刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。 (四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。
HIV 实验室诊断
人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)及其相关标志的检测是预防 HIV 感染和艾滋病临床治疗中重要的环节，在艾滋病的防治工作中具有重要作用，如艾滋病的 诊断、HIV 感染的诊断、血源及器官供体的筛选、流行病学调查、艾滋病病人及 HIV 感染 者的病情动态观察、临床治疗疗效考核以及 HIV 疫苗的安全性和效果鉴定等。 HIV 感染标志分为病毒标志、免疫标志和相关标志三大类。病毒标志是指直接从 HIV 感染者体内分离出病毒或检出 HIV 组成成分(抗原或核酸)。免疫标志是指 HIV 感染所产生 的 HIV 抗原、抗体等免疫物质。相关标志是指 HIV 感染后与艾滋病病情进展有密切关系的 某些标志，如 CD4 细胞、CD8 细胞，β2 微球蛋白、有关细胞因子等。这些标志的测定可 为 HIV 感染及临床疗效的考核提供极为重要的诊断、治疗和预后指征。目前 HIV 抗体的检 测是艾滋病实验室检测中最常用的方法，因为 HIV 抗体是患者感染 HIV 后最容易检出并且 持续时间最长的免疫学标志，而且抗体的检测方法大多简便、经济，易于推广应用。 在介绍各种 HIV 实验室诊断方法之前，为了使实验室工作人员能够有效地确保结果准 确、可靠、优质，我们必须对作为一种感染因子的 HIV 以及由它所导致的致命性危害有基 本的认识。实验室工作人员应特别注意病毒的结构、抗原组成，人体的免疫反应，诊断试 验的基本原理、试验结果的解释，以及为了准确而有效地提供实验诊断所必需的质量保证 措施。如果由于缺乏技术专长或基本知识而造成不正确的试验结果是不可原谅的。现将有 关内容扼要介绍如下： 一、人类免疫缺陷病毒(HIV)概述 （一） 年份 1981 艾滋病病原体的发现和命名 事 由 命 名
美国首先在洛杉矶男性同性恋中发现 5 例以 往很罕见的卡氏肺囊虫肺炎和 26 例卡波济氏 肉瘤患者，这些病人均表现有严重的免疫缺 陷，但原因不明。
1982 年将这种新的疾病命名为 “获得性免疫缺陷综合征” Acquired Immuno Deficiency
Syndrome，AIDS，即艾滋病 淋巴结病相关病毒 Lym phadenopathy Associated
1983
从艾滋病流行学资料分析很可能是由病毒引 起的。 法国巴斯德研究所 Montagnier 等首先从 多发性淋巴结病综合症病人分离到一种新的 逆转录病毒
Virus，LAV
1984
美国国立癌症研究所 Robert Gallo 等报道从艾 滋病病人活检组织分离到一种新的逆转录病 毒与其以前发现的 HTLV-1 和 HTLV-Ⅱ不同。
人类嗜 T 淋巴细胞Ⅲ型病毒 Human T-cell Lymphatropic Virus
typeⅢ，HTLV-Ⅲ AIDS Related Virus， ARV
1984
美国加州大学分离出艾滋病相关病毒
大肠菌群及检验 、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而就是卫生细菌领域得用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指得就是具有某些特性得一组与粪便污染有关得细菌，这些细菌在生化及血清学方 面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37 C能分解乳糖产酸产气得革兰氏阴性 无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌与阴 沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便与自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动得场所以及有粪便污染得地方，人、畜粪便对外界环境得污染就是大肠菌群在自然界存在得主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其她型别较多。 大肠菌群就是作为粪便污染指标菌提出来得，主要就是以该菌群得检出情况来表示食品 中有否粪便污染。大肠菌群数得高低，表明了粪便污染得程度，也反映了对人体健康危害性得大小。粪便就是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者得粪便，所 以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染得可能性，潜伏着食物 中毒与流行病得威胁，必须瞧作对人体健康具有潜在得危险性。 大肠菌群就是评价食品卫生质量得重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生
工作中。 二、大肠菌群检验方法： 由于大肠菌群指得就是具有某些特性得一组与粪便污染有关得细菌，即:需氧及兼性厌氧、在37 C能分解乳糖产酸产气得革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群得检测一般都就是按照它得定义进行。 目前国内采用得进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准与原国家商检局制订得行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 (一)国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培 养与证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。 36 ± C培养48戈h,观察就是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36 ±1 C培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上得可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36 ±1 C 培养24±2h,观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性得管数，查MPN表，报告每100ml (g)大肠菌群得 MPN 值。
艾滋病（HIV）检测方法汇总 一、艾滋病简介 艾滋病日的概念来源于1988年，全球卫生部大臣关于艾滋病预防计划的高峰 会议上(W orld Summit of Ministers of Health on Programmes for AIDS Prevention)提 出的。从此，这个概念被全球各国政府、国际组织和慈善机构采纳。从此，这个概念被全球各国政府、国际组织和慈善机构采纳。自1981年世界第一例艾滋病病 毒感染者发现至今，短短20多年间，艾滋病在全球肆虐流行，已成为重大的公共 卫生问题和社会问题，引起世界卫生组织及各国政府的高度重视。为号召全世界人民行动起来，团结一致共同对抗艾滋病，1988年1月，世界卫生组织在伦敦召开 了一个有100多个国家参加的“全球预防艾滋病”部长级高级会议，会上宣布每年的12月1日为“世界艾滋病日” (World Aids Day) ;1996年1月，联合国艾滋病规划署(UNAIDS)在日内瓦成立;1997年联合国艾滋病规划署将“世界艾滋病日”更名为“世 界艾滋病防治宣传运动”，使艾滋病防治宣传贯穿全年。 二、艾滋病（HIV）检测方法 (一)抗体检测 主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光试验(IFA)。ELISA用去污剂裂解HIV或感染细胞液提取物作抗原，IFA用感染细胞涂片作抗原进行抗体检测，如果 发现阳性标本应重复一次。为防止假阳性，可做Westernblot(WB，蛋白印迹法)进 一步确证。 WB法是用聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV蛋白进行分离，再经传移电泳将不同 蛋白条带转移于硝酸纤维膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶标抗体染色，就能测出针对不同结构蛋白抗体，如抗gp120、gp41、P24抗体，特异性较高。 快速检测法，也称为金标法，也是抗体检测的一种方法，根据免疫层析法的原理，用于HIV抗体检测的定性检测。 (二)抗原检测 用ELISA检测P24抗原,在HIV感染早期尚未出现抗体时,血中就有该抗原存在.由于P24量太少,阳性率通常较低。现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原， 来提高敏感性。
附件1 全国艾滋病检测技术规范 National Guideline for Detection of HIV/AIDS （2015年修订版） 中国疾病预防控制中心 二○一五年十二月
全国艾滋病检测技术规范National Guideline for Detection of HIV/AIDS （2015年修订版） 中国疾病预防控制中心 二○一五年十二月
前言 艾滋病在我国的流行已数十年，随着感染者和临床病人的不断增加、感染人群的变化，艾滋病检测工作量逐渐加大，对监测和检测的需求也不断增加，承担艾滋病检测的实验室已遍及全国各级医疗、疾病预防控制、采供血、妇幼保健机构，出入境检验检疫、军队等各个系统。为了尽早发现HIV感染者和艾滋病病人，及早提供咨询、治疗，同时为适应基层艾滋病检测工作需求，在新的形势下，根据《关于艾滋病抗病毒治疗管理工作的意见》、《中国预防与控制艾滋病中长期规划（1998—2010年）》、《中国遏制与防治艾滋病十二五行动计划的通知（国办发[2012]4号）》、“四免一关怀”等国家艾滋病防治重要方针政策和十三五防治工作重点，在广泛征求各省、市疾病预防控制机构和医疗机构意见的基础上，在中华人民共和国卫生和计划生育委员会艾滋病专家及省级专家的参与下，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心对《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》进行修改、增补和完善，制定出《全国艾滋病检测技术规范（2015年版）》（以下简称《规范》），使其既能满足目前艾滋病检测工作的实际需求，又能体现检测技术的发展。 本次《规范》修订工作立足于我国目前检测状况，结合发达国家使用的指南，主要对以下几个方面内容进行了修改、增补和完善：（1）完善了不同的检测策略，并将其整合为独立的一章；（2）增加了HIV-1新
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法： 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
HIV抗体检测标准操作规程（SOP文件） 1、目的： 为了规范本卫生院艾滋病检测点的正常运行，保证艾滋病抗体检测的准确，确保实验室生物安全，特制定本操作规程。 2、适用范围： 适用于本卫生院艾滋病抗体检测从标本的采集、处理、检测到报告的全过程。 3、职责： 各检测工作人员按标准操作规程进行艾滋病抗体检测，本院艾滋病检测工作领导小组负责对检测活动全过程及各项生物安全措施执行情况进行监督。 4、标准操作程序： 4.1样品的采集和处理 4.1.1样品的采集： 4.1.1.1血清样品采集：用真空采血管抽取5mL静脉血，室温下自然放置1-2小时，待血清凝固和血块收缩后在用4000rmp离心15min，吸出血清备用。 4.1.1.2抗凝血样品采集：用加有抗凝剂的真空管或用消毒注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管，反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。 4.1.1.3采样注意事项： 4.1.1.3.1采集样品应按临床采血技术规范及试剂盒说明书要求进行。 4.1.1.3.2采集标本时应注意安全，直接接触HIV感染者或艾滋病病人血液和体液的操作应戴双层手套。 4.1.2样品的保存： 用于抗体检测的血清或血浆样品应存放与-20℃以下，短期（1周）内进行检测的样品可存放于2-8℃。 4.1.3样品的运送： 4.1.3.1实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类、采样时间。
4.1.3.2将试管放入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒。在试管的周围垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。 4.1.4样品的接收： 4.1.4.1含有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备的实验室内由经过培训的工作人员打开，用后的包裹应进行消毒。 4.1.4.2核对标本与送检单，检查样品管有无破损及遗漏。如发现遗漏应立即将尚存留的样品移出、对样品管和盛器消毒，同时还要报告有关领导和专家。 4.2检验方法和步骤 4.2.2快速检测法（胶体金法） 4.2.2.1原理 采用胶体金免疫技术和层析原理，定性测定血清样本中的HIV1+2抗体。 4.2.2.2操作步骤 4.2.2.2.1将标本平衡至室温。 4.2.2.2.2将所需数量的测试卡从包装盒中拿出平衡至室温，打开铝箔包装袋，平置于台面上并编号（与样本编号相对应）。 4.2.2.2.3用微量加样器取试剂说明书规定的样本血清或血浆，加到测试卡的加样处。 4.2.2.2.4在试剂说明书规定的时间内观察结果。 4.2.2.3结果判定： 4.2.2.3.1阳性：在检测区和对照区位置出现两条紫红色条带。如果检测区的条带隐约可见，建议对该样本重复试验，并使用其他厂家的试剂确认。 4.2.2.3.2阴性：只在对照区出现一条紫红色条带。 4.2.2.3.3无效：对照区未出现紫红色条带。 4.2.2.3.4注意：在规定的时间内不论测试区内的色带颜色深浅与否均应判为阳性。 4.3仪器的使用和维护 4.3.1设立常用仪器的维护制度，以保证正常运转；根据使用情况更换必要的部件： 4.3.2冰箱 定期检查温度并作好记录，必须每天检查和记录冷冻和冷藏室的温度。 4.3.3定期检查其他仪器设备。 4.4 HIV抗体筛查结果的记录、解释与报告 4.4.1筛查试验呈阴性反应出具HIV抗体阴性报告。 4.4.2筛查试验呈阳性反应，可出具“HIV抗体待复检”报告，不能出阳性报告。同时应尽快进行以下处理： 4.4.2.1填写HIV抗体筛查报告，经检测者、复核者和签发者审核签字。 4.4.2.2尽可能重新采集受检者的血样。
大肠杆菌及菌落总数检测方法 为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。 下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。 一、大肠杆菌： 1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例） 双料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。 单料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。 2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。
4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后与25g样品混合均匀。（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合） B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。 C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。 D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。 E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。 F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。 G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml吸管取样品液体分别注入双料试管中 H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。 I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。 J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。 二、菌落总数的测定 1、取平板计数琼脂23.5g与100ml灭菌后的蒸馏水混合均
艾滋病检测方法有什么 艾滋病这种传染病一般是通过血液啊，母乳啊或者是性传播的方式传染来的，得了这种疾病的患者一般是治愈率还是比较低的，那么我们从生活中是否也对这方面的疾病有所了解呢，多了解一些关于艾滋病的知识可以更好的进行了解，也可以减少疾病的发生，而艾滋病检测方法有什么呢，很多人都不知道，我们来了解一下啊。 一、酶联免疫吸附试验（ELISA） 目前应用的ELISA法有8种之多。它们的特异性和敏
感性超过99%。 二、颗粒凝集法（PA） PA为快速、简便的一种筛选方法。如属阳性，应经WB 证实。PA不需任何特殊仪器，其结果用肉眼可判别。全过程仅需5分钟。缺点有假阳性，且价格昂贵。 三、快速试剂
(一)人类免疫缺陷病毒(HIV)1+2型抗体诊断试剂(胶体硒法) 雅培人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂(胶体硒法)是用于体外，肉眼观察，定性的免疫分析，检测血清或血浆中的HIV-1和HIV-2抗体，用于帮助受感染个体的HIV-1和HIV-2抗体。本品仅用于无偿献血员现场初筛及临床紧急情况的使用，本品检测阳性者，需进行进一步筛查确认。 (二)InstantCHEKTM-HIVl+2金标快速诊断试剂 InstantCHEKTM-HIV1+2是一种快速、简单、灵敏的检验方法，用以检测艾滋病病毒(HIV-1和HIV-2)的抗体。该方法
适用于初筛检测，凡由该试剂测定为阳性者，需用另一种方法检测如ELISA或用蛋白印记法确定。 四、HIV-抗体确认实验 免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验（LIATEK HIVⅢ）、放射免疫沉淀试验（RIPA）及免疫荧光试验（IFA）。国内常用的确认试验方法是WB。 (一_免疫印迹实验(westernblot，WB)是广泛用于许多传染病诊断的实验方法，就HIV的病原学诊断而言，它是首选的用以确认HIV抗体的确认实验方法，WB的检测结果常常被作为鉴别其他检验方法优劣的“金标准”。
第二章 HIV抗体检测 1 范围 本章规定了HIV抗体的检测方法、检测程序、检测报告及检测策略，适用于各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、检验检疫机构、采供血机构及卫生保健机构。可作为对HIV感染者/AIDS 病人的诊断、报告和处理的实验室依据。 2 规范性引用文件 Revised recommendations for the selection and use of HIV antibody tests. WHO/UNAIDS Revised version 2001. 实验室生物安全通用要求（GB 19489-2004）。 3 HIV抗体检测实验室 应符合《全国艾滋病检测工作规范（1997年版）》中对检测实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。 应符合《实验室生物安全通用要求》（GB 19489-2004）对II级生物安全实验室（BSL-2）的各项要求。 实验室的质量保证按本规范第八章规定执行。 实验室安全防护按本规范第七章规定执行。 4 HIV抗体检测的目的和要点 4.1 HIV抗体检测的目的 4.1.1 HIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。 4.1.2 以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。 4.1.3 以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。 4.1.4 以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。 4.2 HIV抗体检测的要点 4.2.1 筛查试验阳性不能出阳性报告。 4.2.2 严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。 4.2.3 严格按照试剂盒说明书操作。 4.2.4 注意防止样品间交叉污染。
附件 水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释 度之水样所产生之结果，以「100 mL水中最大可能数（MPN/100 mL）」表示 100 mL水中存在之大肠杆菌群数目。 二、适用范围 本方法适用地面水体、地下水体、废水、污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验。 三、干扰 (一) 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质。 (二) 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质。 四、设备 (一) 量筒：100至1000 mL之量筒。 (二) 吸管：有刻度之10 mL灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管，或无菌微量吸管（micropipet）。 (三) 试管：大小约150 × 15 mm之试管或有盖螺旋试管。
(四) 发酵管（fermentation tube）：大小约22 × 9 mm之玻璃管。 (五) 稀释瓶：容量约100 mL可灭菌之硼硅玻璃制品。 (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。 (十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。 (十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在 160℃达2小时或170℃达1小时以上者。 (十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) p H计：精确度达 pH单位。 五、试剂 (一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在 25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 培养基，应使用市售商品化培养基。 １、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基（Lauryl sulfate tryptose broth，简称LST） 1倍浓度LST培养基含有下列成份：
艾滋病检测 包括筛查试验(含初筛和复检)和确证试验。HIV1/2抗体筛查方 法包括ELISA法、化学发光法或免疫荧光试验、快速检测(斑点ELISA和斑点免疫胶体金或胶体硒快速试验、明胶颗粒凝集试验、 免疫层析试验)等，确证试验常用的方法是免疫印迹法。 筛查试验呈阴性反应可出具HIV1/2抗体阴性报告，见于未被 HIV感染的个体，但处于窗口期的新近感染者筛查试验也可呈阴性 反应。若呈阳性反应，应用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂 家的试剂进行重复检测，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进 行重复检测，如两种试剂复测均呈阴性反应，则为HIV抗体阴性;如 有一种或两种试剂呈阳性反应，需进行HIV抗体确证试验。确证试 验无HIV特异性条带产生，报告HIV1/2抗体阴性。确证试验出现 HIV1/2抗体特异带，但不足以判定阳性，报告HIV1/2抗体不确定，可在4周后随访。如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性;如随 访期间发生带型进展，符合HIV抗体阳性判定标准则为HIV抗体阳性，如带型仍不满足阳性标准，继续随访到8周。如带型没有进展 或呈阴性反应则报告阴性;满足HIV阳性诊断标准则报告阳性，不满 足阳性标准可视情况决定是否继续随访。经确证试验HIV1/2抗体阳 性者，出具HIV1/2抗体阳性确认报告，并按规定做好咨询、保密和 报告工作。 抗原检测：主要检测HIV1的P24抗原核心蛋白。感染早期和晚期，P24抗原以游离形式出现，多数情况下以抗原抗体复合物形式 存在。P24一般在感染后1-2周内即可检出，随P24抗体产生而减少。一般持续0.5-5个月，如持续存在或再度出现则提示预后不良。 HIV感染人体后，出现CD4+T淋巴细胞进行性减少，CD4+/CD8+T 细胞比值倒置，细胞免疫功能受损。如果进行HAART，CD4+T淋巴细 胞在病程的不同阶段可有不同程度的增加。目前常用的CD4+T淋巴 细胞亚群检测方法为流式细胞术，可以直接获得CD4+T淋巴细胞数
大肠杆菌的检验方法 样品制备： 以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。 LST和EC初步筛选： 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于36±1℃培养48±2h。 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。 EMB平板： 取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。 生化试验： 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。 1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。 2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至 13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。 将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。 3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。 4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。 5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
HIV/AIDS艾滋病诊断是一个十分严肃的问题，任何诊断的错误结果无论是假阴性还是假阳性，对家庭和社会都会造成十分严重的后果。HIV检测是诊断HIV感染及艾滋病的重要实验室依据之一，要知道是否感染了HIV可以通过检测病毒的抗体、抗原、核酸或通过病毒培养来确定。常用于诊断HIV/AIDS的方法是HIV抗体检测，它是诊断HIV/AIDS的主要指标，也是世界卫生组织和我国卫生部推荐使用的HIV感染诊断方法。为了最大限度地保证诊断结果准确，HIV诊断采用特殊的检测策略，即先用敏感性高的初筛试剂进行初筛，如果阳性再用特异性强的确认试剂进行确认。检测HIV抗体常用的初筛方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、凝集试验和各种快速诊断方法，确认的方法有蛋白印迹法(WB)、放射免疫沉淀试验(RIP)、间接免疫荧光试验(IFA)等。一般先用ELISA做初筛试验;如果阳性，再用蛋白印迹法来确认。以下介绍一下较常用的HIV抗体测定的方法。 一．初筛试验方法 1．酶联免疫吸附试验（ELISA） 酶联免疫吸附试验简称酶标法，是最常用初筛检测方法，在HIV抗体的测定中有四种模式：间接法、双抗原夹心法、捕获法和竞争法，其中以间接法用的最多。 1）间接法：将HIV抗原纯化后固定于微孔板上，然后加入待测标本，清洗后加酶标记抗人免疫球蛋白（IgG），清洗后加入底物，产生有色反应即为阳性。（见图1） 2）双抗原夹心法：将HIV抗原固定于微孔板上,然后加入待测标本，清洗后加入酶标记的HIV抗原，清洗后加入底物，产生有色反应即为阳性。（见图2）
3）捕获法：将非特异性的兔抗人免疫球蛋白抗体固定于微孔板上，然后加入待测标本,清洗后加入酶标记的HIV抗原，清洗后加入底物，产生有色反应即为阳性。（见图3） 4）竞争法：：将HIV抗原固定于微孔板上,然后同时加入待测标本和一定数量的酶标HIV抗体，如果标本中有HIV抗体,即与加入的酶标HIV抗体竞争结合固定在微孔板上的抗原，标本中HIV抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体就愈少，清洗后加入底物。结果判断与间接法相反，产生有色反应即为阴性，无色反应的为阳性（见图4）
艾滋病检测方法有哪些如何检测艾滋病 一提起艾滋病，很多人都会避而远之，“谈艾色变”是很多人的第一反应。一些人怀疑自己感染了艾滋病，每天生活在恐惧与压力中，苦不堪言，这是人们对艾滋病相关知识缺乏了解所致。其实，艾滋病检测并不神秘，是一种非常普通与常见的检查。 艾滋病主要的检测方法： (一)抗体检测 主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光试验(IFA)。快速检测法，也称为金标法，也是抗体检测的一种方法，根据免疫层析法的原理，用于HIV抗体检测的定性检测。 (二)抗原检测 用ELISA检测P24抗原,在HIV感染早期尚未出现抗体时,血中就有该抗原存在.由于P24量太少,阳性率通常较低。现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原，来提高敏感性。 (三)核酸检测 用PCR法检测HIV基因，具有快速、高效、敏感和特异等优点，目前该法已被应用于HIV感染早期诊断及艾滋病的研究中。 (四)病毒分离 常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA刺激并培养后，加入病人单个核细胞诊断及艾滋病的研究中。 艾滋病常用的检测方法： (一)酶联法 即“酶联免疫法”，简称ELISA。它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。步骤其实很简单：ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清(这是有些网友不理解为什么医院抽完了血对血置之不理的原因，其实是误会)。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品(这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内)。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。严格的讲，如果第一次检测为阳性的话，无论是哪个实验室，必须按照CDC的HIV操作规程来进行第二次检测，第二次的方法必须与第一次的不同，如还是阳性，将送艾滋病确认实验室确认。 (二)快速法 即“金标法”，又叫“胶体金法”，金标法是国际上较为先进的灵敏，特异，快速，简便，准确率高的体外诊断方法。测定结果仅凭特制的检测试纸在短时间内即可获得。金标法(艾滋病检测试纸)，取血后滴在试纸上，用15分钟的时间观察该试纸有无颜色变化。 艾滋病快速检测法可以在家里自己检测，操作简单方便，不需要特殊的仪器，在艾滋病试纸上先滴两滴血，再滴一滴稀释液，然后等待15分钟读取结果。结果判读也很简单，如果试纸上出现一条红色的直线，说明是阴性，如果是两条红线，就是阳性。如果检测出现阳性，按照HIV检测流程，需要进行复测。 使用快速法(艾滋病试纸)进行艾滋病自我检测应该在专业人员指导下进行，以确保整个自测操作过程规范正确，结果准确可靠。 (三)蛋白免疫印迹法(WB) 艾滋病确诊实验室常用的方法，主要用于确认试验，当初筛出现阳性时，需采用此方法进行确认实验。基本原理是HIV全病毒抗原经过SDS?PAGE电泳,将分子量大小不等的蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100,再把它直接加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,
HIV抗体检测
第二章 HIV抗体检测 1 范围 本章规定了HIV抗体的检测方法、检测程序、检测报告及检测策略，适用于各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、检验检疫机构、采供血机构及卫生保健机构。可作为对HIV感染者/AIDS病人的诊断、报告和处理的实验室依据。 2 规范性引用文件 Revised recommendations for the selection and use of HIV antibody tests. WHO/UNAIDS Revised version 2001. 实验室生物安全通用要求（GB 19489-2004）。 3 HIV抗体检测实验室 应符合《全国艾滋病检测工作规范（1997年版）》中对检测实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。 应符合《实验室生物安全通用要求》（GB 19489-2004）对II级生物安全实验室（BSL-2）的
各项要求。 实验室的质量保证按本规范第八章规定执行。 实验室安全防护按本规范第七章规定执行。 4 HIV抗体检测的目的和要点 4.1 HIV抗体检测的目的 4.1.1 HIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。 4.1.2 以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。 4.1.3 以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV 感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。4.1.4 以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。 4.2 HIV抗体检测的要点 4.2.1 筛查试验阳性不能出阳性报告。 4.2.2 严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。 4.2.3 严格按照试剂盒说明书操作。 4.2.4 注意防止样品间交叉污染。
艾滋病病毒抗体快速检测技术手册
艾滋病病毒抗体 快速检测技术手册 （2011年版） 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心
前言 近年来，在党和政府的高度重视和领导下，各项艾滋病防治措施得到有效落实，艾滋病疫情快速上升的势头有所减缓， 病死率有所下降，艾滋病病毒感染者、病人的生活质量明显改 善，社会歧视有所减少。但我国艾滋病流行形势依然严峻，艾 滋病传播方式更加隐蔽，性传播已成为主要的传播途径，男男 性行为传播上升明显，许多感染者和病人尚未发现。2009年中 国艾滋病疫情估计有74万HIV感染者，但截至2010年底，通过网 络直报累计数只有38.6万人，还有近一半的感染者和病人没有被 发现。 为了尽早、尽快发现感染者，《国务院关于进一步加强艾 滋病防治工作的通知》（国发【2010】48号），明确提出要进 一步加强监测检测网络建设，依托现有医疗卫生资源，配备必 要的设备和人员，扩大检测服务范围，推广使用快速简便的检 测方法，提高检测可及性。组织各级各类医疗卫生机构主动开 展艾滋病病毒检测咨询。目前我国已经建成了较为完整的艾滋 病检测实验室网络，截止2010年底，全国共有318个艾滋病检测 确证实验室、10944个艾滋病检测筛查实验室，它们在艾滋病检 测过程中发挥着不可替代的主导作用。但我国地域辽阔，在一 些有检测需求、尚不具备条件建立实验室的单位，包括医疗机 构、农村乡（镇）卫生院、社区卫生服务中心和艾滋病自愿咨 询点等，需要建立快速检测点，以扩大检测覆盖面、发现更多 的感染者。为规范、有效地开展艾滋病病毒快速检测，在《全 国艾滋病检测技术规范（2009年版）》的基础上，国家参比实 验室对快速检测的使用进行了细化，在广泛征求专家和基层工 作人员意见的基础上，起草了《艾滋病病毒抗体快速检测技术 手册》，以下简称《手册》。
大肠杆菌的检测方法 一、大肠杆菌的生物学特性 大肠杆菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 二、培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。 在普通营养琼脂上有3中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株 三、大肠菌群及大肠杆菌测定——MPN法检验流程（FDA BAM）检样50g+450ml稀释液，适当十倍稀释样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL，如没有产气，则报告为阴性；如有产气，
则分别接种BGLB肉汤管（35 ±℃，48 ± 2h）和EC肉汤（44.5±0.5 ℃（水浴培养）24 ± 2h ~48 ± 2h ），对于接种BGLB肉汤管的查MPN表报告结果，验证是否为大肠菌群；对于接种EC肉汤的产气管接种EMB平板（35℃、18~24h）从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气查MPN表报告结果验证是否为大肠杆菌。
大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。 1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3 操作步骤 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL 灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。