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fusion细胞融合

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Induction of mammalian somatic cell hybridization by polyethylene glycol. Davidson, R.L.,
and Gerald, P.S. Methods Cell Biol. 15, 325-338, (1977)
Harlow, E., and Lane, D., ed. Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor, NY ,
(1998), 211-213
Merck 14,7568
一 准备饲养细胞
方法：
1 小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75%酒精中5分钟
2 剪开腹部皮肤，撕开并暴露腹部，注入约5ML无血清DMEM，（D-HANKS）
3 消毒腹部皮肤，手轻柔小鼠腹部1-2分钟
4 回抽腹腔液，1000r/m离心10分钟.
5 将细胞悬于HT中，每孔一滴分装于96孔板中。
二 细胞融合
实验步骤：
1 解剖小鼠分离脾细胞：
1） 解剖：
摘取眼球完全放血后拉颈处死，75％乙醇浸泡5分钟，常规解剖取脾（此时已经制备饲养
细胞）
2）收集脾细胞：
将脾放入无菌平皿，边拎起边加入3－4ml无血清DMEM清洗，然后将脾脏稍稍剪几下置
于扣在50ml离心管上的铜网上，滴加几滴无血清的DMEM浸湿脾脏，同时用玻璃芯轻轻
碾磨，再用无血清的DMEM冲洗将细胞过滤收集于离心管中。1000rpm/min离心10min并
弃上清悬入40ML无血清的DMEM计数。
2 收集SP2/0细胞
4瓶待融合的SP2/0细胞（6ml/每瓶）均长成致密的单层。SP2/0 透明，折光性好，大小
一致。轻摇细胞培养瓶，倒掉培养液，分别加入无血清的DMEM（含有双抗），吹打细胞，
1000rpm/min离心10min，收集细胞于离心管底部。再吸取30ml无血清DMEM培养液洗
一次，步骤同上。然后悬于无血清的DMEM中进行计数。
3 混合细胞
将脾细胞与SP2/0细胞混合在一起，1000rpm/min离心5min并弃上清。
4 细胞融合
1） 轻弹混合后的细胞使其松弛分散，并置于37℃水温的烧杯中。
2） 用1ml吸管加入0.8-0.9ml PEG（37℃预热），边加边搅动，加 PEG时1ML用移液器
管加，顶到底部搅拌，先慢后块，先轻后重，充分搅拌1min完成。
3） 继续搅拌1min，轻轻回抽于吸管内，静置45s。
4） 30秒内加入1ml无血清DMEM，边加边搅拌，搅起PEG，中止反应。
5） 继续于30秒内加入3ml无血清DMEM中止反应，然后于1min内加入11ML无血清
DMEM边加边搅动。
6） 补加足40ml无血清DMEM，边加边搅动，1000rpm/min离心5min，洗掉PEG，并弃
上清。
7） 用2ml融合细胞培养液HT轻轻将底部融合细胞吹起，并且用培养液定容到50ml。平
均分配到已经含有饲养细胞的96孔板中，100μl /孔。 （大约是5块板）
8） 融合第二天每孔一滴HAT，然后每天补液HAT一滴，隔两天进行半量换液。
补充：1.我用的PEG是
P7181
Sigma
Roche 10783641001
聚乙二醇 1500

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第四章细胞融合

第四章细胞融合


2、细胞融合的基本过程
（1）细胞在促融剂或正弦电场 作用下凝集，彼此靠近； （2）两个相邻细胞之间的质膜 相互融合，随后两个亲本细 胞质膜上的受体、糖蛋白、 糖脂等质膜成分也在融合后 的质膜上重新分布； （3）细胞质发生融合； （4）细胞核融合，形成单核融 合细胞。
动植物细胞的融合过程
植物细胞融合过程
生物种类细胞来源成功年代烟草两个种间苷蓝青菜大豆马唐草矮牵牛龙面花大麦花生大麦大豆小麦矮牵牛油菜大豆油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麦蚕豆大豆草香木犀酵母菌鸡大豆烟草大豆秋水仙人胡萝卜番茄马铃薯人小鼠叶叶叶根愈伤组织叶叶花瓣种子种子叶悬浮细胞叶花瓣叶悬浮细胞叶悬浮细胞叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶根悬浮细胞叶原生质体血红细胞悬浮细胞叶悬浮细胞叶腹水癌细胞原生质体叶根尖纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞1972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972几种细胞融合成功的例子植物融合细胞成长状态对比右瓶为地面融合的细胞左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞动物细胞融合实验使用的小白鼠白化豚鼠hartley豚鼠?4意义和应用?1可以避开生殖细胞的受精过程在亲缘关系较远甚至毫无亲缘关系的物种间实现基因转移创造出自然界中没有的新物种
（1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟；
（4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液；
（5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。
叶——叶 叶——根 愈伤组织——叶 叶——花瓣 种子——种子 叶——悬浮细胞 叶——花瓣 叶——悬浮细胞 叶——悬浮细胞 悬浮细胞——悬浮细胞 叶——根 悬浮细胞——叶 原生质体——血红细胞 悬浮细胞——叶 悬浮细胞——叶 腹水癌细胞——原生质体 叶——根尖 纤维肉瘤细胞——畸胎瘤细胞
鸡血细胞的体外融合

鸡血细胞的体外融合

鸡血细胞的体外融合【实验目的】1．掌握聚乙二醇（PEG ）诱导体外细胞融合的基本原理。

2．通过PEG 体外诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。

【实验原理】细胞融合(cell fusion ）又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞(hybrid cell ）。

细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。

显微镜下的细胞融合过程融合过程中两个细胞膜的变化过程依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：（1）病毒诱导的细胞融合，如：仙台病毒（hemagglutinating virus of Japan，HVJ）；（2）化学因子诱导的细胞融合，如：聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）；（3）电场诱导的细胞融合；（4）激光诱导的细胞融合。

PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子质量的多聚体。

PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。

该方法应用分子质量为400—6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。

融合的频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。

【方法与步骤】1. 鸡血细胞的获得：从家鸡的翼根静脉用注射器采血，注入试管后，迅速加入肝素（100U 肝素/ 5ml全血）混合，制成抗凝全血。

2. 鸡血细胞储备液的制备：在抗凝全血的试管中，加入4倍体积的0.85 %NaCl溶液，制成红细胞储备液，置于4℃冰箱内可供一周内使用。

3. 鸡血细胞悬液的制备：取鸡血细胞储备液1ml，加入4ml 0.85 %NaCl溶液，混匀后，1200rpm离心5min，弃去上清液，再加入5ml 0.85 %NaCl溶液按上述条件离心一次。

实验十一 鸡血细胞融合

实验十一 鸡血细胞融合

实验十一 鸡血细胞融合
1
实验目的
掌握细胞融合原理 应用聚乙二醇（PEG）融合细胞的方法 细胞融合率的计算。
2
实验用仪器及材料
实验仪器及材料
一、材料 鸡红细胞 二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、 刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片 三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)
3
实验原理
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理 的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人 工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于 它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融 合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。 细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的 重要手段。 细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)、电脉冲和激光诱导。 目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。 PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极 性基团发生结构重排。
6
数据记录
结果观察 在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜 融合在一起，形成一个异核体细胞。 融合的各个阶段：部分融合、全部融合 要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。 融合率的计算 在高倍镜下随机计数100个细胞(包括融合的与未融合的 细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞) 的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核) 即得出融合率。公式如下：
7Leabharlann 业在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融 合各阶段，并注明主要特点。 你测定的细胞融合率为多少?
PEG法诱导细胞融合

PEG法诱导细胞融合

实验十PEG法诱导细胞融合一、实验目的1.了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。

2.通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。

二、实验原理细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞（hybrid cell）。

细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。

依据融合过程采用的助融剂的不同，细胞融合可分为：①病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒(hemagglutinating virus of Japan,HVJ);②化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（polyethyleneglycol ,PEG）;③电场诱导的细胞融合；④激光诱导的细胞融合。

PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。

PEG可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，引起细胞融合。

该方法应用相对分子质量为400~6000的PEG溶液引起细胞的聚集和粘连，产生高频率的细胞融合。

融合的频率和活力与所用PEG分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。

三、实验仪器、材料和试剂（１）仪器、用具：注射器、刻度离心管、离心机、血细胞记数板、水浴锅、滴管、显微镜、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、酒精灯等。

（２）材料：成年家鸡。

（３）试剂1）0.85%NaCl溶液。

2）GKN液：8.0gNaCl，0.4g KCl,1.77 g Na2HPO4·2H2O，0.69 g NaH2PO4·H2O,2.0g葡萄糖,0.01g酚红,溶于1000ml重蒸水中。

3）50%（m/v）PEG溶液：①取50gPEG （相对分子量=4 000）放入100ml瓶中，高压灭菌20min.②让PEG 冷却至50-60℃，勿让其凝固。