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一．实验目的1.了解并掌握细胞融合的方法2.了解细胞融合技术及其在生命科学中所起的作用3.掌握化学融合法，了解电融合法及CRY-3细胞融合仪的使用二．实验原理两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。
诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。
1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。
病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。
PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。
3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。
主要过程包括：1.制备原生质体：微生物及植物细胞有坚硬的细胞壁，需要用酶将其降解，而动物细胞无需要去壁处理。
2.诱导细胞融合：两种亲本细胞的悬浮液调到一定密度，滴入高浓度的聚乙二醇（PEG）诱导融合，或用物理方法如电刺激促进融合。
3.筛选杂合细胞：在特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地生长，除去其他未融合的细胞。
细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。
单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。
三．实验结果与分析讨论融合细胞的观察实验中发现大部分的融合都是3个细胞的融合，两个相互融合的很少基本没有找到。
一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，探讨细胞融合的基本原理、方法及其应用。
通过实验，观察细胞融合过程中细胞的行为与变化，了解不同细胞类型融合的差异，以及细胞融合在生物技术领域的应用前景。
二、实验原理细胞融合是指两个或多个细胞通过质膜融合形成单个双核或多核细胞的现象。
细胞融合技术在生物技术、医学、生物工程等领域具有广泛的应用前景。
本实验采用聚乙二醇（PEG）作为细胞融合的诱导剂，通过改变细胞膜的通透性，使细胞发生融合。
三、实验材料与方法1. 实验材料（1）细胞：小鼠胚胎成纤维细胞、鸡红细胞、人骨髓间充质干细胞等。
（2）试剂：聚乙二醇（PEG）、Hanks液、生理盐水、双蒸水等。
（3）器材：显微镜、离心机、水浴箱、离心管、滴管、载玻片、盖玻片等。
2. 实验方法（1）细胞培养：将小鼠胚胎成纤维细胞、鸡红细胞、人骨髓间充质干细胞等细胞分别培养于DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中。
（2）细胞融合：将细胞以1×10^6个/mL的浓度接种于培养皿中，待细胞生长至约70%融合时，加入一定浓度的PEG溶液，使细胞发生融合。
（3）观察与检测：通过显微镜观察细胞融合情况，采用流式细胞仪检测融合细胞的DNA含量，分析细胞融合的效果。
四、实验结果1. 显微镜观察在显微镜下，观察到细胞融合现象明显，部分细胞出现双核或多核现象。
2. 流式细胞仪检测流式细胞仪检测结果显示，融合细胞的DNA含量与正常细胞相似，说明细胞融合成功。
五、讨论1. 细胞融合的基本原理细胞融合是细胞生物学领域的一个重要研究方向。
细胞融合的基本原理是：通过改变细胞膜的通透性，使细胞发生质膜融合，进而实现细胞内容物的相互交换。
本实验采用PEG作为细胞融合的诱导剂，其作用机理是改变细胞膜的通透性，使细胞内物质外泄，进而促进细胞融合。
2. 不同细胞类型融合的差异本实验观察到小鼠胚胎成纤维细胞、鸡红细胞、人骨髓间充质干细胞等细胞均能发生融合。
简述细胞融合的三种方法及其原理。
细胞融合是生物学研究中常见的技术手段，可以让不同细胞相互融合，产生新的细胞体系。
细胞融合有多种方法，其中比较常见的有三种：电穿孔法、聚合物法和化学法。
1. 电穿孔法
电穿孔法是一种通过电场刺激细胞膜使其短暂性通道的技术。
一个电场被施加在一个包含两种细胞的混合物上，这些细胞处于暂时开放的状态，此时它们可以聚集成一个共同的体系。
这种方法在体外胚胎发生的研究中被广泛使用，因为能够将精子和卵子结合在一起，形成合子。
2. 聚合物法
聚合物法通常被称为聚乙二醇融合法（PEG），PEG是一种高分子聚合物，将两种互不相容的细胞暴露在其下时可以使其互相融合。
这种方法通常被用于融合细胞膜不容易被电穿孔的情况下，比如人肝癌分裂后的肿瘤细胞。
PEG被认为是缓慢地溶解了细胞膜的存在，从而带来了细胞体中的融合。
3. 化学法
化学法将细胞膜表面使用特殊化学物质覆盖，从而形成一个融合机制。
这些成分
通常是两性离子基，如溴化锭离子（BR）和醋酸骨架体离子（ABT）是最常用的。
一旦细胞表面被包裹了这些化合物，它们会被带入一个电场环境并自行结合。
这种方法被广泛用于体外或体内制备混合细胞吸入无数的空气泡中，以用于非侵入性的支气管病变治疗。
以上三种方法是常用的细胞融合技术，尤其在生物学研究中，根据需要的实验目的选择不同的方法来获得合适的融合细胞。
细胞融合实验报告细胞融合是一项重要的生物学实验，通过将两个或更多不同种类的细胞融合在一起，可以产生具有新特性和功能的细胞。
这项实验被广泛应用于生物技术领域，如基因工程和医药研究。
本篇文章将介绍细胞融合实验的原理、方法以及实验结果的分析。
1. 实验原理细胞融合实验的原理基于细胞膜的特性。
细胞膜是一个由脂质双层组成的结构，它具有选择性通透性，可以控制物质的进出。
当两个细胞膜相接触并施加足够的压力时，膜上的脂质双层可以融合在一起，形成一个新的融合细胞。
融合细胞中的细胞质和细胞核会混合在一起，进而导致基因和特性的交流和融合。
2. 实验步骤细胞融合实验通常包括以下几个步骤：(1) 细胞培养：融合实验需要选择要融合的细胞类型。
这些细胞可以来自同一物种，也可以来自不同物种。
首先，我们需要将这些细胞分别培养在适宜的培养基中，使它们保持健康和繁殖能力。
(2) 细胞收集：当培养细胞达到一定数量时，我们可以用细胞消化酶将其从培养器中收集出来。
这些细胞将会成为细胞融合实验的实验材料。
(3) 细胞融合：细胞融合可以通过化学物质或电脉冲等方式实现。
化学物质可以使细胞膜变得亲和，从而促进融合。
电脉冲则可以在短时间内破坏细胞膜，使融合发生。
在实验中，我们可以选择适合的方法进行细胞融合。
(4) 融合细胞培养：融合细胞在培养基中继续培养。
这个过程中，我们可以观察和记录细胞的生长和分化状况。
(5) 实验结果分析：通过观察和比较融合细胞与原始细胞的差异，我们可以得出实验结果和结论。
3. 实验结果与讨论在细胞融合实验中，我们可以观察到融合细胞和原始细胞在形态、功能和特性上是否有区别。
例如，当我们融合两种草莓品种的细胞时，发现融合细胞中既有母本细胞的特性，又有父本细胞的特性。
这表明细胞融合可以导致基因和特性的交流和融合，进而产生具有新特性的细胞。
细胞融合还可以应用于医药研究领域。
通过将人类细胞融合在小鼠胚胎细胞中，科学家们可以研究人类疾病的发生机制，寻找新的治疗方法。
实验十一细胞融合【实验目的】掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。
【实验用品】一、材料鸡红细胞二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)【实验内容】一、原理细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。
人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。
由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。
细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。
目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。
PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。
二、方法(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。
(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。
放入37℃水浴中待用。
(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。
(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。
待PEG全部加入后静置1分钟左右。
此全部过程都要求在37℃水浴内进行。
细胞融合技术的应用与原理1. 介绍细胞融合技术细胞融合技术是一种将两个或多个细胞融合在一起形成一个新的细胞的技术。
通过融合不同种类的细胞，可以实现细胞互补或新的细胞功能的产生。
细胞融合技术在生物医学领域有着广泛的应用。
2. 细胞融合技术的原理细胞融合技术的原理是通过人为干预，使得两个或多个细胞融合在一起形成一个新的细胞。
这种融合通常涉及到细胞膜的融合，使得两个细胞的质膜融为一体。
而细胞融合的方式可以通过物理或化学方法实现。
2.1 物理融合法物理融合法是指利用物理手段促进细胞融合的方法。
常用的物理方法包括电融合、超声波融合、机械压力融合等。
这些物理方法可以通过破坏细胞膜及间质酶的作用，促进细胞融合的发生。
2.2 化学融合法化学融合法是指利用化学物质促进细胞融合的方法。
化学方法主要包括聚乙二醇融合、高铵盐融合等。
这些化学物质在一定的条件下可以改变细胞质膜的性质，使得细胞融合变得可能。
3. 细胞融合技术的应用细胞融合技术在生物医学领域有着广泛的应用，下面列举了几个常见的应用领域。
3.1 疾病研究细胞融合技术可以用于研究疾病的发病机制。
通过将正常细胞与病变细胞融合，可以模拟疾病的发展过程，并进一步研究疾病的关键因素和治疗方法。
3.2 细胞重编程细胞融合技术可以用于细胞重编程的研究。
通过将干细胞与其他类型的细胞融合，可以转化这些非干细胞为干细胞，并进一步应用于组织工程和再生医学领域。
3.3 抗肿瘤研究细胞融合技术可以用于抗肿瘤研究。
通过将癌细胞与免疫细胞融合，可以增强免疫细胞的抗肿瘤能力，并提高治疗效果。
3.4 物种转化细胞融合技术可以用于物种转化的研究。
通过将不同物种的细胞融合，可以创造出新的物种，探索生物进化和物种间的关系。
4. 细胞融合技术的前景与挑战细胞融合技术在生物医学领域具有广阔的前景，但同时也面临一些挑战。
4.1 生物伦理问题细胞融合技术涉及到对细胞生物学的深入理解和应用，同时也牵涉到生物伦理的问题。
细胞融合的原理与技术摘要：细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。
随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用中产生的影响将日益显著。
1.细胞融合原理细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术。
细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交( cellhybridization) 、原生质体融合(protoplast fusion)或体细胞杂交(somatic hybridization), 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程。
体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。
细胞融合大体分三个阶段进行。
第一阶段是制出细胞融合体。
首先要用氧把细胞分散开，再把细胞壁溶解掉，这时的细胞就成了原生质体。
原生质体用聚乙烯乙二醇(PEG)处理后，再把PEG洗掉，形成原生质体的结合。
第二阶段是融合子的鉴定。
利用利于融合子生存的培养基删选出已经融合的杂种细胞。
第三阶段是培养融合细胞阶段。
融合细胞在细菌培养基或是不含有细菌的液体培养基中进行培养，结合细胞反复分裂后，形成细胞团，把细胞团移植于含有植物激素的培养基里长出茎、叶，再把它们移植于土壤之中或嫁接于植物体上，继续生长形成新植物。
1.1动物细胞融合一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合,但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来作为促融物,并且以异种细胞作为融合对象。
1965年,英国Harris等报告灭活病毒可以用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以存活。
当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价,认为这是在细胞融合研究中的又一次突破。
他们的贡献在于证明了灭活的病毒可以作为一般方法用来在一定的条件下融合动物细胞,而且差异很大的动物种之间的细胞可以被诱导融合,融合的细胞可以存活。
1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。
1970年Ladda又进一步发展了去核的小鼠成纤维细胞进行融合实验,开始了各种细胞重组的研究工作。
从发现病毒能够诱导细胞融合之后,动物细胞融合的研究工作迅速发展起来。
然而,由于HVJ诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们一直试图发现一种替代物作介质诱导细胞融合。
1.2植物细胞融合植物细胞融合技术的发展可追溯到1937年,Mi-chel用0. 5 mol/L硝酸钠处理原生质体使之凝集、融合。
但那时还不能用酶法大量制备原生质体,使实验受到原生质体数量的限制,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。
直到1960年Cocking用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。
1972年美国科学家Carlson等将粉蓝烟草和郎氏烟草两个异种的体细胞融合成功。
20世纪70年代,细胞融合的研究范围又扩展到植物间、动物间、动植物间、甚至人体细胞与动植物细胞之间。
1.3微生物细胞融合1975年原生质体融合技术已扩展运用到微生物中,匈牙利的Ferenczy首先报道PEG促使真菌融合,以后的成功报道涉及酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间,使细胞融合技术继动、植物之后,在微生物中也形成了实验体系。
2.细胞融合技术细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。
细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。
细胞融合技术大体上可分为化学诱导融合、生物诱导融合和物理诱导融合三类。
2.1化学诱导融合2.1.1盐类融合法此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。
盐类融合剂对原生质体的破坏小。
今后研究应提高其融合率 ,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。
2.1.2高钙和高 pH值融合法Keller首先发现高 Ca2 +和高 pH值可以诱发融合。
Melchers用此法将烟草种内 2个光敏感突变体诱导融合成功并获得 100余株体细胞杂种。
提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。
2.1.3聚乙二醇融合法 ( PEG法)1974 年发现的高效融合剂聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体之间都可以融合，融合率可达30%。
聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。
PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。
为了发挥PEG 促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40%～50%，分子量为6000)，但PEG 在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。
因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。
影响原生质体融合的因素很多。
特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH 也对原生质体融合有较明显的影响。
一般来讲钙、镁离子有助于融合。
如有钙离子存在时，可得到较高的融合率。
但在缺乏钙离子时，若pH 较低，融合频率也较高。
这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。
PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。
虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较底及经验性大等缺陷。
2.2 物理诱导融合2.2.1 细胞电融合技术细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段，和细胞电注射构成一对互补技术。
在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿(Reverisb leb reakdown)，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。
当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导他们的膜相互融合，从而导致细胞融合。
细胞融合分为两步：第一步是建立细胞间接触(cell-to-cell contact) ；第二步，接受区膜结构受扰动而紊乱，然后恢复并融合。
根据其诱导细胞接触的性质，分为特异性和非特异性两大类。
非特异性细胞电融合法是指在进行细胞电融合时，无法排除亲本细胞的自体融合而只进行双亲本间的细胞杂交融合。
主要原因是细胞间的相互接触是无选择性的，是非特异性细胞聚集。
非特异性电融合技术包括细胞物理聚集电融合法和细胞化学聚集电融合法。
细胞融合所必需的两个步骤为：①细胞间接触；②接触区的膜结构受到瞬间扰动而导致融合。
只要其中的任意一步有特异性，就能形成特异性的细胞融合。
与使用PEG的化学法相比，电融合诱导法是一种非常高效的细胞融合方法。
电融合技术的优点在于：融合频率高，是PEG的100倍；操作简便、快速；对细胞无毒；可在镜下观察融合过程。
故这种方法得以在短期内被广泛采用，成为细胞融合的主要技术手段。
该方法的缺点是必须购置专用的细胞电融合设备。
2.2.2 激光诱导法激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动)，可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。
即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。
这样，由于质膜上微孔的可逆性，细胞开始变形融合，最终成为一个细胞。
使用此技术时，使细胞接触的方法可用①光俘虏法；②用低浓度的融合剂PEG (5% )使细胞聚法。
目前，最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触，即光镊(potical tweezers)利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间，在光斑直径与光波波长尺度相比拟时，指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力，该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处，从而实现对细胞的操作。
激光微束融合法与病毒法、PEG法、电融合法相比较，可选择任意两个细胞进行融合，易于实现特异性细胞融合，作用于细胞的应力小，定时、定位性强，损伤小，参数易于控制，操作方便，可利用监控器清晰地观察整个融合过程，实验重复性好，无菌，无毒性。
但它只能逐一处理细胞，不能像其他方法一样同时处理大量细胞。
而且由于其所需设备昂贵复杂，操作技术难度大，很难推广应用。
在微生物原生质体融合中应用激光微束技，融合效率较低且丧失了高度选择性的优点有赖后续步骤检出融合子激光诱导融合技术仍处在发展初期，还有待进一步完善。
2.3生物诱导融合(仙台病毒(HvJ)诱导法)1962年日本的冈田善雄(Okada)偶然发现了由日本血凝性病毒(HVJ)或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。
冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础。
细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重。
1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融合方面做了大量的工作，并进一步利用这种灭活病毒来诱导不同种动物细胞间的融合。
自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了灭活病毒促进动物异种细胞的融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技术跃上新的台阶。
但是，利用灭活的病毒诱导细胞融合，存在着许多问题，如病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低等。
目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室研究。
2.4新细胞融合技术2.4.1离子束细胞融合技术雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体，20世纪80 年代中期，中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在，建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系。
在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变，据此原理，发展了离子束诱导细胞融合技术。
由于用于辐照的离子束的参数除了能量可调外，离子种类、电荷、质量皆可调，因此，离子束的可操纵性高，可以用微束对细胞进行超微加工，有目的地切割染色体用于基因工程和细胞工程，通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。
此项研究一旦成功，将改变传统的一对一细胞融合的弊端，减少供体细胞导入的染色体范围，使融合更具目的性，大大减少筛选的工作量，将是细胞融合研究的一大进步。
